完全麻酔血友病Aマウスにおける尾静脈切除出血モデル

尾部出血モデルは、実験間の再現性を確保するために、インビボで止血化合物の薬理学的効果を評価するための重要なツールとなり得る。他の敏感な出血モデルと比較して、我々のモデルは生存の代わりにエンドポイントとして失血と出血時間を使用する。また、モデルは麻酔下で行われ、したがって動物の痛みや苦痛を軽減します。

この技術は、血液が凝固し、傷害後に出血を止める能力を測定するので、血友病および他の凝固障害の前臨床試験に特に有用である。我々は、このモデルを広範囲に使用し、血友病Aマウスを用いた新規血友病治療法の開発において、凝固促進性化合物を試験してきた。しかしながら、他の血友病性マウス系統、または抗第VIII因子抗体を用いて血友病が誘導されたマウスも使用され得る。

実験のデモンストレーションは、私の研究室の専門技術者であるサラとデニスです。マウスを麻酔した後、加熱プレートの上に置き、鼻が鼻錐形にあることを確認します。麻酔下での乾燥を防ぐために、適切な眼軟膏を塗布する。

テールマークブロックを使用して直径2.5ミリメートルのテールにマークを付け、テールをスリットに押し込まないように注意し、ぴったりとフィットするようにします。その後、尾部を生理食塩水チューブに少なくとも5分間入れて、静脈内投与に最適な暖かい尾静脈を確保します。必要に応じて、IV投与は5分後に行うことができる。

次に、熱損失を減らすために、マウスの上にプラスチックカバーを置きます。試験液投与後、尾部を5分間沈めたままにし、尾部を切断ブロックに入れ、90度回して静脈を露出させることにより尾静脈切除を行う。試験溶液を投与した場所とは反対側に切り込みを入れる。

切断ブロックのスリットに11番のメスの刃を引き、尾を持ち、出血を作り出します。その後、すぐに尾を生理食塩水に戻し、ストップウォッチをリセットします。出血はすぐに見えるはずです。

尾を生理食塩水に浸すことは、自由空気中ですぐに止まるので、一貫した出血のために重要です。出血を観察し、血流表記用紙に40分間を通して出血の開始と停止に注釈を付けます。切開後3分以内に原発出血が止まらない場合、切開が深すぎるか、マウスが原発止血不全であることを示している可能性がある場合は、マウスを失格にして交換してください。

出血がなければ、怪我の10分、20分、30分後にテールカットに挑戦してください。ガーゼ綿棒で温めの生理食塩水を入れ、尾を生理食塩水から持ち上げ、濡れたガーゼで尾切りの上で遠位方向に2回軽く、しかししっかりと拭きます。各チャレンジの後、すぐに尾を生理食塩水チューブに再沈めます。

実験が終了したら、尾を生理食塩水から取り出し、必要に応じて血液サンプルを収集し、完全な麻酔下でマウスを安楽死させます。15ミリリットルの採血管を生理食塩水で4,000倍Gで室温で5分間遠心分離する。チューブから上清を捨てる。

ペレットを2ミリリットルの赤血球溶解溶液に再懸濁する。その後、明るいコーヒー色になるまで、最大12ミリリットルの溶解溶液で希釈します。全量に注意し、2ミリリットルの希釈液をヘモグロビンチューブに移す。

ヘモグロビン分析ができるまで冷蔵保存してください。組換え凝固第VIII因子治療群の失血の有意な減少は、最適化されたプロトコールを用いて観察された。1キログラム当たり20国際単位の用量は出血を完全に正常化し、1キログラム当たり10IUは有意な効果を引き起こし、失血を野生型の範囲の上限までほぼ減少させた。

出血時間についても同様の結果が観察された。1キログラム群あたり5、10、および20IUの減少が観察され、キログラム群あたり20IUで完全に正規化されている。野生型マウスでは、全失血は200〜840ナノモルのヘモグロビンの範囲であり、ビヒクルマウスでは、5,300〜7,100ナノモルのヘモグロビンであった。

平均出血は、ビヒクル処理マウスでは5、200ナノモル、およびキログラム群当たり20IUでは720ナノモルであった。野生型マウスの出血時間は1〜9分の範囲であり、1kgあたり10および20IUの用量レベルは出血時間をこの範囲内に短縮した。失血と出血時間との間に強い相関関係が結合データで観察された。

記録されたすべての出血エピソードは、個々のマウスについて経験した出血の長さおよび数の視覚化を提供するためにプロットされた。なお、車群では、第2のチャレンジ後、ほとんどの動物が実験終了まで出血を続けている。血漿中第VIII因子濃度の測定は、失血及び出血時間の低減に効果が認められることが確認され、組換えVIII因子濃度依存性であった。

血小板数は目立った影響を受けず、ヘマトクリットレベルは、中等度およびより高い組換え第VIII因子用量を受けた動物では正常範囲内であったが、ビヒクルおよびkg群あたり1IUなど、広範囲に出血した動物では有意に低かった。大量の出血を経験している動物では、血球数、特に総ヘモグロビンまたはヘマトクリットへの影響が軽微であり得る。この最適化されたモデルにおける性別の効果を評価するために、失血および出血時間の結果の両方を、性別および用量を因子として、二元配置分散分析を行った。

これらの結果は、治療に対する反応が男女間で異ならないことを示した。尾の正しいマーキングとカットの作成は、出血がない場合の課題と同様に、技術の信頼性と再現性を確保するために不可欠なステップです。さらに、良好な麻酔誘導および動物の体温の維持が特に関連している。

我々はまた、出血を誘発してから10分後に第VIIA因子で治療することによって、よりオンデマンドのような設定で確立された出血の停止を調査するためにこのモデルを使用した。