マイクロ流体デバイスにおける機能性神経筋接合を有するヒト運動ユニットの生成

この比較的簡単な方法は、健康と病気の運動ニューロンと神経筋接合に焦点を当てた研究を助けることができます。.このプロトコルは、標準的な幹細胞技術と、再現性を高める市販のマイクロ流体デバイスを使用しています。運動ニューロンと筋肉細胞の切断は、いくつかの神経筋疾患における初期の現象である。

単純な人間化モデルは、この現象に対抗するための戦略を開発するのに役立つ可能性があります。このモデルは運動ニューロン障害、筋萎縮性側索硬化症を調べるのに使用しますが、このモデルは運動ユニットが不可欠な他の疾患にも使用できます。まず、輸送容器から70%の10ミリリットルから100%エタノールを含むペトリ皿に鉗子を使用してデバイスを10秒間殺菌します。

鉗子を使った装置を紙に移し、層流で約30分間空気乾燥させます。デバイスを乾燥させたら、鉗子を使用して各デバイスを個々の10センチメートルのペトリ皿に移動させます。Poly-L-オルニチンまたはPLOでデバイスをコーティングするには、上部ウェルに100マイクロリットルのPLO溶液を加え、上部ウェルから下ウェルに流れる流体を観察します。

次に、100マイクロリットルのPLO溶液を底ウェルに加え、マイクロ溝の反対側で繰り返します。1つの側に100マイクロリットルのPLO溶液を加えて、マイクロ溝をコーティングする装置の2つのミラー面の間にボリューム勾配を作成して終了します。摂氏37度と5%の二酸化炭素で3時間インキュベートする。

3時間後、DPBSで5分間デバイスを洗います。PLOコーティングと同様の手順に従って、1ミリリットルラミニンおよび神経基底培地あたり20マイクログラムでデバイスをコーティングします。37°Cと5%の二酸化炭素で一晩デバイスをインキュベートします。

翌日は200マイクロリットルのピペットを使用し、先端をチャネル開口部とは正反対の位置に置き、井戸からラミニンコーティングを除去します。DPBSをすべてのウェルに添加した後、セルシードのための室温で層流にDPBSを持つデバイスを残します。SCMシートをデバイスのサイズに切り、両側に数ミリメートルを残します。

70%から100%エタノールの10ミリリットルを含むペトリ皿のデバイスとSCMシートを10秒間殺菌した後、鉗子を6ウェルプレートに、SCMシートを10センチメートルのペトリ皿に移して、ラミナーフローで空気乾燥させます。側面を約30分間乾燥させるために、デバイスを端に置きます。6ウェルプレートの各デバイスに、井戸ごとに1ミリリットルのPLO溶液を加えてデバイスをコーティングします。

デバイスが、チャネルとマイクロ溝側が液体に下向きのPLOソリューションの上に浮かんでいるかどうかを確認します。10センチメートルのペトリ皿に10ミリリットルのPLO溶液を加えてSCMシートをコーティングし、鉗子を使用してSCMシートを液体に押し込みます。前に示したように、デバイスとSCMシートを3時間インキュベートします。

3時間後、デバイスとSCMシートをDPBSで5分間2回洗浄し、続いて滅菌水で5分間別の洗浄を行います。その後、各SCMシートを個々の10センチメートルのペトリ皿に移して空気乾燥させます。層流で顕微鏡で作業している間、鉗子を使用して、チャネルとマイクロ溝を90度の角度でSCMシートに取り付け、すべての側面が整列していることを確認します。

デバイスを軽く押し下げて、外縁だけでなく、井戸、チャネル、マイクロ溝の周りも確実に密封します。ラミニンでデバイスをコーティングするには、ラミナーフローの内側と顕微鏡の下で、200マイクロリットルピペットを使用して、ラミニンの溶液あたり20マイクログラムの100マイクログラムを上部ウェルに追加します。上面から下まで流れる流体を、井戸とチャンネルの周りを漏らすことなくよく観察します。

その後、100マイクロリットルのラミニン溶液を底ウェルに加え、マイクロ溝の反対側で繰り返し、片側にラミニンを100マイクロリットル追加して仕上げ、デバイスの2つのミラー側の間に体積勾配を作成してマイクロ溝をコーティングし、一晩デバイスをインキュベートします。翌日、200マイクロリットルのピペットでウェルからコーティングを取り除き、先端をチャネル開口部の反対側に配置し、DPBSを全てのウェルに加えた後、セルシード用の室温で層流にDPBSを付けた装置を残します。マイクロ流体装置内の神経前駆細胞またはNPCをプレートするには、200マイクロリットルピペットを使用して、デバイス内のマイクロ溝の片側にある2つの井戸からDPBSを取り除きます。

1デバイスあたり合計250,000NPCと60〜100マイクロリットルの10〜100マイクロリットルの運動ニューロン媒体を播種するために、右上ウェルでは、45度の角度でチャネル開口部に近い細胞懸濁液の種子半分。数秒間一時停止して、セルの懸濁液がチャネルを流れ、残りの半分のセル懸濁液を下のウェルに加えます。ペンを使用して、シード面をNPCまたは同等の装置としてマークし、顕微鏡なしでデバイスを容易に向き、細胞の取り付けのために5分間インキュベートします。

次に、2つのNPCシードウェルを追加の10日の運動ニューロン培地でゆっくりと上げ、井戸あたり200マイクロリットルの総容量を増やします。200マイクロリットルピペットを使用して、新たに播種されたNPCとは反対のマイクロ溝の反対側にある2つの井戸からDPBSを取り除きます。

その後、インキュベーション中に媒体の蒸発を防ぐために、デバイスの周りに10センチメートル皿あたり6ミリリットルのDPBSを加えます。媒体を変更するには、チャネル開口部の反対側のウェルウォールの下端に200マイクロリットルのピペットチップを配置することによって、NPCを持つ両方のウェルのメディアをゆっくりと取り除きます。強い媒体の流れがチャネル上の細胞を損傷するのを防ぐために、上と下の間を絶えずよく変化させることによって、新鮮な運動ニューロン媒体の50〜100マイクロリットルを各ウェルにゆっくりと加える。

各ウェルに200マイクロリットルの培地が含まれるまで、このプロセスを繰り返します。運動ニューロン分化の17日目に、200マイクロリットルピペットでマイクロ溝の未播の側の運動ニューロン培地を取り除き、DPBSでウェルを洗浄する。細胞懸濁液の半分を上部ウェルに播種することにより、1デバイスあたり60〜100マイクロリットルの成長培地で、合計200,000人のヒト一次メソアンジオ芽細胞またはMABをシードします。

メッキNPCの前に示したように、細胞懸濁液の残りの半分を底ウェルに播種する前に、細胞懸濁液がチャネルを流れるように数秒間一時停止します。その後、2つの新しいMABシードの井戸を追加の成長培地で上げ、実証されているように再びインキュベートします。

運動ニューロン分化の21日目に化学戦術と体積勾配を開始するには、成長因子を含む運動ニューロン神経基底培地のウェルあたり200マイクロリットルをMyotubeコンパートメントに加え、運動ニューロンコンパートメントに成長因子を含まない運動ニューロン基底培地のウェルあたり100マイクロリットルを加える。細胞株をマイクロ流体デバイスで共培養する前に分化電位を評価することが重要です。MABsの融合指数を決定し、約8%が共培養に十分であると推定した。

生成された運動ニューロン培養は、運動ニューロンマーカーに対して85〜95%陽性であった。神経筋接合部またはNJの量を特徴付け、定量化するために、神経ニューロンとシナプス前マーカーの間の共局在化の数は、神経線維層重鎖およびシナプトフィシンおよびシナプトフィシンおよびポストナプチレン受容体マーカーαブンガロトキシンとの間の共局在化の数を、各疾患スタックを通じてカウントされ、Myotubeの多数のミオシン重鎖標識されたMyotubesで正規化された。NJは、神経突起が1つの相互作用点で微妙なコリン受容体のクラスターに触れた単一の接触点NmJとして登場しました.

または、神経突起がファンアウトし、より大きな表面上の微妙なコリン受容体クラスターに従事した複数の接触点NmJsとして.運動ニューロンの革新性の割合の定量化は、すべてのMyotubesがNmJを含んでいないことを示した。塩化カリウムによる運動ニューロンの活性化に際して、カルシウム流入がFluo-4標識されたMyotubesで観察され、これは、ミオチューブ内の神経ニューライトに機能的な接続を確認し、NMJブロッカーd-tubocurarineを加え、またはDTCをミオチューブコンパートメントに添加し、カルシウム流入を阻害した。

このモデルで最大の成功を収めるには、細胞ラインの品質チェックを実行し、デバイスのチャネルで気泡が形成されないようにすることが非常に重要です。他のIPC直接細胞タイプと皿の神経筋接合を組み合わせることで、インビトロの状況をさらに模倣し、これはまた、これらの細胞タイプの役割を研究することができます。