Name: 生細胞におけるタンパク質相互作用とタンパク質ダイナミクスを研究するための二色蛍光相互相関分光法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 12 s
Description: 学ぶ二色蛍光相互相関分光法とFRETを組み合わせた生細胞膜受容体ダイナミクス解析プロトコル。CHO細胞を用いてGタンパク質共役受容体の相互作用と拡散動態を定量的に評価する手法です。

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このプロジェクトは、ドイツ・フォルシュングスゲミンシャフト(SFB/TR 240、プロジェクト番号374031971、プロジェクトINF)によってJ.BとK.G.Hに支援されました。
ルドルフ・ビルチョウ・センターの財政支援とコアユニット蛍光イメージングに対し、技術サポートに感謝します。さらに、アシュウィン・バラクリシュナンの徹底的な校正に感謝します。

1. 実験プロトコル
<ol><li>サンプル準備 注:無菌条件下で細胞の播種とトランスフェクションを行います。<ol>
<li>洗浄されたカバースリップを6ウェル培養プレートに入れ、滅菌リン酸緩衝生理食塩分(PBS)で3回洗浄します。 注: カバースリップクリーニングプロトコルについては、 補足ノート 1を参照してください。</li>
		<li>フェノールレッドを含む完全な細胞培養培地2mL(10%ウシ胎児血清(FBS)、100μg/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン)を加え、プレートを脇に置きます。</li>
		<li>CHO細胞を37°C及び5%CO2でフェノールレッドを含む同一培地で培養する。 5 mLのPBSで細胞を洗浄し、死んだ細胞を除去します。</li>
		<li>2 mLのトリプシンを加え、室温(RT)で2分間インキュベートします。</li>
		<li>フェノールレッドを含む培地8mLで切り離した細胞を希釈し、ピペットで慎重に混ぜます。</li>
		<li>ノイバウアーチャンバー内の細胞を数え、カバーリップを含む6ウェル細胞培養プレートの1.5 x 10 5細胞/ウェルの密度で種子を入れます(ステップ1.1.1-1.1.2で作成)。</li>
		<li>約80%の合流を達成するために、細胞を24時間インキュベーター(37°C、5%CO2)で増殖させます。</li>
		<li>目的のベクターDNA(例えば、CT-SNAPまたはNT-SNAP)の2μgを2つの別々のチューブに希釈し、各ウェルに対して500μLの還元血清培地をそれぞれ含み、RTで5分間インキュベートする。</li>
		<li>2つの溶液を混ぜ合わせてトランスフェクション混合物を得て、RTで20分間インキュベートします。</li>
		<li>その間に、播種したCHO細胞を滅菌PBSで一度洗います。</li>
		<li><li></li><li><li></li><li></li><li></ol></li><li> <ol><li></li><li><li><li> </li><li></li><li></ol></li><li><ol><li> </li><li> </li><li> </li></ol></li></ol><ol><li><ol><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq01v2.png"> </li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq02.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq03.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq04.jpg"> </li><li> <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq05.jpg"> </li><li> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq06v2.png"> </li><li> <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq07.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq08.jpg"></li><li> </li><li></li><li> <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq09.jpg"><img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq10.jpg"></li></ol></li><li><ol><li> <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq011v2.png"> </li><li> <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq12.jpg"> </li><li> <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq13.jpg"> </li><li></li><li> <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq14.jpg"><img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq15.jpg"></li><li> <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq016v2.png"> </li></ol></li></ol>

著者には宣言する競合はありません。

蛍光分光法は、細胞内での摂動を最小限に抑えてタンパク質のダイナミクスとタンパク質とタンパク質相互作用を定量化する主な方法の1つです。共焦点蛍光相関分光法(FCS)は、分子動力学を単分子感受性、高選択的、および生細胞適合性1として解析する強力な方法の1つである。他のダイナミクス指向のアプローチと比較して、FCSは〜nsから〜sに及ぶより広範な測定可能な時間範囲を有し、最も重要なのは、イメージングベースの方法でアクセスできないことが多い高速時間スケールをカバーする。また、膜、細胞質、核分子動力学が容易に識別できるように空間選択性も提供する2。これにより、分子ブリンク、平均局所濃度、および拡散係数をFCSで定量的に解析することができる。結合などの分子間ダイナミクスは、二重色アプローチで蛍光相互相関分光法(FCCS)分析3、4、5における2つの分子種の共拡散を調べた場合に容易にアクセス可能になります。
相関分光法における主な根底原理は、蛍光標識された生体分子がレーザー焦点の出入りを拡散して放出する強度変動の統計分析である(図1A)。結果として得られる自動相関関数または相互相関関数は、曲線フィッティングによってさらに分析され、最終的に関心のあるレート定数を導き出すことができます。言い換えれば、FCSおよびFCCSの統計的方法は、単一粒子追跡のような単一分子トレースを提供するのではなく、高い時間分解能を有するプローブ標本の動的パターンまたは「指紋」を提供する。フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)と組み合わせると、共焦点設定5,6において、立体構造変化などの分子内ダイナミクスを同時に監視することができる。FRETは2つのフルオロフォアの距離をプローブし、しばしば分子「ナノルーラー」と呼ばれます。エネルギー移動は、分子が近傍(<10nm)に位置する場合にのみ行われ、ドナーの発光スペクトルはアクセプター分子の吸収スペクトルと著しく重なり、ドナーとアクセプターの双極子配向が(十分に)平行である。従って、FRETとFCCSの組合せは非常に高い時空間分解能の技術を提供する。空間選択性、感度、生細胞適合性が必要な場合、FRET-FCCSは、等温滴定熱量測定(ITC)7、表面プラズモン共鳴(SPR)8、または核磁気共鳴(NMR)9、タンパク質ダイナミクスおよび相互作用を測定するための10のような他の方法よりも明らかに有利である。
デュアルカラー蛍光相互相関分光(dc-FCCS)の能力と約束にもかかわらず、ライブセルでdc-FCCSを実行することは、スペクトルブリードスルーまたはチャンネル3、4、スペクトル異なるレーザーライン3、4、11、バックグラウンド、またはノイズフォトのスペクトルに起因する共焦点ボリュームの違いにより技術的に困難です。 13、14、15。FCCSへのパルスインターリーブ励起(PIE)の導入は、チャネル16間のスペクトルクロストークを低減するための異なるレーザー励起を時間的に切り離す重要な調整であった。スペクトルブリードスルー17、18、19に対抗する他の補正方法および背景補正も17、18、19で十分に受け入れられている。FCS、PIE、FRET の詳細と基本については、読者は、次の参照先2、4、6、16、20、21、22、23、24を参照してください。
ここでは、プロトタイプGタンパク質共役受容体、β 2 -アドレナリン受容体(β 2 AR)の実験結果と共に必要なすべての較正実験および分析が提示され、(1)「緑」(eGFP)または「赤」(SNAPタグベースの標識)25フルオロフォアを持つ単一標識分子。(2)二重標識構造物で、N末端SNAPタグおよび細胞内eGFP(NT-SNAP)を有する[この場合、両方の標識が同じタンパク質である。したがって、100%の共拡散が予想される](3)二重標識サンプルで、両方の蛍光体が細胞膜の同じ側にある(CT-SNAP)。C末端のスナップタグと細胞内eGFPを搭載しています。ここで、再び両方の標識が同じタンパク質にあり、再び100%共拡散が予想される。両方のラベルが互いに非常に近く、細胞膜の同じ側に、FRETおよび反相関行動を観察する可能性を示す。全ての構成体は中国のハムスター卵巣(CHO)細胞でトランスフェクションされ、後にCT-SNAP構築物のNT-SNAP構築物に対して膜不透過性および膜透過性である赤色蛍光基質で標識された。最後に、シミュレーションデータは、FRET誘導の非相関に対する実験パラメータの影響と、タンパク質とタンパク質の相互作用が共拡散振幅に及ぼす影響を例示します。
したがって、このプロトコルは、技術的/物理的なアーティファクト、課題、および可能な解決策を認識しながら、タンパク質ダイナミクスとタンパク質とタンパク質相互作用を理解するために、生細胞で組み合わせたFRET-FCCSを実行するための完全なガイドを提供します。

<table><tbody><tr><td>5つのレンズを備えた4f構成の1x望遠鏡</td><td>Qioptiq、Rhyl、UK</td><td>G063126000</td><td>Optics</td></tr><tr><td>2xバンドパスフィルターBrightline</td><td>AHF、T&uuml;ビンゲン、ドイツ</td><td>HC 525/50およびHC 600/52</td><td></td></tr><tr><td>フィルター2xダイクロイックビームスプリ</td><td>ッターAHF、T&uuml;bingen, Germany</td><td>HC BS F38-573</td><td>Filter</td></tr><tr><td>6-well culture plate Nunc</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>140675</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard)</td><td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>A20000</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard)</td><td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>A20003</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>ASI ステージ PZ-2000 XYZ</td><td>Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany</td><td>WK-XYB-PZ-IX71</td><td>顕微鏡部品</td></tr><tr><td>Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for&nbsp; 25 mm round coverslips</td><td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>A7816</td><td>ガラスカバースリップホルダー</td></tr><tr><td>Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14)</td><td>Laser Components GmbH, Olching, Germany</td><td>SPCM-AQR-14</td><td>単一光子計数検出器</td></tr><tr><td>Beamsplitter</td><td>Newport, Darmstadt, Germany</td><td>10FC16PB.3</td><td>Filter</td></tr><tr><td>Biorender (Software)</td><td>Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Canada)</td><td>---</td><td>Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/</td></tr> <tr><td>Chinese hamster ovary (CHO) cell line</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td>Cell</td></tr><tr><td>lines ChiSurf (Data analysis Software)</td><td>Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA</td><td></td>---<td>tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf (英語)チュートリアル: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s 参考文献: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td><td>472476-2.5L</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany)</td><td>A3672,0250</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>DNA strand (40 bp fluorophore distance)</td><td>IBA Lifesciences GmbH (G&ouml;ttingen, Germany)</td><td>---</td><td>試薬, 5'CGC法 GAA CAG CATG ACA CGC GATアグ CTA TCC TGT AGT ACG CTG(Alexa568)C AGG 3', 3'GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5'</td></tr><tr><td>ダルベッコModified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red)</td><td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>P04-41250, P04-41650</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Ethanol (absolute)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td><td>34852-1L-M</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Erythrosin B,Dye content >=95 %</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td><td>200964-5G</td><td>Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>バイオクロム&nbsp;(ドイツ・ベルリン)</td><td>S 0615</td><td>試薬</td></tr><tr><td>蛍光光源 X-Cite 120 Q</td><td>Excelitas Technologies, Ontario, Canada</td><td>XI120-Q-5060</td><td>顕微鏡部品</td></tr><tr><td>蛍光SNAP基板 セル:SNAP Cell TMR- STAR</td><td>New England BioLabs (フランクフルト・アム・マイン、ドイツ)</td><td>S9105S</td><td>試薬</td></tr><tr><td>蛍光SNAP基板表面:DY-549</td><td>New England BioLabs (フランクフルト・アム・マイン、ドイツ)</td><td>S9112S</td><td>試薬</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ(寸法:直径24 mm、厚さ0.13 - 0.16 mm)</td><td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&ouml;nigshofen, Germany)</td><td>111640</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Laser Controller</td><td>Picoquant, Berlin, Germany</td><td>910020 (PDL 828-S "SEPIA II")</td><td>Optics</td></tr><tr><td>Laser lines (480 nm and 560 nm)</td><td>Picoquant, Berlin, Germany</td><td>912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560)</td><td>Optics</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>11668-019</td><td>試薬</td></tr><tr><td>MFD suite (Software)</td><td>AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany</td><td>---</td> <td>Kristine (tttr データの相関)、Burbulator (単一分子実験のシミュレーション)、 https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis</td></tr><tr><td>Mounted Achromatic Doublet、ARC: 400-700 nm、f=150 mm、D=25.4 mm</td><td>Thorlabs、Bergkirchen、Germany などの単一分子蛍光実験の分析用ソフトウェアパッケージ</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>ビームエキスパンダー</td></tr>ノ<tr><td>イバウアーチャンバーの第2部(深さ0.1 mm)</td><td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&ouml;nigshofen, Germany)</td><td>640110</td><td>試薬</td></tr><tr><td>Olympus IX 71 stand</td><td>Olympus, Hamburg, Germany</td><td>IX2-ILL100</td><td>Microscope Parts</td></tr><tr><td>Opti-MEM (Reduced-Serum Medium)</td><td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td><td>31985-047</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td><td>049M4857V</td><td></td></tr><tr><td>Reagent Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>GIBCO、Life Technologies(カールスバッド、米国)</td><td>14190144</td><td>試薬</td></tr><tr><td>ピンホール(50 & micro;M)</td><td>ニューポート、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>PNH-50</td><td>ピンホール</td></tr><tr><td>PMT ハイブリッド-40</td><td>ピコクワント、ベルリン、ドイツ</td><td>932200 (PMA ハイブリッド 40)</td><td>単一光子計数検出器</td></tr><tr><td>Python スクリプト (ソフトウェア)</td><td>Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany</td><td>---</td><td>tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) に基づく自作の Python スクリプトのコレクションは、(1) 平均カウント率の決定、(2) データの相関、(3) 蛍光減衰ヒストグラムの構築、https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS</td></tr><tr><td>クワッドバンド ビームスプリッター (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1)</td><td>AHF、T&uuml;bingen, ドイツ</td><td>F73-421PH</td><td>フィルター</td></tr><tr><td>シングルモード ファイバー偏波保持, NA = 0.08 コリメータ付き</td><td>Picoquant, Berlin, Germany</td><td>02126</td><td>Optics</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>Carl Roth (Karlsruhe, Germany)</td><td>6771.1</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software)</td><td>Picoquant, Berlin, Germany</td><td>931073 (SPT64-1+2 シングル ユーザー)</td><td>自作のFCCSセットアップでのタイムタグ時間分解(tttr)データ収集、データエクスポート</td></tr><tr><td>Time-Correlated Single Photon Counting(TCSPC)システムHydraharp 400</td><td>Picoquant、ベルリン、ドイツ</td><td>930010(Hydraharp 400)</td><td>Optics</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich(セントルイス、米国)</td><td>T4299-100ml</td><td>試薬</td></tr><tr><td>アンマウントアクロマティックダブレット、ARC:400-700 nm、D = 12.7 mm、F = -20 mm</td><td>Thorlabs、ベルクキルヒェン、ドイツ</td><td>ACN127-020-A</td><td>ビームエキスパンダーの最初の部分</td></tr><tr><td>水浸対物レンズ (UPlanSApo 60x/1.20 W)</td><td>オリンパス、ハンブルク、ドイツ</td><td>UPLSAPO60XW</td><td>対物レンズ</td></tr></tbody></table>

生細胞におけるタンパク質相互作用とタンパク質ダイナミクスを研究するための二色蛍光相互相関分光法

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

我々は、現代の蛍光標識技術を用いて生細胞における膜受容体動態を研究するために、フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)と組み合わせた生細胞二重色蛍光相互相関分光(FCCS)を行うプロトコルとワークフローを提示する。蛍光強度の変動がそれぞれの蛍光生体分子の動的な「指紋」を表すデュアルカラーFCCSでは、受容体の共拡散または結合をプローブすることができます。FRETは、分子距離に対する高感度で、分子内変化を監視する有名な「ナノルーラー」として機能します。一緒に考えて、立体構造変化と局所受容体濃度および移動性定数のような主要なパラメータは細胞の設定でアクセス可能になる。
高ノイズレベルとサンプルの脆弱性により、細胞内では定量的蛍光アプローチが困難です。ここでは、eGFPおよびSNAPタグタムラで標識された2-アドレナリン受容体(β 2 AR)を用いたデュアルカラー βを用いたキャリブレーションステップを含む、この実験の実施方法を示す。カスタマイズが容易なオープンソースソフトウェアとテンプレートを使用して、段階的なデータ分析手順を提供します。
このガイドラインにより、生細胞実験では信号対雑音レベルが限られているにもかかわらず、生体細胞内の生体分子の分子相互作用を高い信頼性 で 解明することができます。FRETの操作ウィンドウ、特に低濃度のFCCSは、生理学的条件に近い状態で定量的な分析を可能にする。

我々は、現代の蛍光標識技術を用いて生細胞における膜受容体ダイナミクスを研究するために、フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)と組み合わせた生細胞二重色蛍光相互相関分光(FCCS)を行う実験プロトコルとデータ分析ワークフローを提示する。

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

蛍光相互相関分光法は、時間結果蛍光を用いて、生細胞におけるGタンパク結合受容体の動的シグネチャを特定する統計的方法である。ここでは、特に、β-2アドレナリン受容体に関心があります。スフィンゴ脂質受容体は、主に、並進拡散ダイナミクスに関する情報を提供し、蛍光異方性の助けを借りて、また、回転拡散を提供します。追加のラベルを導入することで、プローブされたラベル間の共鳴エネルギー伝達を促進すれば、プロバインディングや立体構造の変化を促進することもできます。定量的に時間分解された蛍光は、セットアップとキャリブレーション測定の慎重なアライメントを必要とします。次の議事録では、クローン可能なタグと合成流動力を用いて、Gタンパク質共役受容体の生細胞蛍光相関分光、相互相関分光法、およびForster共鳴エネルギー伝達のための実験ガイドを提供する。細胞の座りやトランスフィックスは、無菌条件下で行う必要があります。きれいなカバースリップバーベルを6つのウェルカルチャープレートに置き、10%のウシ胎児血清、100マイクログラム、アミンペニシリン当たり100マイクログラム、1mlレンサプトマイシンあたり100マイクログラムを補ったフェノールレッドで無菌リン酸緩衝液生理培地2mLを加えて、それぞれウェルに脇に置きます。5%のCO2で37°Cでフェノールレッドと同じ培地で培養されたCHO細胞を取り、死んだ細胞を除去するために5 mL PBSでそれらを洗浄します。トリプシンを2mL加え、室温で2分間インキュベートします。フェノールレッドで8mLの培地でデータセルを希釈し、ピペットで慎重に混ぜます。ノイバウアーチャンバー内の細胞を数え、カバースリップを含む6つのウェル培養プレートでウェルあたり150,000細胞の密度で細胞を座らせる。およそ80%の合流性を達成するために、細胞を24時間インキュベーターで増殖させます。目的のベクターDNAの2マイクログラムを希釈します。例えば、CT SNAPまたはNT SNAP、およびそのトランスフェクション試薬の6マイクロリットルを2つの別々のチューブに。各ウェルに対して500マイクロリットルの減らされた血清培地を含み、室温で5分間インキュベートする。2つの溶液を混ぜ合わせてトランスフェクション混合物を得て、室温でさらに20分間インキュベートします。その間、座ったCHO細胞を滅菌PBSで一度洗います。10%胎児ウシ血清と抗生物質を補っていないフェノール赤いフリー培地のウェルあたり1 mlでPBSを置き換えます。各ウェルに1mlドロップワイズの全体の構造混合物を追加し、5%のCO2で37度で一晩細胞をインキュベートします。標識の場合、適切なSNAP基質を10%の胎児ウシ血清を添加した1mL培地で希釈し、1マイクロモルの最終濃度を得る。PBSで一度トランスフェクション細胞を洗浄し、1マイクロモルスナップ基質溶液のウェルあたり1 mLを追加します。細胞を5%CO2で37度で20分間インキュベートします。細胞をフェノールレッドフリー培地で3回洗浄し、1ウェルフェノールレッドフリー培地あたり2mLを加えます。5%のCO2で37度で30分間細胞をインキュベートします。すべてのサンプルのカバースリップを後でイメージングチャンバーに移し、500マイクロリットルイメージングバッファで洗浄します。FRED FCS セットアップに移行する前に、500 マイクロリットルイメージング バッファーを追加します。FRED FCSのセットアップは共焦点顕微鏡法の水目的、2つのレーザーライン、時間キルター単一の外国のカウントシステム、2つの雑種のBT、および光子コレクションおよびデータ収集ソフトウェアのための2つの株式が装備されている。ライブセルで測定する前に、セットアップを毎回整列させることは非常に重要です。焦点、ピンホール、着色位置を調整するには、2つのナノモルグリーンキャリブレーション溶液をガラスカバースリップに置き、485ナノメートルと560ナノメートルのレーザーをパイル、インターリーブ励起またはPIモードで操作します。溶液に焦点を合わせ、最大の分子輝度を得るために最高のカウント率と最小の共焦点量が得られるようなピンホールと襟リング位置を調整します。10ナノモルレッドキャリブレーション溶液と両方を混合して、赤チャンネルに対してこのプロセスを繰り返します。ガラスカバースリップに10ナノモルDNA溶液を置き、緑色と赤色の検出チャネルの間のクロスカラーが最も高いになるようにピンホールとカラーリング位置の焦点を調整します。それは最も高い振幅の源です。生細胞での測定では、マーカーランプで制限し、眼を通して観察することによって適切な細胞を見つける。PIモードで両方のレーザーをオンにし、毎秒最大カウントを探すことによって膜に焦点を当てます。細胞サンプルのレーザーパワーを減らす必要がある場合がありますので、ご注意ください。目的で5マイクロワット未満であることが好ましい。これは、使用される花とセットアップに大きく依存します。データ収集ソフトウェアのオンラインプレビューで、EGPおよびスナップタグプローブにバインドされたβ-2 ARのオート・アンド・クロス・コルカーブを観察し、60~180秒の取得時間で複数のソート測定を収集します。すべての測定値から相関コースとコントラストをエクスポートします。プロンプトと遅延の時間枠を正しく定義し、データ相関ソフトウェアでいくつかのマイクロタイム取得オプションを使用するために、ここで注意してください。合計で、3つの異なる相関が必要です。緑のチャンネルプロンプト時間枠の自動相関。赤チャンネルと遅延時間ウィンドウの自動相関。そして最後にグリーンチャネル信号の相互相関と、プロンプトタイムウィンドウは遅延時間ウィンドウ内の赤チャンネル信号であった。ここでは、緑と赤のFREDのソリューションの自動相関関数を、2つの使用カラーチャネルの共焦点検出量の形状とサイズを校正するために必要な追加の三重項を持つ3 DT拡散モデルに適合します。 TDは拡散時間とSを、ω上のゼロは共焦点体積要素の形状係数をゼロとする。トリプレット点滅と写真の物理学は、振幅ARと緩和時間TRとして記述されています。緑色と赤色のキャリブレーションの既知の拡散係数を使用して、形状因子を取得して、感染性共焦点体積要素の寸法と体積を決定します。IFR、チャンネルゼロで収集された緑色蛍光信号、および2つの右検出チャネルに、バックグラウンドで収集された信号の比率として、チャネル1と3のように、全体のスペクトルを計算します。赤いキャリブレーション測定値の背景収集コントラストと、赤色レーザーによる遅延時間ウィンドウ励起における背景正しい口座への緑色レーザーによる迅速なタイムウィンドウ励起の比率により、ドナー励起波長によるアクセプタフローの直接的な期待値を決定します。Bの分子輝度を、収集した背景のコントラストに基づいて緑と赤の両方の流量力を計算し、分子数を取得し、3DT拡散フィットに焦点を当てます。緑と赤のチャネルからの両方の超相関を適合させるだけでなく、二重レベルDNAの緑色のプロンプトと赤色の遅延から3 DT拡散モデルへの相関を越えて、自己相関関数の形状因子を一定に保ちます。相互相関関数の形状係数は、通常、これらの 2 つの値の間にあります。分子数と焦点のフォント値に基づいて、相関時間がゼロで振幅を決定します。サンプルの振幅比を計算し、緑と赤の床力の 100% 共拡散を行いました。セルサンプルを適切なモデルに適合させます。彼らがバイモーダルの方法で好奇心を持っていない膜受容体拡散をどのように示されているかは、短く、長い拡散時間ではありませんでした。さらに、写真の物理学と床力を点滅させるを考慮する必要があります。ここではTD1とTD2に、拡散時間に必要な2つである。そして1つは、遊離ダイスとDNA鎖が拡散する較正測定とは対照的に、細胞膜に沿って2D拡散のみを示す膜受容体が、分子数および焦点の数に関して緑色または赤色の標識タンパク質の濃度を計算する第1回拡散時間の一部である。共焦点体積要素の体積と、バイアス質量を用いた。二重レベル構造と相互相関関数と同じモデルを使用して二重ラベルサンプルの2つのアルト相関を適合させ、二重様式拡散モデルを使用して、システムのグローバル記述のために注意してください。3つの作物はすべて共同で収まらなければならない。拡散項は3つの作物すべてで同じです。そして唯一の違いは、評判時間が下がり、相互相関関数です。それぞれの分子数と焦点と共焦点体積要素の体積から、緑または赤色の労働タンパク質の濃度を計算します。DNAサンプルから得られた補正因子、細胞試料の振幅比、および得られた各濃度を用いて、細胞サンプルから相互作用する緑色および赤色の標識タンパク質の画分または濃度を推定する。FREDサンプルの2つの変化相関を単一の標識サンプルとして適合し、AFは全反相関の振幅を反映し、ARとTRのそれぞれの振幅と緩和時間を反映する、反相関項を含む二次元拡散モデルに対する前方相互相関を適合させる。FRED 1または複数の抗相関項による抗相関蛍光変化の場合、2つの自己相関関数の上昇と一致する低相関時間におけるフレッド相互相関関数のディップが必要になる可能性がある。6.5と緑のチャネル、および赤のチャネルで6.8の要因を剃るために緑と赤の花のソリューションのキャリブレーション測定。したがって、共焦点体積は、この測定日の後半に1.4と1.9フェムトのサイズを有し、分子の明るさは1分子当たり12.5キロヘルツ、および分子当たり2.6キロヘルツにある。我々は、ドナー励起後に緑色の花から赤いチャネルへのクロストークの15%を持っており、緑色による赤い花の形態の励起を除く直接の38%を有し、我々のDNA測定から、共焦点重複量の補正因子を0.6と0.7に決定し、単一ラベルでトランスフェクトされた細胞は、細胞膜上で2次元拡散を示す2-モーダル2次元拡散を示す50 ~ 100 ミリ秒のタイムスケールと、残りの半分は両方のコンストラクトで 2 ミリ秒前後の比較的高速です。また、三つばまびが存在します。ただし、赤レベルのスナップ構造では、別の緩和時間が180マイクロ秒で取得され、非連結スナップストレートに起因する可能性があります。二重ラベル自体から、細胞膜の2つの異なる側面に2つのラベルが集められた抗スナップ構造でトランセクトされ、2つ少ない測定値が相関にノイズと赤いコートを収集されている。そして、PI相互相関はここで非常に高いです。ここでは、分子の70%が、ゆっくりと100ミリ秒のタイムスケール未満で、1ミリ秒前後で30%しか速くなければ、二重解放分子の割合は低く、15〜25%の間にあり、CTスナップのデータはより良く見え、騒々しくはありません。しかし、予想される最も深い反相関は見ることができず、両方の花の力の励起と三重点滅を直接受け入れ、収集された蛍光強度を利用してデータ分析スキームがシミュレートされたデータセットのために示すようにこれを救出するのに役立つかもしれないクロストークの高い量によって質量である可能性が最も高い。フレッドFCS技術の利点は、モビリティとともに、GPCRsの会議ダイナミクスを調査できることです。しかし、ラボでFRED FCを実行することは困難であり、良好なトランスフェクションされた細胞、効率的なラベリング、完璧なキャリブレーションされたセットアップを要求します。ちょうどFREDペアプロの力も非常に重要です。重要な実験ステップには、トランスフェクション最適化の最適化、バックグラウンドの最小化、および自動蛍光が含まれます。さらに、Atoms分析パイプラインは、生細胞におけるプリセプターの様々なダイナミクスを理解するのに役立ちます。このプロトコルが、ライブセル実験でFRED FCSアプローチを実行するのに役立つことを期待しています。

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生物化学

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生細胞におけるタンパク質相互作用とタンパク質ダイナミクスを研究するための二色蛍光相互相関分光法

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