Name: タンパク質分析のためのマウス網膜における光受容体細胞区画の単離のための2つの剥離方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 学ぶマウス網膜桿細胞の外節と内節を分離する2つの剥離法。フィルターペーパーと凍結乾燥を用いた簡便な手法で、タンパク質解析のための細胞区画を効率的に単離し、光受容体の生理機能と病態を解明する。

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この作業は、NIH Grant EY12155、EY027193、およびEY027387からJCへの支援を受けました。原稿の校正をしてくれたSpyridon Michalakis博士(米国パサデナ州Caltech)とNatalie Chen氏(USC、米国ロサンゼルス)に感謝しています。また、著者が提供した映像を収集するために必要な機器を提供してくれたSeth Ruffins博士(USC、米国ロサンゼルス)とJanos Peti-Peterdi博士(USC、米国ロサンゼルス)にも感謝します。出典:Kasey Roseら、タンパク質分析のためのマウス網膜における視細胞区画の分離、分子神経変性、出版[2017]、[Springer Nature]。

<ol><li>Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+proteins+and+phototransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">G proteins and phototransduction.</a> Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).</li>
<li>Molday, R. S., Moritz, O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptors+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Photoreceptors at a glance.</a> Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).</li>
<li>Koch, K. W., Dell'Orco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+and+signaling+networks+in+vertebrate+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67(2015).</li>
<li>Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+light+intensity+threshold+for+retinal+damage+in+albino+rats+raised+under+6+lx%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx.</a> Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).</li>
<li>Brann, M. R., Cohen, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diurnal+expression+of+transducin+mRNA+and+translocation+of+transducin+in+rods+of+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina.</a> Science. 235 (4788), 585-587 (1987).</li>
<li>Philp, N. J., Chang, W., Long, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-stimulated+protein+movement+in+rod+photoreceptor+cells+of+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina.</a> FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).</li>
<li>Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+induced+shift+and+binding+of+S-antigen+in+retinal+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods.</a> Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).</li>
<li>Roof, D. J., Heth, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+transducin+in+retinal+rod+photoreceptor+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments.</a> Science. 241 (4867), 845-847 (1988).</li>
<li>Sokolov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+light-driven+translocation+of+transducin+between+the+two+major+compartments+of+rod+cells%3A+a+novel+mechanism+of+light+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation.</a> Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).</li>
<li>Lobanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transducin+translocation+in+rods+is+triggered+by+saturation+of+the+GTPase-activating+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).</li>
<li>Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin+translocation+is+induced+at+a+critical+threshold+of+visual+signaling+and+is+superstoichiometric+to+bleached+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).</li>
<li>Nair, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-dependent+redistribution+of+arrestin+in+vertebrate+rods+is+an+energy-independent+process+governed+by+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions.</a> Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).</li>
<li>Strissel, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recoverin+undergoes+light-dependent+intracellular+translocation+in+rod+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).</li>
<li>Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-driven+translocation+of+signaling+proteins+in+vertebrate+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors.</a> Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).</li>
<li>Majumder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transducin+translocation+contributes+to+rod+survival+and+enhances+synaptic+transmission+from+rods+to+rod+bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).</li>
<li>Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+photoreceptors+die+%28and+why+they+don%27t%29%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Why photoreceptors die (and why they don't).</a> BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).</li>
<li>Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+susceptibility+to+light+damage+in+an+arrestin+knockout+mouse+model+of+Oguchi+disease+%28stationary+night+blindness%29%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness).</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).</li>
<li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin-1+expression+level+in+rods%3A+balancing+functional+performance+and+photoreceptor+health%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health.</a> Neuroscience. 174, 37-49 (2011).</li>
<li>McConnell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+of+retinal+outer+segment+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The isolation of retinal outer segment fragments.</a> The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).</li>
<li>Tsang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+target+enzyme+in+deactivation+of+photoreceptor+G+protein+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo.</a> Science. 282 (5386), 117-121 (1998).</li>
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<li>Guido, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+obtain+retinal+cell+preparations+highly+enriched+in+specific+cell+types.+Suitability+for+lipid+metabolism+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research.+Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies.</a> Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).</li>
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<li>Wolbring, G., Cook, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+and+characterization+of+protein+kinase+C+from+bovine+retinal+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments.</a> European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).</li>
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<li>Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+rhodopsin%2Farrestin+complex+leads+to+retinal+degeneration+in+a+transgenic+mouse+model+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).</li>
<li>Chen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+photoresponses+and+light-induced+apoptosis+in+rods+lacking+rhodopsin+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).</li>
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<li>Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+forms+of+human+rhodopsin+kinase+%28GRK1%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1).</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).</li>
<li>Newton, A. C., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+protein+kinase+C+in+the+phosphorylation+of+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).</li>
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<li>Sokal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+kinase+C+isozymes+responsible+for+the+phosphorylation+of+photoreceptor-specific+RGS9-1+at+Ser475%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).</li>
<li>Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+photoreceptor+cell+compartments+in+mouse+retina+for+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis.</a> Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28(2017).</li>
<li>Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+degeneration%3A+genetic+and+mechanistic+dissection+of+a+complex+trait%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait.</a> Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).</li>
</ol>

著者らは、競合する利害関係はないと宣言している。

多くの網膜疾患は桿体視細胞に影響を及ぼし、桿体死、そして最終的には完全な視力喪失につながります37。ヒト網膜変性の遺伝的および機械的起源のかなりの部分は、長年にわたって多数のマウスモデルで首尾よく再現されてきた。その文脈において、個々の桿体細胞下区画を小さなマウス網膜から容易かつ選択的に分離する能力は、網膜疾患の局在する生化学的および分子的基盤の理解を大幅に強化するであろう。さらに、神経網膜の層状の性質は、桿体光受容体のユニークで高度に偏光された配置と相まって、選択的剥離による桿体区画の単離を可能にする。この原稿は、イムノブロッティングのために桿体視細胞の個々の細胞下区画を単離するために使用される2つのプロトコールを記述する。どちらの方法も、既存の接線方向断面法9と比較してかなり高速で技術的に困難ではないだけでなく、密度勾配を使用したROSの一般的な生化学的単離よりもサンプルサイズも大幅に小さくする必要があります19。このようなROS勾配精製技術は、十分なROSを確実に回収するために8〜10匹の...

神経網膜の最外層にしっかりと詰め込まれた桿体視細胞は、薄暗い光の視覚の不可欠な部分です。忠実な光子カウンターとして機能するために、ロッドは、光変換と呼ばれるGタンパク質ベースのシグナル伝達経路を利用して、単一光子捕捉に対する迅速で増幅された再現可能な応答を生成する。光に対するこの応答は、最終的に原形質膜における電流の変化を引き起こし、その後、視覚系の残りの部分に信号を送る1。その名前が示すように、各桿体細胞は明確な棒状の形状を有し、外側セグメント(OS)、内側セグメント(IS)、細胞体(CB)、およびシナプス末端(ST)からなる高度に分極した細胞形態を示す。各細胞下区画には、特定のタンパク質機構(膜結合および可溶性)、生体分子的特徴、および視覚的光伝達、一般的なハウスキーピングおよびタンパク質合成、シナプス伝達などの重要な役割を果たすタンパク質複合体があります2,3。
30年以上前、細胞内タンパク質、特にトランスデューシン(OSから離れる)とアレスチン(OSに向かう)の光依存的な相互運動が最初に観察されました4,5,6,7。早い段階で、この観察された現象は、エピトープマスキングに対する免疫組織化学の脆弱性のために、懐疑的に受け止められました8。2000年代初頭、刺激依存性のタンパク質転座は、厳格で困難な物理的切片技術を用いて確認された9。凍結したフラットマウントげっ歯類網膜の連続接線切片化とそれに続くイムノブロッティングにより、トランスデューシン9、10、アレステイン11、12、およびrecoverin13はすべて、光に応答して細胞内再分布を受けることが明らかになった。これらの重要なシグナル伝達タンパク質の光駆動転座は、光変換カスケードの感受性を調節するだけでなく9,14,15だけでなく、光損傷に対する神経保護も可能であると考えられている16,17,18。桿体における光駆動タンパク質輸送は、桿体細胞の生物学および生理学にとって非常に重要であるように思われるので、タンパク質分布を決定するために異なる細胞内区画の単離を可能にする技術は貴重な研究ツールである。
現在、桿体細胞下区画を単離することを目的としたいくつかの方法がある。しかしながら、これらの方法は、長くて再現が困難であり得るか、またはかなりの量の網膜分離物を必要とする。ロッドアウターセグメント(ROS)調製物は、密度勾配遠心分離19を介して、例えば、網膜ホモジネートからROSを分離するために一般的に使用される。この方法はウェスタンブロットに広く使用されているが、この手順は非常に時間がかかり、最低8〜12匹のマウス網膜20を必要とする。一方、凍結マウスおよびラット網膜の直列接線切片化は、OS、IS、CB、およびST9、11、13を単離する際に首尾よく実施されている。しかし、この方法は、接線切除の前に網膜層を整列させるために、小さくて高度に湾曲したマウス網膜を完全に平坦化する必要があるため、技術的に困難である。視覚系の疾患を再現するマウスモデルやトランスジェニックマウスは数多く存在するため、個々の桿体コンパートメントを確実に、迅速に、そして容易に分離する技術の創出は、各特殊なコンパートメントで起こる生理学的プロセスと、健康および疾患における視覚プロセスの根底にあるメカニズムを明らかにする上で有望である。
これらの調査を容易にするために、我々は、現在のプロトコルよりも容易に桿体細胞下区画を分離する2つの剥離方法を説明する。第1の剥離方法は、パッチクランプ記録21のために蛍光標識されたバイポーラ細胞を露出させる技術から適合し、セルロース濾紙を使用して、生きた単離されたマウス網膜からROSを順次除去する(図1)。第2の方法は、chick22およびfrog23網膜から3つの一次網膜細胞層を単離する手順から適合し、粘着テープを使用して凍結乾燥網膜からROSおよび桿体内部セグメント(RIS)を除去する(図2)。どちらの手順も1時間で完了でき、かなりユーザーフレンドリーです。我々は、C57BL/6Jマウスからの暗適応および光曝露網膜を利用して、ロッドトランスデューシン(GNAT1)およびアレスチン(ARR1)の光誘発転座を実証することによって、ウェスタンブロットに対するこれら2つの分離プロトコルの有効性の検証を提供する。さらに、テープ剥離法を用いて、我々の技術が免疫細胞化学(ICC)によって取得されたタンパク質局在データとウェスタンブロットとの間の不整合を調べ、対処するために使用することができるという追加の証拠を提供する。具体的には、我々の技術は、1)プロテインキナーゼC-α(PKCα)アイソフォームが双極性細胞だけでなく、マウスROSおよびRISにも低濃度ではあるが24,25存在し、2)ロドプシンキナーゼ(GRK1)が単離されたOSサンプル中に主に存在することを示した。これらのデータは、特定のロッドタンパク質とレチナールタンパク質を分離および定量するための2つの剥離技術の有効性を示しています。

<table><tbody><tr><td>チューブキャップアダプターを装備した100mLラボ用またはメディアボトル</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>100% O2タンク</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>1000mLボトルトップフィルター、PESフィルター素材、0.22 &mu;m</td><td>ジェネシー サイエンティフィック</td><td>25-235</td><td></td></tr><tr><td>4X SDS サンプルバッファー</td><td>ミリポア シグマ</td><td>70607-3</td><td></td></tr><tr><td>50 mL ファルコン チューブ</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>95% O2 and 5% CO2 タンク</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ames'L-グルタミンを含む中程度、重炭酸塩なし</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (99%、二水和物)</td><td>Sigma</td><td>C-3881</td><td></td></tr><tr><td>Drierite (無水硫酸カルシウム、>98% CaSO4、>2% CoCl2)</td><td>WA Hammond Drierite Co Ltd</td><td>21005</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Easy-Grip Petri Dish (ポリスチレン、35 x 10 mm)</td><td>Falcon-Corning</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン イージーグリップ ティッシュ培養ディッシュ (60 x 15 mm)</td><td>ファルコンコーニング</td><td>08-772F</td><td></td></tr><tr><td>フェザーメス (No.10 40 mm)</td><td>VWR</td><td>100499-578</td><td></td></tr><tr><td>フェザーメス (No.11 40 mm)</td><td>VWT</td><td>100499-580</td><td></td></tr><tr><td>KCl (99%)</td><td>Sigma</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>キンブル コンテス ペレット 乳棒</td><td>Σ</td><td>z359971</td><td></td></tr><tr><td>Labconco 急速凍結フラスコ</td><td>Labconco</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LN2 (液体窒素) + デュワーフラスコまたは類似の真空フラスコ</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M-9272</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q/脱イオン水</td><td>EMD Millipore</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (粉末))</td><td>J.T. Baker</td><td>4062-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (crystal)</td><td>EMD Millipore</td><td>Sx0420-3</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Amresco</td><td>0865</td><td></td></tr><tr><td>OmniPur EDTA</td><td>EMD</td><td>4005</td><td></td></tr><tr><td>OmniPur HEPES, 遊離酸</td><td>EMD</td><td>5320</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>レイノルズラップアルミホイル</td><td>レイノルズブランド</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>スコッチマジックテープ (12.7 mm x 32.9 m)</td><td>スコッチ-3M</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D67501</td><td></td></tr><tr><td>Spectrafuge ミニ遠心分離機</td><td>Labnet International, Inc</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>組織インキュベーションチャンバー(購入またはカスタムメイド)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>J.T.Baker</td><td>4103-02</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Signma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>VirTis 卓上型 2K 凍結乾燥機または同等の機械</td><td>SP Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 &mu;m)</td><td>VWR</td><td>28310-015</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (直径 9 cm、細孔サイズ 11 &mu;m)</td><td>Whatman/GE Healthcare</td><td>1001-090</td><td></td></tr><tr><td>広口径トランスファーピペット、Global Scientific</td><td>VWR</td><td>76285-362</td><td></td></tr></tbody></table>

タンパク質分析のためのマウス網膜における光受容体細胞区画の単離のための2つの剥離方法

Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

桿体光受容体は、異なる区画を有する高度に偏光された感覚ニューロンである。マウスの桿体は、長く(〜80μm)および薄く(〜2μm)、網膜の最外層である感光体層に横方向に充填され、類似の細胞下区画の位置合わせをもたらす。伝統的に、凍結したフラットマウント網膜の接線方向切片化は、異なる桿体区画内のタンパク質の動きおよび局在を研究するために使用されてきた。しかし、桿体優性マウス網膜の高い曲率は、接線切除を困難にする。コンパートメント間のタンパク質輸送の研究に動機づけられて、我々は、ウエスタンブロット用のロッド外側セグメント(ROS)および他の細胞下コンパートメントを確実に単離する2つの剥離方法を開発した。当社の比較的迅速かつ簡単な技術は、濃縮された細胞内特異的画分を提供し、正常な棒状体における重要な光受容体タンパク質の分布および再分布を定量的に測定する。さらに、これらの単離技術は、健康な網膜および変性網膜の両方内の他の細胞層のタンパク質組成を単離および定量的に調査するために容易に適合させることもできる。

本戦略は、ウェスタンブロット分析のために特定の桿体細胞下区画間のタンパク質を単離および分析するための比較的迅速かつ簡単な方法を提供するために開発された。我々は、2つの逐次剥離技術(図1および図2)に続いてイムノブロッティングを適用し、これらの方法を使用して、暗適応動物および光適応動物の両方におけるロッドトランスデューシン(GNAT1)およびアレスチン(ARR1)の既知の分布を確実に検出できることを実証した。他の細胞層からの汚染なしに桿体細胞下区画を正確に単離する上での我々の2つのプロトコルの有効性を検証するために、イムノブロットはシトクロムC(Cyt C)、アクチン、およびGß5S/Gß5L26に対する抗体でプローブされた。使用した抗体および希釈液のリストを表1に示します。Cyt Cおよびアクチンは、近位網膜には豊富なタンパク質であるがROSには存在しないため、ROS純度を示した。GNAT127のGTPase活性化タンパク質(GAP)の成...

このプロトコルは、タンパク質分析のためにマウスの桿体光受容体の細胞内区画を単離するための2つの技術を提示する。第1の方法は、生きた網膜とセルロース濾紙を使用してロッドの外側セグメントを分離し、第2の方法は凍結乾燥された網膜と粘着テープを使用してロッドの内側と外側のセグメント層を剥離する。

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...

ここで実証された2つの剥離技術は、個々の桿体細胞下区画を単離し、健康な桿体および罹患した桿体の各特殊区画で起こる重要な生理学的プロセスを明らかにするのを助けることができる。マウス網膜から異なる桿体細胞区画を単離することは困難な場合があります。これらの簡単な技術は、安価で一般的なラボ材料を使用して、タンパク質分析のためにロッド細胞下コンパートメントを確実に分離します。まず、100%酸素で泡立てたエイムズHEPESバッファーで満たされたペトリ皿にろ紙を置きます。次いで、ワイドボア転写ピペットを用いて、2〜3ヶ月齢のC57 Black 6Jマウスから解剖した1つの網膜長方形を移す。仕切られた網膜を凹ませ、光受容体が皿の底に向かって下を向いていることを確認します。次に、ピンセットを使って、半分になった網膜の側面を軽くつかみ、ろ紙の上で動かします。網膜が中央に揃ったら、半分になった網膜がろ紙に触れて桿体外側セグメントを作成するか、ROSがろ紙付着するようにろ紙を上方に動かします。網膜が付着したろ紙を慎重に持ち上げて、エイムズHEPESバッファーから取り出します。ろ紙の底面をペーパータオルの上に置き、2~3回軽くたいて乾かします。網膜のあるろ紙の側面にエイムズHEPESを一滴加え、もう一度ペーパータオルの上にろ紙を載せて乾かします。次に、網膜の入ったろ紙をシャーレに戻し、ピンセットを使って、半分になった網膜のすべての端をそっと押し上げ、ろ紙から四方を離します。網膜をろ紙から繊細に剥がし、網膜の極端な周囲だけに触れて、その構造的完全性を維持します。次に、シャーレからろ紙を持ち上げ、ペーパータオル上の余分な液体を取り除き、網膜と接触する側がペーパータオルに接触しないようにする。部分ROS層を含むろ紙を氷上の標識チューブに入れ、剥離した網膜をエイムズHEPES緩衝液に沈めておく。この半分になった網膜の剥離工程を約7~8回繰り返し、ROS層全体を除去します。各剥離後、ろ紙を同じチューブに入れて、1つの半分の網膜から単離されたすべてのROSを結合する。すぐに使用できるように、分離されたROSのすべてのろ紙の皮を含むチューブを氷の上に保管してください。ピンセットを使用して、残りの剥離した網膜を適切なラベルの付いたチューブに移し、すぐに使用できるようにチューブを氷の上に保ちます。凍結乾燥用の網膜サンプルを調製するには、ろ紙片を置き、半分にした網膜を冷たいリンゲル緩衝液で満たされたペトリ皿に移す。次にピンセットを使って網膜を上向きになるように丁寧に裏返し、ろ紙の上に載せるように動かします。ろ紙の端を上方に持ち上げて、半分になった網膜がろ紙に触れるようにします。引き続きろ紙をリンガーの溶液から取り出します。その後、ろ紙の底面をペーパータオルの上に置き、2~3回丁寧に軽く叩いて余分な液体を取り除きます。次に、ピンセットでろ紙を拾い上げ、網膜のあるろ紙の側面に冷たいリンガーの滴を加えます。もう一度、ペーパータオルの上にろ紙を置き、余分な液体を取り除きます。付着した各網膜およびろ紙サンプルを、すべてのサンプルを凍結する準備ができるまで、冷たいリンゲルで満たされたペトリ皿に保管する。次に、ピンセットを使用して、各サンプルをコールドリンガーのバッファーから持ち上げ、ピンセットが濾紙の端のみに接触するようにして、網膜の半分を避けます。各ろ紙の底面をペーパータオルの上に置き、余分な液体を除去した。その後、網膜が付着しているろ紙の側面に冷たいPBSを一滴加え、再度ペーパータオルにろ紙を軽くたたきます。すべてのろ紙片をシャーレに入れ、糸くずの出ないティッシュペーパーを使用して、ろ紙を囲む余分な液体を吸い取ります。次に、皿全体をアルミホイルでしっかりと包み、アルミホイルの端が固定され、ペトリ皿の底にスムーズに押し込まれていることを確認します。アルミホイルの蓋に0.1~0.2ミリメートルの穴を数個穿刺します。次に、金属トングを用いて、アルミ箔で覆われたシャーレを液体窒素に徐々に下げる。凍結乾燥の準備が整うまで、サンプルを液体窒素に保管してください。凍結乾燥のために、アルミ箔で覆われたペトリ皿を凍結乾燥フラスコに入れ、製造業者のプロトコルに従って凍結乾燥機に取り付ける。網膜を30分間凍結乾燥する。凍結乾燥後、凍結乾燥された網膜の上に小さなテープを慎重に敷き詰め、ピンセットでわずかな圧力をかけて感光体層と結合するようにして、ロッドの外側と内側のセグメントを収集します。テープをゆっくりと剥がし、ROSとRISの両方がテープに付着していることを確認します。薄い白色のフィルムが破断面に存在する。これが RIS です。この RIS を分離するには、別のテープを配置し、破断面にテープを押し下げます。次に、オレンジピンク色の層のみを含むテープ片をROSとラベル付けされた微量遠心管に入れ、薄い白色層を有するテープ片をRISとラベル付けされた別のチューブに入れる。次に、テープを用いて、厚く白い層を剥離してろ紙上に位置する残りの網膜組織を採取する。次に、この分離液をOISとラベルの付いたチューブに入れます。同じ日に使用する場合は、凍結乾燥網膜から単離した層を室温で保存する。暗適応動物では、GNAT1とARR1の分布は既知の暗状態分布と密接に一致し、GNAT1信号はROS分離で目に見えて最も強く、ARR1信号はROS分離でより堅牢でした。GNAT1およびARR1シグナルの定量化は、ROSおよびROSサンプルにおけるGNAT1およびARR1の暗光条件間に有意差を示した。暗適応サンプルと明適応サンプルの両方で、Gビート5S、シトクロムC、およびアクチンシグナルはROSサンプルから除外され、他の細胞層からの汚染がないことが実証されています。さらに、Gβ5LシグナルはROSサンプルにおいて明瞭に視認できた。無傷で剥離した凍結乾燥網膜の表面の走査型電子顕微鏡観察は、粘着テープで剥離する前に、無傷の凍結乾燥網膜の表面が特徴的な円筒状ROSに密接に一致することを示した。最初のテープ剥離の後、ROSおよびRISは完全に除去されたように見え、残りの剥離された凍結乾燥網膜の表面に存在する均一な核層によって証明された。その後テープは剥離し、剥離層のフリー表面からRISを除去した。この技術はまた、GRK1免疫反応性が光曝露網膜中のROSサンプルにおいて最も強く、OISサンプルでは存在しないことを実証した。逆に、ROSおよびRISサンプルは、免疫蛍光染色によってROSまたはRISでは一般に検出されないPKCアルファに対するかすかなシグナルを示した。最後に、最適でないテープ剥離は、わずかに汚染されたサンプルを生成する可能性がある。RISサンプルはいくつかのOISサンプルで汚染され、Gβ5LおよびGベータ5Sバンドの両方、およびより高いPKCアルファ信号を生成した。網膜を凍結乾燥するときは注意が必要です。不適切な凍結乾燥技術を使用すると、網膜が融解し、テープで異なる桿体細胞層を単離することが不可能になることがあります。このテープ剥離法をqRT-PCRと組み合わせて使用すると、網膜の残りの部分から光受容体転写産物を分離することができました。

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