Name: マイクロ流体デバイスにおける機能性神経筋接合を有するヒト運動ユニットの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 学ぶマイクロ流体デバイスを用いたヒト運動ユニット生成法。iPS細胞由来運動ニューロンと筋管の共培養により機能的神経筋接合を形成し、筋萎縮性側索硬化症などの運動ニューロン疾患研究に応用可能です。

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著者らは、LiMoNeのニッキー・コルトゥートとセバスチャン・マンク、研究グループ分子神経生物学(VIB-KUルーヴェン)に、生細胞カルシウム一過性蛍光記録に関するアドバイスに感謝する。この研究は、ベルギーとルクセンブルクのフルブライト委員会、KUルーヴェン(C1と「未来を開く」基金)、VIB、科学技術イノベーション庁(IWT)によって支援されました。SBO-iPSCAF)、「科学研究フランダース基金」(FWO-ヴラアンドレレン)、ターゲットALS、ALSリーガルギア(ALSの治療法)、ベルギー政府(ベルギー連邦科学政策局が開始した大学間アトラクションポールプログラムP7/16)、ティエリー・ラトラン財団、および「協会ベルジュ・コントレス・レ・マジェ・ニューカル・ムスル(AB)」T.V.とJ.Bは、FWO-ヴランドヘレンによって授与された博士号フェローシップによってサポートされています。

L.V.D..Bは、シャルコー・マリー・トゥース病(US-2013227717-A1)におけるHDAC阻害剤の使用に関する特許を取得しており、オーガスティン・セラピューティクスの科学的共同創設者であり、科学諮問委員会のメンバーです。他の著者は、競合する利益を宣言しません。

このプロトコルは、30日以内に市販のマイクロ流体デバイスで機能的なNmJを持つヒトモーターユニットを生成する比較的使いやすい方法を記述する。これは、NMJがICCおよびSEMなどの標準的な技術を通じて形態学的に評価され、生細胞カルシウム記録を通じて機能的にどのように評価することができるかを説明する。
このプロトコルの大きな利点は、幹細胞技術の使用です。これにより、ドナープロファイルとは無関係に、健康と病気の両方でNMJを評価できる完全な適応性が可能になります。このモデルはALS研究で既に成功し、有益であることが証明されており、FUS gene18の突然変異による新しい表現型として神経突起の成長、再成長、NMJの数の障害を同定しました。このモデルでは、病因が不明なALSの散発的な形態を、散発的なALS患者のiPSCを用いることで、研究を拡大することが可能である。これは、ヒト疾患を再現するために変異遺伝子のトランスジェニック過剰発現に依存する従来の動物モデルに対する利点を提供する23,24。さらに、当社の完全な人間のシステムは、人間固有の生理学や病気の潜在的な再現を可能にします。これまでの研究では、げっ歯類とヒトNMJ形態25の違いが示されており、げっ歯類を使用してヒトNMJ病理に対処する際には注意を払う必要があることを示唆しています。このシステムはインビボモデルの複雑さを欠く比較的単純なインビトロセットアップであるが、マイクロ流体デバイスに表示されるNMJ形態がヒト切断体25のNMJに似ていることを実証することが可能であった。さらに、このモデルは、NMJ形成および成熟中のNMJ評価を可能にし、ヒト死後のサンプルに存在しない、識別できない、または見落とされている初期の疾患の型を明らかにする可能性がある。
MABsは、10日の限られた生存期間はシステムの欠点であるが、myotubesを生成するための有効なオプションを提供する。筋管の生存は、筋線維の自発的な収縮によって損なわれる可能性が高い表面への愛着に依存している。10日を超えた後、ほとんどのミオチューブは切り離され、NMJ文化は使用できなくなります。理想的には、iPSCからもミオチューブが生成されます。しかし、現在のプロトコルは、融合指数27,28,29,30の変動により再現が困難であることが証明されています。
市販のマイクロ流体装置を用いることで、完全にアクセス可能な標準化システムを生成しました。その他のNMJモデルは31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42が存在する。しかし、通常、それらは、細胞タイプ間の区画化および流動性分離を欠く単一のコンパートメント、またはカスタムメイドの培養容器に依存しており、可用性を低下させ、再現性を低下させる可能性がある。このプロトコルに使用されるマイクロ流体装置は、軸索輸送43,44またはaxotomy18,45,46調査などのさらなる分析を可能にする、様々な長さのマイクログルーブで購入することができます。コンパートメント間の流体分離は、運動ニューロンまたはミオチューブのいずれかによる区分化薬物治療をさらに可能にし、治療の開発に有利であり得る。マイクロ流体を専門とする企業が増え、デバイスの設計と機能を豊富に選択し、インビトロ研究のアクセシビリティをさらに高めています。
結論として、我々は、機能的なNmJと人間のモーターユニットを培養する信頼性の高い、汎用性と簡単な方法を提供するプロトコルを開発しました。

NJSは、神経伝達物質1の放出を通じて、下部脊髄運動ニューロンと骨格筋線維との間のコミュニケーションを促進する。ALSやSMAのような運動ニューロン障害では、NmJは縮退し、筋肉とのコミュニケーションに混乱を引き起こす2、3、4、5、6、7。これは、患者が徐々に筋肉機能を失うことになり、車椅子に縛られ、最終的には横隔膜のような重要な筋肉群の進行性萎縮のために呼吸生命維持に依存する。これらの障害におけるこの深いNJの喪失の原因となる正確な根本的なメカニズムは不明である。トランスジェニック動物モデルに関する多くの研究が行われ、NMJ変性症の病因に関するいくつかの洞察が得られた5,6,8,9,10,11。しかし、病理を十分に理解し、脱性を打ち消すためには、完全なアクセシビリティを可能にする人間のシステムを持つことが重要です。
ここで、プロトコルは、市販のマイクロ流体デバイスを使用してhiPSC由来の運動ニューロンおよびヒト一次MAB由来ミオチューブの共培養を通じてヒトMJを生成する比較的簡単な方法を記述する。ニューロンのソマと軸索を偏光し、流動的に分離するためのマイクロ流体の使用は、1970年代後半の「カンペノン」室12の最初の記述以来知られている。それ以来、商業オプションを含む、より多くのマイクロ流体設計が製造されています。このプロトコルで使用されるデバイスは、2つのコンパートメントを含み、各コンパートメントは、channel13で接続された2つのウェルで構成されています。2つのコンパートメントはミラー化され、いくつかのマイクロ溝と接続されている。これらのマイクログルーブは毛管の静水圧13,14を通して2つのコンパートメント間の流体分離を維持しながら、神経突起成長を促進するサイズを有する。このシステムを使用すると、運動ニューロンを一方のコンパートメントで培養し、筋肉細胞を他の1つのコンパートメントで培養し、それぞれが特定の培養培地で培養し、マイクログルーブを通過して筋肉細胞と係合する神経突起を介した物理的な接続を促進することができる。このモデルはALSおよびSMAのような病気の初期NMJ病理学を研究するために使用することができる人間の運動単位の完全にアクセス可能で、適応可能なインビトロシステムを提供する。

<table><tbody><tr><td>&alpha;-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B35451</td><td>抗体 (1:1000)</td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>CHEM-Lab NV</td><td>CL00.0116.1000</td><td>コーティング成分.H226、H314。P280</td></tr><tr><td>Aclar 33Cシート(SEMシート)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>50425-25</td><td>厚さ:7.8 mil</td></tr><tr><td>Agrin(組換えヒトタンパク質)</td><td>R&D systems</td><td>6624-AG-050</td><td>Media supplement</td></tr><tr><td>Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td>抗体 (1:1000)</td></tr><tr><td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21432</td><td>抗体 (1:1000)</td></tr><tr><td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31570</td><td>抗体 (1:1000)</td></tr><tr><td>Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31571</td><td>抗体 (1:1000)</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Sigma</td><td>A4403</td><td>培地</td></tr><tr><td>成分&β;III-tubulin (Tubulin)</td><td>Abcam</td><td>ab7751</td><td>抗体 (1:500)</td></tr><tr><td>&β;-mercaptoethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31350010</td><td>培地成分。H317.P280です。</td></tr><tr><td>B-27 without vitamin A</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12587-010</td><td>培地成分</td></tr><tr><td>BDNF (脳由来神経栄養因子)</td><td>Peprotech</td><td>450-02B</td><td>成長因子</td></tr><tr><td>bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Growth factor</td></tr><tr><td>Choline acetyltransferase (ChAT)</td><td>Millipore</td><td>ab144P</td><td>抗体 (1:500)</td></tr><tr><td>カーフスキン由来コラーゲン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17104019</td><td>コーティング成分</td></tr><tr><td>CNTF(繊毛神経栄養因子)</td> <td>Peprotech</td><td>450-13B</td><td>成長因子</td></tr><tr><td>DAPI Nucblue 生細胞染色 ReadyProbes 試薬</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R37605</td><td>免疫細胞化学成分</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2634</td><td>培地サプリメント</td></tr><tr><td>Desmin</td><td>Abcam</td><td>Ab15200</td><td>抗体 (1:200)</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330032</td><td>培地成分</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td>凍結保存成分。H315、H319、H335。P280です。</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>14190250</td>カルシウム<td>、マグネシウム</td></tr>エ<tr><td>タノール</td><td>VWR20.821.296</td><td></td><td>滅菌なし。H225.P280</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10270106</td><td>培地成分</td></tr><tr><td>Fluo-4 AM 生細胞色素</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>F14201</td><td>カルシウムイメージング色素</td></tr><tr><td>蛍光封入培地</td><td>ダコ</td><td>S3023</td><td>免疫細胞化学成分</td></tr><tr><td>GDNF(グリア細胞株由来神経栄養因子)</td><td>ペプロテック</td><td>450-10B</td><td>成長因子</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>寒天 Scientific</td><td>R1020</td><td>固定成分。EUH071、H301、H314、H317、H330、H334、H410。P280です。</td></tr><tr><td>馬の血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>16050122</td><td>培地成分</td></tr><tr><td>ヒトアルカリホスファターゼ</td><td>R&D systems</td><td>MAB1448</td><td>抗体</td></tr><tr><td>ImageJ ソフトウェア</td><td>NIH</td><td></td><td>ICC analysis</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440053</td><td>培地成分</td></tr><tr><td>インスリントランスフェリン セレン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>41400045</td><td>培地成分</td></tr><tr><td>Islet-1</td><td>Millipore</td><td>ab4326</td><td>抗体 (1:400)</td></tr><tr><td>ノックアウト血清置換</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10828-028</td><td>凍結保存成分</td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫基底膜からのラミニン</td><td>シグマ</td><td>L2020-1MG</td><td>コーティング成分および培地サプリメント</td></tr><tr><td>ライカSP8 DMI8共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td>ICC共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25030-024</td><td>培地成分</td></tr><tr><td>Myogenin (MyoG)</td><td>Abcam</td><td>Ab124800</td><td>抗体 (1:500)</td></tr><tr><td>Myosin heavy chain (MyHC)</td><td>In-house, SCIL</td><td></td><td>抗体 (1:20)</td></tr><tr><td>N-2 supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td>培地成分</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td>コーティングおよび培地成分</td></tr><tr><td>ニューロフィラメント重鎖 (NEFH)</td><td>Abcam</td><td>AB8135</td><td>抗体 (1:1000)</td></tr><tr><td>Nikon A1R 共焦点顕微鏡</td><td>Nikon</td><td></td><td>生細胞カルシウムイメージング顕微鏡</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 4.30.02 ソフトウェア</td><td>Nikon</td><td></td><td>生細胞カルシウムイメージング分析</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11140050</td><td>培地成分</td></tr><tr><td>正常ロバ血清</td><td>Σ</td><td>D9663-10ML</td><td>免疫細胞化学成分</td></tr><tr><td>Olig2</td><td>IBL</td><td>18953</td><td>抗体 (1:1000)</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td>Storing equipment</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Fixation component.H302、H312、H315、H317、H319、H332、H335、H341、H350。P280です。</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン (5000 U/mL)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15070063</td><td>メディア成分</td></tr><tr><td>ペトリ皿 (3 cm)</td><td>nunc</td><td>153066</td><td>直径:3 cm</td></tr><tr><td>ペトリ皿 (10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>833.902</td><td>直径:10 cm</td></tr><tr><td>プレート (6 ウェル)</td><td>Cellstar Greiner bio-one</td><td>657160</td><td>培養プレート</td></tr><tr><td>プルロニック F-127</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P3000MP</td><td>Fluo-4 染料溶媒</td></tr><tr><td>ポリ-L-オルニチン (PLO)</td> <td>Σ</td><td>P3655-100MG</td><td>コーティング成分</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>CHEM-Lab NV</td><td>CL00.1133.1000</td><td>カルシウムイメージング試薬</td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td>Σ</td><td>R2625</td><td>培地サプリメント。H302、H315、H360FD、H410。P280です。</td></tr><tr><td>RevitaCellサプリメント</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A2644501</td><td>ROCK阻害剤溶液</td></tr><tr><td>スムージングアゴニスト</td><td>Merch Millipore</td><td>566660</td><td>培地サプリメント</td></tr><tr><td>カコジル酸ナトリウムバッファー</td><td>シグマ</td><td>C0250</td><td>固定成分。H301、H331、H350、H410。P280です。</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>培地成分</td></tr><tr><td>Synaptophysin (SYP)</td><td>Cell Signaling</td><td>5461S</td><td>抗体 (1:1000)</td></tr><tr><td>T75 フラスコ</td><td>Sigma</td><td>CLS3276</td><td>Culture Plate</td></tr><tr><td>Titin</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>9D10</td><td>抗体 (1:300)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td>免疫細胞化学コンポーネント。H302、H315、H318、H319、H410、H411。P280</td></tr><tr><td>TrypLEは</td><td>、サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12605010</td><td>MAB解離溶液</td></tr><tr><td>、塩酸ツボシラリン五水和物</td>、<td>シグマ</td><td>T2379-100G</td><td>アセチルコリン受容体遮断薬を発現します。H301です。P280です。</td></tr><tr><td>XonaChips組み立て済みマイクロ流体デバイス</td><td>Xona Microfluidics</td><td>XC150</td>マイクロ<td>溝の長さ:150 &mu;m</td></tr><tr><td>Xona シリコーンマイクロ流体デバイス</td><td>Xona マイクロ流体</td><td>SND75</td><td>マイクログルーブの長さ: 75 &mu;メートル</td></tr></tbody></table>

マイクロ流体デバイスにおける機能性神経筋接合を有するヒト運動ユニットの生成

Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

神経筋接合部 (NmJs) は、下の運動ニューロンの軸索と筋肉の収縮の関与を促進する筋肉の間の特殊なシナプスです。筋萎縮性側索硬化症(ALS)や脊髄筋萎縮症(SMA)などの運動ニューロン障害では、NMJが退化し、筋肉萎縮および進行性麻痺を生じる。NMJ変性の根本的なメカニズムは、主に翻訳可能な研究モデルの欠如のために不明である。本研究は、機能的なNJを搭載した人間のモーターユニットの汎用性と再現性のある インビトロ モデルを作成することを目的とした。そこで、ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)由来の運動ニューロンとヒト一次メソアンジオ芽細胞(MAB)由来のミオチューブを、市販のマイクロ流体デバイスで共培養した。流動分離されたマイクロコンパートメントを使用することで、細胞特異的な微小環境の維持を可能にし、マイクログルーブを介して細胞間接触を可能にする。化学式および体積勾配を適用することにより、ミオチューブ相互作用を促進するマイクログルーブを介した運動ニューロン-神経ニューライトの成長およびNmJの形成が刺激された。これらのNJは、筋管内で運動ニューロンシナプス前マーカーシナプトフィシン(SYP)とポストナプティックアセチルコリン受容体(AChR)マーカー α-ブンガロトキシン(Btx)の共局在化を通じて免疫細胞化学的に同定され、走査電子顕微鏡(SEM)を用いて形態学的に特徴付けられた。NJの機能性は、運動ニューロンの脱分極時にミオチューブ中のカルシウム応答を測定することによって確認された。標準的なマイクロ流体装置と幹細胞技術を用いて発生するモーターユニットは、健康と疾患のNmJに焦点を当てた将来の研究を支援することができます。

ヒトが誘導した多能性幹細胞由来の運動ニューロンを、機能的に活性な神経筋接合の形成をもたらすヒトの一次メソアンジオ芽細胞由来筋膜と共培養することにより、市販の微小流体デバイスにおけるヒト運動ユニットを生成する方法を説明する。

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...

この比較的簡単な方法は、健康と病気の運動ニューロンと神経筋接合に焦点を当てた研究を助けることができます。.このプロトコルは、標準的な幹細胞技術と、再現性を高める市販のマイクロ流体デバイスを使用しています。運動ニューロンと筋肉細胞の切断は、いくつかの神経筋疾患における初期の現象である。単純な人間化モデルは、この現象に対抗するための戦略を開発するのに役立つ可能性があります。このモデルは運動ニューロン障害、筋萎縮性側索硬化症を調べるのに使用しますが、このモデルは運動ユニットが不可欠な他の疾患にも使用できます。まず、輸送容器から70%の10ミリリットルから100%エタノールを含むペトリ皿に鉗子を使用してデバイスを10秒間殺菌します。鉗子を使った装置を紙に移し、層流で約30分間空気乾燥させます。デバイスを乾燥させたら、鉗子を使用して各デバイスを個々の10センチメートルのペトリ皿に移動させます。Poly-L-オルニチンまたはPLOでデバイスをコーティングするには、上部ウェルに100マイクロリットルのPLO溶液を加え、上部ウェルから下ウェルに流れる流体を観察します。次に、100マイクロリットルのPLO溶液を底ウェルに加え、マイクロ溝の反対側で繰り返します。1つの側に100マイクロリットルのPLO溶液を加えて、マイクロ溝をコーティングする装置の2つのミラー面の間にボリューム勾配を作成して終了します。摂氏37度と5%の二酸化炭素で3時間インキュベートする。3時間後、DPBSで5分間デバイスを洗います。PLOコーティングと同様の手順に従って、1ミリリットルラミニンおよび神経基底培地あたり20マイクログラムでデバイスをコーティングします。37°Cと5%の二酸化炭素で一晩デバイスをインキュベートします。翌日は200マイクロリットルのピペットを使用し、先端をチャネル開口部とは正反対の位置に置き、井戸からラミニンコーティングを除去します。DPBSをすべてのウェルに添加した後、セルシードのための室温で層流にDPBSを持つデバイスを残します。SCMシートをデバイスのサイズに切り、両側に数ミリメートルを残します。70%から100%エタノールの10ミリリットルを含むペトリ皿のデバイスとSCMシートを10秒間殺菌した後、鉗子を6ウェルプレートに、SCMシートを10センチメートルのペトリ皿に移して、ラミナーフローで空気乾燥させます。側面を約30分間乾燥させるために、デバイスを端に置きます。6ウェルプレートの各デバイスに、井戸ごとに1ミリリットルのPLO溶液を加えてデバイスをコーティングします。デバイスが、チャネルとマイクロ溝側が液体に下向きのPLOソリューションの上に浮かんでいるかどうかを確認します。10センチメートルのペトリ皿に10ミリリットルのPLO溶液を加えてSCMシートをコーティングし、鉗子を使用してSCMシートを液体に押し込みます。前に示したように、デバイスとSCMシートを3時間インキュベートします。3時間後、デバイスとSCMシートをDPBSで5分間2回洗浄し、続いて滅菌水で5分間別の洗浄を行います。その後、各SCMシートを個々の10センチメートルのペトリ皿に移して空気乾燥させます。層流で顕微鏡で作業している間、鉗子を使用して、チャネルとマイクロ溝を90度の角度でSCMシートに取り付け、すべての側面が整列していることを確認します。デバイスを軽く押し下げて、外縁だけでなく、井戸、チャネル、マイクロ溝の周りも確実に密封します。ラミニンでデバイスをコーティングするには、ラミナーフローの内側と顕微鏡の下で、200マイクロリットルピペットを使用して、ラミニンの溶液あたり20マイクログラムの100マイクログラムを上部ウェルに追加します。上面から下まで流れる流体を、井戸とチャンネルの周りを漏らすことなくよく観察します。その後、100マイクロリットルのラミニン溶液を底ウェルに加え、マイクロ溝の反対側で繰り返し、片側にラミニンを100マイクロリットル追加して仕上げ、デバイスの2つのミラー側の間に体積勾配を作成してマイクロ溝をコーティングし、一晩デバイスをインキュベートします。翌日、200マイクロリットルのピペットでウェルからコーティングを取り除き、先端をチャネル開口部の反対側に配置し、DPBSを全てのウェルに加えた後、セルシード用の室温で層流にDPBSを付けた装置を残します。マイクロ流体装置内の神経前駆細胞またはNPCをプレートするには、200マイクロリットルピペットを使用して、デバイス内のマイクロ溝の片側にある2つの井戸からDPBSを取り除きます。1デバイスあたり合計250,000NPCと60〜100マイクロリットルの10〜100マイクロリットルの運動ニューロン媒体を播種するために、右上ウェルでは、45度の角度でチャネル開口部に近い細胞懸濁液の種子半分。数秒間一時停止して、セルの懸濁液がチャネルを流れ、残りの半分のセル懸濁液を下のウェルに加えます。ペンを使用して、シード面をNPCまたは同等の装置としてマークし、顕微鏡なしでデバイスを容易に向き、細胞の取り付けのために5分間インキュベートします。次に、2つのNPCシードウェルを追加の10日の運動ニューロン培地でゆっくりと上げ、井戸あたり200マイクロリットルの総容量を増やします。200マイクロリットルピペットを使用して、新たに播種されたNPCとは反対のマイクロ溝の反対側にある2つの井戸からDPBSを取り除きます。その後、インキュベーション中に媒体の蒸発を防ぐために、デバイスの周りに10センチメートル皿あたり6ミリリットルのDPBSを加えます。媒体を変更するには、チャネル開口部の反対側のウェルウォールの下端に200マイクロリットルのピペットチップを配置することによって、NPCを持つ両方のウェルのメディアをゆっくりと取り除きます。強い媒体の流れがチャネル上の細胞を損傷するのを防ぐために、上と下の間を絶えずよく変化させることによって、新鮮な運動ニューロン媒体の50〜100マイクロリットルを各ウェルにゆっくりと加える。各ウェルに200マイクロリットルの培地が含まれるまで、このプロセスを繰り返します。運動ニューロン分化の17日目に、200マイクロリットルピペットでマイクロ溝の未播の側の運動ニューロン培地を取り除き、DPBSでウェルを洗浄する。細胞懸濁液の半分を上部ウェルに播種することにより、1デバイスあたり60〜100マイクロリットルの成長培地で、合計200,000人のヒト一次メソアンジオ芽細胞またはMABをシードします。メッキNPCの前に示したように、細胞懸濁液の残りの半分を底ウェルに播種する前に、細胞懸濁液がチャネルを流れるように数秒間一時停止します。その後、2つの新しいMABシードの井戸を追加の成長培地で上げ、実証されているように再びインキュベートします。運動ニューロン分化の21日目に化学戦術と体積勾配を開始するには、成長因子を含む運動ニューロン神経基底培地のウェルあたり200マイクロリットルをMyotubeコンパートメントに加え、運動ニューロンコンパートメントに成長因子を含まない運動ニューロン基底培地のウェルあたり100マイクロリットルを加える。細胞株をマイクロ流体デバイスで共培養する前に分化電位を評価することが重要です。MABsの融合指数を決定し、約8%が共培養に十分であると推定した。生成された運動ニューロン培養は、運動ニューロンマーカーに対して85〜95%陽性であった。神経筋接合部またはNJの量を特徴付け、定量化するために、神経ニューロンとシナプス前マーカーの間の共局在化の数は、神経線維層重鎖およびシナプトフィシンおよびシナプトフィシンおよびポストナプチレン受容体マーカーαブンガロトキシンとの間の共局在化の数を、各疾患スタックを通じてカウントされ、Myotubeの多数のミオシン重鎖標識されたMyotubesで正規化された。NJは、神経突起が1つの相互作用点で微妙なコリン受容体のクラスターに触れた単一の接触点NmJとして登場しました.または、神経突起がファンアウトし、より大きな表面上の微妙なコリン受容体クラスターに従事した複数の接触点NmJsとして.運動ニューロンの革新性の割合の定量化は、すべてのMyotubesがNmJを含んでいないことを示した。塩化カリウムによる運動ニューロンの活性化に際して、カルシウム流入がFluo-4標識されたMyotubesで観察され、これは、ミオチューブ内の神経ニューライトに機能的な接続を確認し、NMJブロッカーd-tubocurarineを加え、またはDTCをミオチューブコンパートメントに添加し、カルシウム流入を阻害した。このモデルで最大の成功を収めるには、細胞ラインの品質チェックを実行し、デバイスのチャネルで気泡が形成されないようにすることが非常に重要です。他のIPC直接細胞タイプと皿の神経筋接合を組み合わせることで、インビトロの状況をさらに模倣し、これはまた、これらの細胞タイプの役割を研究することができます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

マイクロ流体デバイスを使用して神経筋接合部の形成を実演しています。神経前駆細胞と筋前駆細胞は、デバイス内の異なるウェルに播種され、それぞれ運動ニューロンと筋管に成熟するまで放置されます。体積と化学的勾配の生成は、活動的な神経筋接合部の発達につながります。...

マイクロ流体デバイスを用いた神経筋接合部の生成

このビデオでは、まずヒトが誘導した多能性幹細胞を特殊な培地で培養してスフェロイドを形成し、次に特定の阻害剤を用いて運動ニューロンに分化させ、最後にマイクロ流体チップで培養して軸索を延長し、運動神経オルガノイドを形成するという運動神経オルガノイドの作り方を実演しています。...

マイクロ流体チップを用いたヒトiPS細胞由来運動神経オルガノイドの開発

この実験では、ヒトが誘導した多能性幹細胞から神経筋接合部を生成する方法を詳しく説明しています。段階的な分化プロセスを使用して、筋管ニューロンと運動ニューロンの発達とシナプス形成を促進し、機能的な神経筋接合をもたらします。...

人工ヒト誘導多能性幹細胞からの神経筋接合部のin vitro誘導

このビデオでは、機能的な神経筋接合部を評価する方法を示します。筋肉組織と運動ニューロンを含むバイオリアクターと蛍光顕微鏡法を用いて、ニューロン内の光感受性チャネルを刺激して電気信号を生成し、筋線維の収縮を引き起こします。...

同時光刺激とビデオ録画による機能的神経筋接合部の評価

軸索輸送は運動ニューロンの健康にとって重要なメカニズムです。このプロトコルでは、マイクロ流体室を用いた運動ニューロン軸索における酸性コンパートメントおよびミトコンドリアの軸索輸送を追跡するための詳細な方法を提供する。...

マイクロ流体室システムを用いた運動ニューロン培養におけるオルガネラの軸索輸送

ここでは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)からインビトロNJを生成するプロトコルを提供します。この方法は、成熟した形態と機能を有するMJを1ヶ月で単一のウェルで誘導することができる。結果として生じるNmJは、関連する疾患のモデル化、病理学的メカニズムの研究、または治療のための薬物化合物のスクリーニングに使用される可能性がある。...

ヒト人工多能性幹細胞から誘導されるインビトロ神経筋接合

このプロトコルは、組織培養チップ内のスフェロイドから伸びる強い軸索束の自発的な組み立てを通じて、ヒトiPS細胞由来運動神経オルガノイドを作製するための包括的な手順を提供する。...

三次元運動神経オルガノイド発生

本研究では、マイクロ流体系における直流(DC)パルス刺激によってのみ誘導される神経幹および前駆細胞(NPC)の分化に関するプロトコルを提示する。...

マイクロ流体デバイスにおける電界誘発神経前駆細胞分化

本稿は、収縮力やカルシウム処理分析を含む機能の機能アッセイにおいて、3Dヒト骨格筋微小組織および低侵襲下流部のアレイを生成するための詳細なプロトコルを記述する。...

ヒト骨格筋微小組織における骨格筋の健康の機能指標の評価

我々は、ヒト工学的骨格筋組織および光遺伝学的運動ニューロンを用いて神経筋接合機能を特徴付けるための、再現可能で自動化された、偏りのないイメージングシステムについて記載する。このシステムは、経時的な神経筋接続性の機能的定量化を可能にし、神経毒および重症筋無力症患者血清によって引き起こされる神経筋機能の低下を検出する。...

ヒト神経筋接合部の光遺伝学的モデルの工学と特徴付け

本プロトコルは、最小限のユーザー介入で数百の ショウジョウバエメラノガスター 胚を整列、固定化、および正確に圧縮することができるマイクロ流体システムの設計、製造、および特性評価について説明しています。このシステムは、刺激後分析のためのサンプルの高解像度イメージングと回収を可能にし、他の多細胞生物学的システムに対応するように拡張することができます。...

ハイスループットマイクロ流体圧縮システムによる多細胞生物のメカノ刺激

学ぶマイクロ流体デバイスを用いたヒト運動ユニット生成法。iPS細胞由来運動ニューロンと筋管の共培養により機能的神経筋接合を形成し、筋萎縮性側索硬化症などの運動ニューロン疾患研究に応用可能です。

マイクロ流体デバイスにおける機能性神経筋接合を有するヒト運動ユニットの生成

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