生細胞におけるタンパク質相互作用とタンパク質ダイナミクスを研究するための二色蛍光相互相関分光法

蛍光相互相関分光法は、時間結果蛍光を用いて、生細胞におけるGタンパク結合受容体の動的シグネチャを特定する統計的方法である。ここでは、特に、β-2アドレナリン受容体に関心があります。スフィンゴ脂質受容体は、主に、並進拡散ダイナミクスに関する情報を提供し、蛍光異方性の助けを借りて、また、回転拡散を提供します。

追加のラベルを導入することで、プローブされたラベル間の共鳴エネルギー伝達を促進すれば、プロバインディングや立体構造の変化を促進することもできます。定量的に時間分解された蛍光は、セットアップとキャリブレーション測定の慎重なアライメントを必要とします。次の議事録では、クローン可能なタグと合成流動力を用いて、Gタンパク質共役受容体の生細胞蛍光相関分光、相互相関分光法、およびForster共鳴エネルギー伝達のための実験ガイドを提供する。

細胞の座りやトランスフィックスは、無菌条件下で行う必要があります。きれいなカバースリップバーベルを6つのウェルカルチャープレートに置き、10%のウシ胎児血清、100マイクログラム、アミンペニシリン当たり100マイクログラム、1mlレンサプトマイシンあたり100マイクログラムを補ったフェノールレッドで無菌リン酸緩衝液生理培地2mLを加えて、それぞれウェルに脇に置きます。5%のCO2で37°Cでフェノールレッドと同じ培地で培養されたCHO細胞を取り、死んだ細胞を除去するために5 mL PBSでそれらを洗浄します。

トリプシンを2mL加え、室温で2分間インキュベートします。フェノールレッドで8mLの培地でデータセルを希釈し、ピペットで慎重に混ぜます。ノイバウアーチャンバー内の細胞を数え、カバースリップを含む6つのウェル培養プレートでウェルあたり150,000細胞の密度で細胞を座らせる。

およそ80%の合流性を達成するために、細胞を24時間インキュベーターで増殖させます。目的のベクターDNAの2マイクログラムを希釈します。例えば、CT SNAPまたはNT SNAP、およびそのトランスフェクション試薬の6マイクロリットルを2つの別々のチューブに。

各ウェルに対して500マイクロリットルの減らされた血清培地を含み、室温で5分間インキュベートする。2つの溶液を混ぜ合わせてトランスフェクション混合物を得て、室温でさらに20分間インキュベートします。その間、座ったCHO細胞を滅菌PBSで一度洗います。

10%胎児ウシ血清と抗生物質を補っていないフェノール赤いフリー培地のウェルあたり1 mlでPBSを置き換えます。各ウェルに1mlドロップワイズの全体の構造混合物を追加し、5%のCO2で37度で一晩細胞をインキュベートします。標識の場合、適切なSNAP基質を10%の胎児ウシ血清を添加した1mL培地で希釈し、1マイクロモルの最終濃度を得る。

PBSで一度トランスフェクション細胞を洗浄し、1マイクロモルスナップ基質溶液のウェルあたり1 mLを追加します。細胞を5%CO2で37度で20分間インキュベートします。細胞をフェノールレッドフリー培地で3回洗浄し、1ウェルフェノールレッドフリー培地あたり2mLを加えます。

5%のCO2で37度で30分間細胞をインキュベートします。すべてのサンプルのカバースリップを後でイメージングチャンバーに移し、500マイクロリットルイメージングバッファで洗浄します。FRED FCS セットアップに移行する前に、500 マイクロリットルイメージング バッファーを追加します。

FRED FCSのセットアップは共焦点顕微鏡法の水目的、2つのレーザーライン、時間キルター単一の外国のカウントシステム、2つの雑種のBT、および光子コレクションおよびデータ収集ソフトウェアのための2つの株式が装備されている。ライブセルで測定する前に、セットアップを毎回整列させることは非常に重要です。焦点、ピンホール、着色位置を調整するには、2つのナノモルグリーンキャリブレーション溶液をガラスカバースリップに置き、485ナノメートルと560ナノメートルのレーザーをパイル、インターリーブ励起またはPIモードで操作します。

溶液に焦点を合わせ、最大の分子輝度を得るために最高のカウント率と最小の共焦点量が得られるようなピンホールと襟リング位置を調整します。10ナノモルレッドキャリブレーション溶液と両方を混合して、赤チャンネルに対してこのプロセスを繰り返します。ガラスカバースリップに10ナノモルDNA溶液を置き、緑色と赤色の検出チャネルの間のクロスカラーが最も高いになるようにピンホールとカラーリング位置の焦点を調整します。

それは最も高い振幅の源です。生細胞での測定では、マーカーランプで制限し、眼を通して観察することによって適切な細胞を見つける。PIモードで両方のレーザーをオンにし、毎秒最大カウントを探すことによって膜に焦点を当てます。

細胞サンプルのレーザーパワーを減らす必要がある場合がありますので、ご注意ください。目的で5マイクロワット未満であることが好ましい。これは、使用される花とセットアップに大きく依存します。

データ収集ソフトウェアのオンラインプレビューで、EGPおよびスナップタグプローブにバインドされたβ-2 ARのオート・アンド・クロス・コルカーブを観察し、60~180秒の取得時間で複数のソート測定を収集します。すべての測定値から相関コースとコントラストをエクスポートします。プロンプトと遅延の時間枠を正しく定義し、データ相関ソフトウェアでいくつかのマイクロタイム取得オプションを使用するために、ここで注意してください。

合計で、3つの異なる相関が必要です。緑のチャンネルプロンプト時間枠の自動相関。赤チャンネルと遅延時間ウィンドウの自動相関。

そして最後にグリーンチャネル信号の相互相関と、プロンプトタイムウィンドウは遅延時間ウィンドウ内の赤チャンネル信号であった。ここでは、緑と赤のFREDのソリューションの自動相関関数を、2つの使用カラーチャネルの共焦点検出量の形状とサイズを校正するために必要な追加の三重項を持つ3 DT拡散モデルに適合します。 TDは拡散時間とSを、ω上のゼロは共焦点体積要素の形状係数をゼロとする。トリプレット点滅と写真の物理学は、振幅ARと緩和時間TRとして記述されています。緑色と赤色のキャリブレーションの既知の拡散係数を使用して、形状因子を取得して、感染性共焦点体積要素の寸法と体積を決定します。

IFR、チャンネルゼロで収集された緑色蛍光信号、および2つの右検出チャネルに、バックグラウンドで収集された信号の比率として、チャネル1と3のように、全体のスペクトルを計算します。赤いキャリブレーション測定値の背景収集コントラストと、赤色レーザーによる遅延時間ウィンドウ励起における背景正しい口座への緑色レーザーによる迅速なタイムウィンドウ励起の比率により、ドナー励起波長によるアクセプタフローの直接的な期待値を決定します。Bの分子輝度を、収集した背景のコントラストに基づいて緑と赤の両方の流量力を計算し、分子数を取得し、3DT拡散フィットに焦点を当てます。

緑と赤のチャネルからの両方の超相関を適合させるだけでなく、二重レベルDNAの緑色のプロンプトと赤色の遅延から3 DT拡散モデルへの相関を越えて、自己相関関数の形状因子を一定に保ちます。相互相関関数の形状係数は、通常、これらの 2 つの値の間にあります。分子数と焦点のフォント値に基づいて、相関時間がゼロで振幅を決定します。

サンプルの振幅比を計算し、緑と赤の床力の 100% 共拡散を行いました。セルサンプルを適切なモデルに適合させます。彼らがバイモーダルの方法で好奇心を持っていない膜受容体拡散をどのように示されているかは、短く、長い拡散時間ではありませんでした。

さらに、写真の物理学と床力を点滅させるを考慮する必要があります。ここではTD1とTD2に、拡散時間に必要な2つである。そして1つは、遊離ダイスとDNA鎖が拡散する較正測定とは対照的に、細胞膜に沿って2D拡散のみを示す膜受容体が、分子数および焦点の数に関して緑色または赤色の標識タンパク質の濃度を計算する第1回拡散時間の一部である。

共焦点体積要素の体積と、バイアス質量を用いた。二重レベル構造と相互相関関数と同じモデルを使用して二重ラベルサンプルの2つのアルト相関を適合させ、二重様式拡散モデルを使用して、システムのグローバル記述のために注意してください。3つの作物はすべて共同で収まらなければならない。

拡散項は3つの作物すべてで同じです。そして唯一の違いは、評判時間が下がり、相互相関関数です。それぞれの分子数と焦点と共焦点体積要素の体積から、緑または赤色の労働タンパク質の濃度を計算します。

DNAサンプルから得られた補正因子、細胞試料の振幅比、および得られた各濃度を用いて、細胞サンプルから相互作用する緑色および赤色の標識タンパク質の画分または濃度を推定する。FREDサンプルの2つの変化相関を単一の標識サンプルとして適合し、AFは全反相関の振幅を反映し、ARとTRのそれぞれの振幅と緩和時間を反映する、反相関項を含む二次元拡散モデルに対する前方相互相関を適合させる。FRED 1または複数の抗相関項による抗相関蛍光変化の場合、2つの自己相関関数の上昇と一致する低相関時間におけるフレッド相互相関関数のディップが必要になる可能性がある。

6.5と緑のチャネル、および赤のチャネルで6.8の要因を剃るために緑と赤の花のソリューションのキャリブレーション測定。したがって、共焦点体積は、この測定日の後半に1.4と1.9フェムトのサイズを有し、分子の明るさは1分子当たり12.5キロヘルツ、および分子当たり2.6キロヘルツにある。我々は、ドナー励起後に緑色の花から赤いチャネルへのクロストークの15%を持っており、緑色による赤い花の形態の励起を除く直接の38%を有し、我々のDNA測定から、共焦点重複量の補正因子を0.6と0.7に決定し、単一ラベルでトランスフェクトされた細胞は、細胞膜上で2次元拡散を示す2-モーダル2次元拡散を示す50 ~ 100 ミリ秒のタイムスケールと、残りの半分は両方のコンストラクトで 2 ミリ秒前後の比較的高速です。

また、三つばまびが存在します。ただし、赤レベルのスナップ構造では、別の緩和時間が180マイクロ秒で取得され、非連結スナップストレートに起因する可能性があります。二重ラベル自体から、細胞膜の2つの異なる側面に2つのラベルが集められた抗スナップ構造でトランセクトされ、2つ少ない測定値が相関にノイズと赤いコートを収集されている。

そして、PI相互相関はここで非常に高いです。ここでは、分子の70%が、ゆっくりと100ミリ秒のタイムスケール未満で、1ミリ秒前後で30%しか速くなければ、二重解放分子の割合は低く、15〜25%の間にあり、CTスナップのデータはより良く見え、騒々しくはありません。しかし、予想される最も深い反相関は見ることができず、両方の花の力の励起と三重点滅を直接受け入れ、収集された蛍光強度を利用してデータ分析スキームがシミュレートされたデータセットのために示すようにこれを救出するのに役立つかもしれないクロストークの高い量によって質量である可能性が最も高い。

フレッドFCS技術の利点は、モビリティとともに、GPCRsの会議ダイナミクスを調査できることです。しかし、ラボでFRED FCを実行することは困難であり、良好なトランスフェクションされた細胞、効率的なラベリング、完璧なキャリブレーションされたセットアップを要求します。ちょうどFREDペアプロの力も非常に重要です。

重要な実験ステップには、トランスフェクション最適化の最適化、バックグラウンドの最小化、および自動蛍光が含まれます。さらに、Atoms分析パイプラインは、生細胞におけるプリセプターの様々なダイナミクスを理解するのに役立ちます。このプロトコルが、ライブセル実験でFRED FCSアプローチを実行するのに役立つことを期待しています。