Name: 完全麻酔血友病Aマウスにおける尾静脈切除出血モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 学ぶ尾静脈切除出血モデルを用いた血友病Aマウスの止血療法評価法。出血時間と血液損失を指標に、鎮静下で再現性のあるデータを得る最適化手法を解説します。

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Esther BloemとThomas Nygaardは、血漿中のFVIIIの測定を支持して認められています。Bo Alstedは、テンプレートの描画と加工、およびブロックの切断で認められています。

この議定書に記載されているすべての手順は、Novo Nordisk A/Sの動物福祉機関、およびデンマーク食品農業水産省のデンマーク動物実験検査官によって承認されています。最適化された40分の方法には、麻酔と投与時間が設計に含まれています(図1)。この手順には、10〜16週齢の両性の血友病マウスが必要である。
1. 学習前の準備
<ol><li>正しい濃度で投薬溶液を調製する。</li>
	<li>ウォーターバスを開始し、37°Cに加熱する。 採血用の15 mL遠沈管に生理食塩水(0.9% NaCl)を充填します。</li>
	<li>実験開始の少なくとも15分前に、加温したベースプレートの穴に15mL生理食塩水チューブを置く。</li>
	<li>マウスを特定し、その体重を記録します。マウスを必要以上に扱うことは、ストレスを引き起こし、研究に影響を与える可能性があるため、避けてください。</li>
	<li>ナプキン、テールホルダー、ガーゼ、注射器、メス、ストップウォッチ、血流表記用紙など、すべてが手の届くところにあるように、ヒュームフードにワークステーションを準備してください。</li>
	<li>テールマークと切断ブロックを加熱プレートに置きます - 冷たいブロックは静脈を収縮させ、それによって出血に影響を与えます。</li>
</ol>2.麻酔
<ol><li>ヒュームフード内でイソフルラン麻酔処置を行う。</li>
	<li>ガス気化器を、1 L/分の流量で麻酔チャンバ内の30%O2/70%N2O中の最初に5%イソフルランに設定する。麻酔チャンバが充填されるのに十分な時間(チャンバの容積とガス流量に応じて約5分)を待ちます。迅速な誘導(1分未満)を確保します。</li>
	<li>マウスを意識を失うまで麻酔室に入れる。 注:これは、チャンバーが十分に満たされている場合、1分以内に発生します。</li>
	<li>ペダル反射(しっかりしたつま先のピンチ)に対する痛みを伴う反応がないことによって、適切な麻酔を確実にする。</li>
	<li>マウスを加熱プレートの上に置き、鼻が鼻錐形にあることを確認します。</li>
	<li>麻酔を30%O2/70%N2O中の2%イソフルランの維持レベルまで下げ、マウスの上にプラスチックカバーを置いて熱の損失を減らす。麻酔下での乾燥を防ぐために、適切な眼軟膏を塗布する。</li>
	<li>テールマークブロックを使用して、直径2.5mmのテールにマークを付けます。尾部をブロック内のスリットに無理に押し込まないでください - ぴったりとフィットする必要があります(補足図1)</li>
	<li>尾部を生理食塩水チューブに少なくとも5分間入れて、静脈内投与に最適な暖かい尾静脈を確保します。</li>
</ol>3. 試験液の投与
<ol><li>マウス1匹をテールホルダーに入れ、鼻を麻酔マスクに入れます。</li>
	<li>動物に目的の化合物(この場合はrFVIII)を投与し、直ちにストップウォッチを開始します(t = 0)。</li>
	<li>マウスを加熱プレートに戻し、尾を生理食塩水チューブに入れます。他のマウスでこの手順を繰り返します。</li>
</ol>4. 尾静脈切除術の実施
<ol><li>投薬後正確に5分で尾静脈切除を行う。切断ブロックに尾部を置き、90°回転させて静脈を露出させます(補足図2)。</li>
	<li>試験液を投与した場所とは反対側/静脈に切断を行います。</li>
	<li>#11メスの刃を尾を保持する切断ブロックのスリットに通して出血を作り出します。ストップウォッチをリセットし、すぐに尾を生理食塩水に戻します。</li>
</ol>5. 観測時間と課題
<ol><li>出血を観察し、40分を通して出血の開始と停止に注釈を付けます。血流表記用紙に注釈を付けます。 注:出血のこの視覚的評価は、主観性のためにわずかに異なる場合があります。</li>
	<li>一次出血は、切断が行われた後3分以内に停止しなければならない。そうでない場合は、マウスを失格にし、安楽死させ、交換する(一次出血を止められないと、vWF KOマウスのように、重篤すぎる傷害または原発性止血の欠如を示す可能性がある)。</li>
	<li>負傷後10分、20分、および30分で出血がない場合は、手順4〜5で説明したようにテールカットに挑戦してください。</li>
	<li>水浴に保管された別のチューブから暖かい生理食塩水に浸したガーゼ綿棒を使用してください。尾を生理食塩水から持ち上げ、濡れたガーゼで尾の切り傷の遠位方向に2回軽く拭きます。</li>
	<li>各チャレンジの後、すぐに尾を再び生理食塩水管に再沈めてください。</li>
	<li>t=40分で、生理食塩水チューブから尾を抜いて採血を停止します。</li>
</ol>6. 採血
<ol><li>t=40分後、眼窩上静脈から血液サンプルを得る。</li>
</ol>7. 安楽死
<ol><li>完全な麻酔下にある間に子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。</li>
</ol>8. サンプルの処理
<ol><li>15 mL採血管を生理食塩水で4000 x g で室温で5分間遠心分離する。</li>
	<li>15 mLチューブから上清を捨て、ペレットを2〜14 mLの赤血球(RBC)溶解溶液に再懸濁し、明るいコーヒー色に達するまで希釈する。</li>
	<li>なお、全体積(血液の体積+チューブ上の目盛りマークを用いて添加した赤血球(RBC)溶解液の体積)。</li>
	<li>希釈液2mLをヘモグロビンチューブに移し、ヘモグロビン分析が終わるまで冷蔵する。</li>
	<li>生理食塩水中のヘモグロビン濃度を測定することによって失血を決定する。マイクロプレートリーダー(材料表)上で550nmにおける吸光度を測定する。</li>
	<li>ヒトヘモグロビンから調製した標準曲線(材料表)を用いて吸光度をnmolヘモグロビンに変換し、RBC溶解溶液による希釈を補正する。</li>
</ol>9. 統計分析
<ol><li>適切なソフトウェアを使用してデータを分析します。ここでは、GraphPad Prismソフトウェアが使用されました。一連の研究にわたって、以下の統計的方法が良好に機能することが判明した。 注:失血を分析するために, 出血時間, 暴露, 血小板数, とヘマトクリット;Brown-Forsythe検定とウェルチ分散分析を使用して、(データは連続的であったが残差の分散均質性はなかったため)、多重比較のために調整するためにダネット検定を適用した。ピアソンの検定は、出血時間、失血、および用量の間の相関関係を試験するために使用された。ED50 値を決定するために、4パラメータの逆対数(用量)応答式を出血および失血データに当てはめました。性別効果を分析するために、二元配置分散分析検定を使用し、ボンフェローニ補正を適用して多重比較を調整しました。有意水準はP<0.05と定義した。データはSEMの手段として表示±ます。</li>
</ol>

著者らは、この研究が実施された時点でNovo Nordisk A/Sの従業員および/または株主であったか、または株主であった。

尾静脈切断(TVT)のこの最適化された方法は、TVT生存法と比較していくつかの利点を有する。動物は研究期間全体にわたって完全に麻酔をかけられるため、マウスの取り扱いが容易になり、動物の健康が向上します。さらに、TVT生存モデルとは異なり、一晩の観察は必要なく、この最適化されたモデルは、失血を測定し、40分にわたって正確な出血時間を観察する可能性を提供する。また、意識のある動物における出血のより長い期間は、放血によって死を引き起こし、動物の痛みおよび苦痛およびおそらくストレスをもたらし、潜在的に変動の増加をもたらす14。失血と出血時間は、エンドポイントとしてうまく特徴付けられ、検証され、死または臨死までの時間を置き換えています。実際の尾部損傷は、TVTを実行するために切断ブロックガイドを使用し、再現可能な切断を確保し、手順の難しさと技術的変動性を低減するため、明確に定義され標準化されています。したがって、より高いモデルの堅牢性を達成し、必要な動物の数を減らすことができます。さらに、データは、3Rの原則に従って、雄および雌マウスの両方を使用することが可能であり、したがって繁殖する動物の総数を減...

動物モデルは、血友病の病因を理解し、治療レジメンおよび治療法を開発および試験するために不可欠である。第VIII因子ノックアウトマウス(F8-KO)は、血友病A 1,2の研究に広く使用されているモデルである。これらのマウスは、疾患の主要な特徴を再現し、組換えFVIII産物3、4、5および遺伝子治療戦略6、7などの治療法の開発に広く使用されている。
インビボで異なる止血化合物の薬理学的効果を評価するための様々な出血傷害モデルがある。これらの凝固モデルの1つは、マウス8、9、10、11、12、13、14における尾静脈切除生存モデルであり、尾部離反後に放血を生き延びる血友病マウスの能力を測定する。この方法は40年以上前に導入され15、現在も9,16,17で使用されています。しかし、このモデルは生存をエンドポイントとして利用し、動物が意識的であり、したがって痛みや苦痛を経験することができる最大24時間にわたって動物の観察を必要とする。
テールクリップモデル(テールチップとしても知られている)8、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28など、より短い持続時間および完全麻酔下の出血モデルは、以前に説明されている.それにもかかわらず、出血チャレンジ後の失血の完全な正常化のためには、これらのモデルは、臨床的に投与されたものよりもはるかに高い用量の凝固促進化合物(例えば、FVIII)を必要とする29。麻酔下での別の傷害モデルである大静脈サフェナ出血法は、低用量の凝固促進剤化合物30に感受性であるが、血餅を頻繁に破壊しなければならないため(提示されたモデルでは3回とは対照的に)、高レベルの実験者の介入が必要である。
新しい凝固促進剤化合物を試験するための共通プロトコールに向けた標準化は、実験室間のデータ比較を大いに容易にするであろう31、32、33。TVTモデルでは、研究されたエンドポイント(失血7,26、出血時間9,34、生存率35,36)に関する共通の合意はまだなく、実験の長さは研究間で異なる13。
私たちの主な目的は、高い再現性、オンデマンドおよび予防的治療の研究の可能性、生存モデルと同等の薬理学的介入に対する感受性、それでも死亡または臨死をエンドポイントとして使用しない最適化されたモデルを記述し、特徴付けることです。痛みや苦痛を軽減するために、動物は出血中に意識を持つべきではなく、より倫理的なエンドポイントを実装する必要があります37。
テールクリップモデルは、一般に、尾の先端を切断するか、例えば、1〜5mmの切断、例えば、1〜5mmの切断、1〜5mmの切断、1〜3mmの切断、またはより重篤な変形では、尾の直径約1〜3mmの8,22,25でトランセクトする2つの変形のいずれかで実施される。.これは、側静脈および背静脈および腹側動脈が通常切断されるため、複合動静脈出血を引き起こし、一般に、切断が大きいほど、凝固促進剤化合物に対する感受性を低下させる。さらに、尾先が切断されるので、動静脈損傷は、任意の反対の組織なしで露出する。したがって、少なくとも理論的には、最も一般的な血友病出血とは異なっている。
名前が示すように、この論文に記載されているような尾静脈切断モデルでは静脈のみが損傷し、したがって排他的に静脈出血をもたらす。血管は完全に切断されていないため、損傷は切断モデルよりも小さいと予想され、血餅が付着する可能性のある切断の周囲の組織は保持される。さらに、動脈とは対照的に静脈の血圧が低い。これらの因子は、切断モデルに対する感受性の増加に寄与し、その結果、臨床的に関連する用量の補充療法、例えば血友病AにおけるrFVIIIを用いて出血の正常化を達成することができ、これは凝固促進剤治療の効果の大きさおよび持続性を評価するのに有用である26,38,39。

<table><tbody><tr><td>#11メスの刃</td><td>Swann-Morton</td><td>503</td><td></td></tr><tr><td>15 mL遠心分離管</td><td>Greiner Bio-One、オーストリア</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>300 G針を300 &microに接続。L 精密(インスリン)シリンジ</td><td>BD Micro-Fine + U-100 インスリンシリンジ</td><td>320830</td><td></td></tr><tr>アド<td>ベート</td><td>武田薬</td><td></td>品 日本 <td>組換え第VIII因子補充療法 (rFVIII)</td></tr><tr><td>アルコールパッド 70% エタノール</td><td>Hartmann, Soft-Zellin</td><td>999 979</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カッティングテンプレート (ステンレス鋼)</td><td>自己生産、あなたは正確な図面</td><td></td>の著者に連絡することを歓迎されています<td>補足図2:サイズ仕様:20ミリメートル×40ミリメートル×10ミリメートル(L x B x H)。溝:深さ3mm、幅3mm。半径1.5mm</td></tr><tr><td>赤血球(RBC)溶解液</td><td>Lysebio, ABX Diagnostics</td><td>906012</td><td></td></tr><tr><td>ガーゼ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>血液分析装置</td><td>シスメックス</td><td>CT-2000iv</td><td></td></tr><tr><td>スタンド上ヒーティングランプ</td><td>フィリップス</td><td>IR250</td><td></td></tr><tr><td>サーモスタット付ヒーティングパッド</td><td>CMA</td><td>モデル150</td><td></td></tr><tr><td>ヘモグロビンの基準と制御 - 8.81 mmol / lバッチ依存</td><td>HemoCue、デンマーク</td><td>HemoCueキャリブレーター、707037</td><td>標準とコントロールは、HemoCueキャリブレーターの2つの異なるガラスから作られています。この値は、ヘモグロビンの国際参照法 (ICSH) に対して決定されます。</td></tr><tr><td>チューブ、マスク、誘導ボックスを備えたイソフルオラン麻酔システム</td><td>シグマ デルタ ダメカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>バクスター</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>ライト付き拡大鏡</td><td>エッシェンバッハ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>測定テンプレート (アルミニウム)</td><td>自己生産、正確な図面</td><td></td><td>については著者に連絡することを歓迎します補足図1:サイズ仕様:20 mm x 40 mm x 10 mm(L x B x H)。溝:深さ2.5mm、幅2.5mm。半径 1.25 mm</td></tr><tr><td>マイクロピペット + チップ</td><td>フィンピペット</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光度計</td><td>Molecular Devices Corporation, CA, USA</td><td>SpectraMax 340 photometer</td><td></td></tr><tr><td>Prism Software</td><td>GraphPad, San Diego, CA, USA</td><td>バージョン 9.0.1</td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水 0.9% NaCl</td><td>Fresenius Kabi, Sweden</td><td>883264</td><td></td></tr><tr><td>TVTテールカット</td><td></td><td>用特殊テールマーカーブロック</td><td></td></tr><tr><td>テールホルダー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空液体吸引</td><td>Vacusafe comfort、IBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス、サーモスタット</td><td>TYP 3/8 Julabo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

完全麻酔血友病aマウスにおける尾静脈切除出血モデル

Tail Vein Transection Bleeding Model in Fully Anesthetized Hemophilia A Mice

尾出血モデルは、血友病研究、特に凝固促進効果の評価において重要なツールである。尾静脈切断(TVT)生存モデルは、臨床的に関連する用量のFVIIIに対する感受性のために多くの設定で好まれてきたが、テールクリップモデルなどの他の確立されたモデルは、より高いレベルの凝固促進化合物を必要とする。生存をエンドポイントとして使用しないようにするために、我々は失血と出血時間をエンドポイントとして確立し、実験全体を通して完全な麻酔を確立するTVTモデルを開発しました。簡単に説明すると、麻酔をかけたマウスは、尾部を温食塩水(37°C)に沈めて位置決めし、右側尾静脈に試験化合物を投与する。5分後、テンプレートガイドを使用して左側尾静脈をトランスセクトし、尾を生理食塩水に戻し、血液を採取しながらすべての出血エピソードを40分間監視および記録する。傷害後10分、20分、または30分で出血が起こらない場合、湿ったガーゼ綿棒で切り傷を2回拭くことによって血餅に優しく挑戦する。40分後、失血は生理食塩水に採血されたヘモグロビンの量によって定量化される。この迅速かつ比較的簡単な手順は、一貫性のある再現性のある出血をもたらす。TVT生存モデルと比較して、薬理学的介入に対する感受性を損なうことなく、より人道的な手順を使用する。さらに、3Rの原則に従って、繁殖する必要がある動物の総数を減らして、両方の性別を使用することが可能です。出血モデルにおける潜在的な制限は、止血の確率的性質であり、モデルの再現性を低下させる可能性がある。これに対抗するために、手動血餅破壊は、モニタリング中に血餅が挑戦されることを保証し、原発性(血小板)止血が出血を止めるのを防ぎます。出血傷害モデルのカタログへのこの追加は、標準化された人道的な方法で凝固促進効果を特徴付けるオプションを提供する。

最適化されたモデルの適用性を評価するために、市販の組換え第VIII因子補充療法(rFVIII)を投与したF8−KO(C57BL遺伝的背景)マウスにおいて研究を実施した。1IU/kg、5IU/kg、10IU/kg、および20IU/kgの4つの異なる用量が試験された。さらに、陽性対照群としてC57BLマウスを用いたF8-KOマウスおよび野生型(WT)群における対応するビヒクル(陰性)対照を試験し、モデルにおける応答範囲を評価した。
最適化されたプロトコールに従って、ビヒクル群と比較してrFVIII処置群について失血の有意な減少があった。さらに、ビヒクル群と比較して、5IU/kg、10IU/kg、および20IU/kgの治療群で出血時間の減少が観察された(図2)。WTマウスでは、全失血は201.8〜841.9nmolのHgb(95%CI)の範囲であり、ビヒクルマウスでは5335〜7148nmolのHgb(95%CI)の範囲であった。全血の1000 nmolのHgb~125 μLのおおよその等価性に続いて、ビヒクル処理マウスの平均出血は780.25 μLであ...

麻酔をかけたマウスにおける精製尾静脈切除(TVT)出血モデルは、血友病出血の評価のための敏感な in vivo 法である。この最適化されたTVT出血モデルは、失血と出血時間をエンドポイントとして使用し、他のモデルを改良し、死亡をエンドポイントとして回避します。

完全麻酔血友病Aマウスにおける尾静脈切除出血モデル

Tail bleeding models are important tools in hemophilia research, specifically for the assessment of procoagulant effects. The tail vein transection (TVT) ...

尾部出血モデルは、実験間の再現性を確保するために、インビボで止血化合物の薬理学的効果を評価するための重要なツールとなり得る。他の敏感な出血モデルと比較して、我々のモデルは生存の代わりにエンドポイントとして失血と出血時間を使用する。また、モデルは麻酔下で行われ、したがって動物の痛みや苦痛を軽減します。この技術は、血液が凝固し、傷害後に出血を止める能力を測定するので、血友病および他の凝固障害の前臨床試験に特に有用である。我々は、このモデルを広範囲に使用し、血友病Aマウスを用いた新規血友病治療法の開発において、凝固促進性化合物を試験してきた。しかしながら、他の血友病性マウス系統、または抗第VIII因子抗体を用いて血友病が誘導されたマウスも使用され得る。実験のデモンストレーションは、私の研究室の専門技術者であるサラとデニスです。マウスを麻酔した後、加熱プレートの上に置き、鼻が鼻錐形にあることを確認します。麻酔下での乾燥を防ぐために、適切な眼軟膏を塗布する。テールマークブロックを使用して直径2.5ミリメートルのテールにマークを付け、テールをスリットに押し込まないように注意し、ぴったりとフィットするようにします。その後、尾部を生理食塩水チューブに少なくとも5分間入れて、静脈内投与に最適な暖かい尾静脈を確保します。必要に応じて、IV投与は5分後に行うことができる。次に、熱損失を減らすために、マウスの上にプラスチックカバーを置きます。試験液投与後、尾部を5分間沈めたままにし、尾部を切断ブロックに入れ、90度回して静脈を露出させることにより尾静脈切除を行う。試験溶液を投与した場所とは反対側に切り込みを入れる。切断ブロックのスリットに11番のメスの刃を引き、尾を持ち、出血を作り出します。その後、すぐに尾を生理食塩水に戻し、ストップウォッチをリセットします。出血はすぐに見えるはずです。尾を生理食塩水に浸すことは、自由空気中ですぐに止まるので、一貫した出血のために重要です。出血を観察し、血流表記用紙に40分間を通して出血の開始と停止に注釈を付けます。切開後3分以内に原発出血が止まらない場合、切開が深すぎるか、マウスが原発止血不全であることを示している可能性がある場合は、マウスを失格にして交換してください。出血がなければ、怪我の10分、20分、30分後にテールカットに挑戦してください。ガーゼ綿棒で温めの生理食塩水を入れ、尾を生理食塩水から持ち上げ、濡れたガーゼで尾切りの上で遠位方向に2回軽く、しかししっかりと拭きます。各チャレンジの後、すぐに尾を生理食塩水チューブに再沈めます。実験が終了したら、尾を生理食塩水から取り出し、必要に応じて血液サンプルを収集し、完全な麻酔下でマウスを安楽死させます。15ミリリットルの採血管を生理食塩水で4,000倍Gで室温で5分間遠心分離する。チューブから上清を捨てる。ペレットを2ミリリットルの赤血球溶解溶液に再懸濁する。その後、明るいコーヒー色になるまで、最大12ミリリットルの溶解溶液で希釈します。全量に注意し、2ミリリットルの希釈液をヘモグロビンチューブに移す。ヘモグロビン分析ができるまで冷蔵保存してください。組換え凝固第VIII因子治療群の失血の有意な減少は、最適化されたプロトコールを用いて観察された。1キログラム当たり20国際単位の用量は出血を完全に正常化し、1キログラム当たり10IUは有意な効果を引き起こし、失血を野生型の範囲の上限までほぼ減少させた。出血時間についても同様の結果が観察された。1キログラム群あたり5、10、および20IUの減少が観察され、キログラム群あたり20IUで完全に正規化されている。野生型マウスでは、全失血は200〜840ナノモルのヘモグロビンの範囲であり、ビヒクルマウスでは、5,300〜7,100ナノモルのヘモグロビンであった。平均出血は、ビヒクル処理マウスでは5、200ナノモル、およびキログラム群当たり20IUでは720ナノモルであった。野生型マウスの出血時間は1〜9分の範囲であり、1kgあたり10および20IUの用量レベルは出血時間をこの範囲内に短縮した。失血と出血時間との間に強い相関関係が結合データで観察された。記録されたすべての出血エピソードは、個々のマウスについて経験した出血の長さおよび数の視覚化を提供するためにプロットされた。なお、車群では、第2のチャレンジ後、ほとんどの動物が実験終了まで出血を続けている。血漿中第VIII因子濃度の測定は、失血及び出血時間の低減に効果が認められることが確認され、組換えVIII因子濃度依存性であった。血小板数は目立った影響を受けず、ヘマトクリットレベルは、中等度およびより高い組換え第VIII因子用量を受けた動物では正常範囲内であったが、ビヒクルおよびkg群あたり1IUなど、広範囲に出血した動物では有意に低かった。大量の出血を経験している動物では、血球数、特に総ヘモグロビンまたはヘマトクリットへの影響が軽微であり得る。この最適化されたモデルにおける性別の効果を評価するために、失血および出血時間の結果の両方を、性別および用量を因子として、二元配置分散分析を行った。これらの結果は、治療に対する反応が男女間で異ならないことを示した。尾の正しいマーキングとカットの作成は、出血がない場合の課題と同様に、技術の信頼性と再現性を確保するために不可欠なステップです。さらに、良好な麻酔誘導および動物の体温の維持が特に関連している。我々はまた、出血を誘発してから10分後に第VIIA因子で治療することによって、よりオンデマンドのような設定で確立された出血の停止を調査するためにこのモデルを使用した。

tail-vein-transection-bleeding-model-fully-anesthetized-hemophilia

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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