Name: 合成生物学と天然物アプリケーションのための高収量スト レプトマイス 転写翻訳ツールキット (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 学ぶ Streptomyces venezuelae の無細胞転写翻訳システムを用いた高収量タンパク質合成法。高GC含量遺伝子のヘテロログ発現と代謝酵素研究に応用可能な簡便なワークフローです。

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著者らは、PSFを持つPDRAとしてのSJMのためのEPSRC[EP/K038648/1]の研究支援を認めたいと思います。ウェルカムトラストは、インペリアル・カレッジ・ロンドンのPSFとSJMのためのISSFフェローシップを後援しました。王立協会研究助成金[RGS\R1\191186];ケント大学のSJMに対するウェルカムトラストSEEDアワード[217528/Z/19/Z]。そして、グローバルチャレンジ研究基金 (GCRF) ケント大学のKCのための博士号の奨学金.

注:GYM培地と寒天プレート、S30AおよびS30B洗浄バッファのレシピについては、 表1 と 表2 を参照してください。
1. ソリューションの作成と一般的なガイダンス
<ol><li>例外が記載されていない限り、すべての溶液、細胞(成長後)、および細胞抽出物を調製後に氷上に保管してください。</li>
	<li>1 M Mg-グルタミン酸、4 M K-グルタミン酸、40%(w/v)PEG 6000、室温で1 g/mLポリビニルスルホン酸、および-80°Cで他のすべての株式を保管します。 化学分解を避けるために、フリーズ融解サイクルの数を最小限に抑えます。</li>
	<li>3-PGA(pH調整が必要)などのエネルギー溶液ストック( 表3参照)の調製については、 大腸菌 TX-TLプロトコル41に記載のガイダンスに従ってください。 注:すべての成分はddH2Oに完全に溶解し、-80°Cの冷凍庫にアリコートとして保存されます。</li>
	<li>氷上の個々の在庫またはエネルギーソリューション(後述)を解凍します。42°Cでアミノ酸ストックを熱し、渦を〜15〜30分間加熱し、すべてのアミノ酸を可溶化します。</li>
	<li>一部のアミノ酸(L-Cys、L-Tyr、L-Leu)が氷上で沈殿するので、安静時間を最小限に抑えながら、この溶液を室温に残し、渦を使用して溶解します。</li>
	<li>ストックソリューションと水の計算されたボリューム(表3)を追加し、渦を使用してよく混ぜます。</li>
	<li>Aliquotは、エネルギー溶液をチューブあたり20〜100 μLアリコートとして、または望ましいように氷上に、さらに使用するまで-80°Cで保存する。</li>
</ol>2. ベネズエラATCC 10712細胞の調製
<ol><li>1日目-メディア/バッファ調製および夜間プレカルチャー<ol>
<li> 表1に記載されているように、2 Lバッフルフラスコに1Lの無菌GYM液体培地を調製する。機器/化学/試薬のソースについては、材料表を参照してください。</li>
		<li>表1に記載されているように、250 mLのエルレンマイヤーフラスコに1 x 50 mLの無菌GYM液体培地を調製する。</li>
		<li>1 M HEPES-KOH pH 7.5、1M MgCl2の100 mL、および4 M NH4Cl溶液の500 mLの100 mLを準備して、S30Aの1 Lおよび1 LのS30B洗浄バッファーを作ります。レシピについては 、表 2 を参照してください。</li>
		<li>一晩のプレカルチャーを準備します。250 mL のエルレンマイヤーフラスコで、20 mL の無菌体 50 mL を 28 °C に 30 分間事前に温めます。</li>
		<li>S. ベネズエラ ATCC 10712 の単一コロニーを GYM 寒天プレートから GYM 液体培地の 50 mL を温め、28 °Cでインキュベートし、200 rpmで 16 時間 (一晩前培養) します。</li>
	</ol></li>
	<li>2日目 -昼間のプレカルチャーと主な成長文化を準備します。<ol>
<li>28°Cで250 mLのエルレンマイヤーフラスコで無菌ジム液体培地の50 mLを30分間温める前に。</li>
		<li>一晩前培養の1 mLを、GYM液培地の50mLをあらかじめ温め、28°Cでインキュベートし、200rpmで8時間(昼間のプレカルチャー)に移す。</li>
		<li>この成長期間の後、1 mL(1 cmパス長)のプラスチックキュベットで無菌のGYM培地と1:10希釈を使用して分光光度計のOD600 を点検してください。 注: OD600 は少なくとも 3-4 に達しているはずです。低成長がある場合は、手順 2.2.1 - 2.2.2 を繰り返すことをお勧めします。</li>
		<li>2 Lバッフルフラスコ中の液体GYM培地の1Lに昼間前培養の0.25mLのサブカルチャー。</li>
		<li>28°Cで一晩振り、200rpmで14時間振る。</li>
	</ol></li>
	<li>3日目-収穫細胞<ol>
<li>前のインキュベーション期間(14時間)の後に、本培養物のOD600 を記録する。OD600測定用の新鮮なGYM培地で一晩培養1:10 を希釈します。 注: OD600 は、この段階で 3.0 から 4.0 に達しているはずです。</li>
		<li>OD600<3.0の場合、揺れ速度を250〜300rpmに上げ、OD600の3.0に達するまで成長します。追加の2時間(合計で16 h)を超えて成長します。</li>
		<li>OD600>3.0の場合は、培養物を遠心分離容器に移し、湿った氷の上で30分間急速に冷却します。</li>
		<li>細胞培養が氷の上で冷めるのを待っている間に、 表1に記載されているように、新鮮な1 Mジチオトレイトール(DTT)、S30AおよびS30Bバッファーの4 mLを調製し、氷の上に保管します。化学/試薬のソースについては 、材料表 を参照してください。</li>
		<li>空の50 mL遠心分離管を予量秤し、-20°Cで予冷します。</li>
		<li>氷上のS30Aバッファーの1 Lに1 M DTTの2 mLを加え、よく混ぜます。 メモ:DTTをS30AおよびS30B洗浄バッファに追加してから使用してください。</li>
		<li>6,000× g、4°C、10分で遠心分離機細胞を、迅速かつ単一の動きで慎重に上清を捨てます。 注:ペレットが乱れている場合は、残留GYM培地で細胞保持を最大化し、プロトコルを継続します。</li>
		<li>S30Aバッファーの500 mLを加え、細胞塊が均一に分散するまで遠心分離ボトルを激しく振って細胞を再懸濁する。</li>
		<li>6,000× g、4°C、6分で細胞を遠心分離し、上清を丁寧に捨てます。 注: この時点では細胞ペレットは固まるでしょうが、一部のセルはサスペンションに残ります( 図 1 を参照)。2.3.7 で説明されているように扱い、できるだけ多くのセルを保持します。</li>
		<li>ステップ 2.3.8~ 2.3.9 を繰り返します。</li>
		<li>氷上のS30Bバッファーの1 Lに1 M DTTの2 mLを加え、よく混ぜます。セルに500mLのS30Bバッファを加えます。ステップ 2.3.9 を繰り返します。</li>
		<li>セルペレットをS30Bバッファーの10 mLに再懸濁し、あらかじめ計量した50 mL遠心分離管に移します。必要に応じて、S30Bバッファの追加5〜10 mLで残留セルを転送します。S30Bで50mLに充填してください。</li>
		<li>遠心分離細胞は6,000× g、4°C、10分、上清を丁寧に捨てます。</li>
		<li>ステップ 2.3.13 を繰り返します。</li>
		<li>残りのS30B上清を100-200 μLピペットで慎重に吸引します。</li>
		<li>湿った細胞ペレットの重量を量る。 注:一晩のGYM培養物の1L(OD600 = 3.0)の典型的な湿潤細胞ペレット重量は〜4.5gである。</li>
		<li>1 g の湿潤細胞ごとに、0.9 mL の S30B バッファーを加えます。パスツールピペットまたは渦を使用して細胞を再中断します。</li>
		<li>遠心分離機は、細胞を沈下するために500× g まで短時間(〜10s)まで。 注:この時点でプロトコルを一時停止することができ、セルは液体窒素またはドライアイスのいずれかで凍結し、 安全のために、顔の盾や手袋を含む液体窒素を扱うときに適切な個人用保護具(PPE)を着用してください。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 超音波処理による細胞のリシスは、粗細胞抽出物を得る
注:この段階では、ユーザーは、1 mL分数(オプション1)または50 mLチューブ(オプション2)の大きなセルサスペンション(5 mL)のいずれかで超音波処理によって細胞を破壊することを選択することができます。両方のオプションは、前の収穫および洗浄工程中の細胞の損失により細胞懸濁液の最終容積が変化する可能性があるため、再現性を確保するために以下に詳述されている。新しいユーザーは、最初にオプション 2.1 を試してプロトコルを確立する必要があります。
<ol><li>1 mL 分数で超音波処理を行うセルのリシス<ol>
<li>1 mL ピペットチップ(先端の端を切り落として穴の大きさを大きくする)を使用して、細胞懸濁液の 1 mL を 2 mL マイクロ遠心チューブに移します。 注:細胞が凍結している場合は、細胞のリシス前に、ペレットを含む50mLチューブをぬるま湯にすばやく解凍します。ペレットが解凍し始めるとすぐにチューブを湿った氷に移し、10分間冷やします。</li>
		<li>各マイクロ遠心チューブを氷水のビーカーに入れ、プラスチック製のチューブラックを使用して超音波処理用のチューブを保持します。 注:細胞抽出物の過熱に対する感度が高いため、タンパク質の沈殿や酵素活性の低下を防ぐためにチューブがウォームアップしないようにすることが重要です。</li>
		<li>直径3mmの先端を備えた超音波式プローブを使用し、70%(v/v)エタノールと二重蒸留水(ddH2O)で洗浄してください。ソニエーターチップを液体表面から約1cm下にするまでセル懸濁液に下げます。</li>
		<li>超音波処理器に次の設定を入力します:20 kHz周波数、65%の振幅、10 sパルスオンタイム、10 sパルスオフ時間、1分の総超音波処理時間。</li>
		<li>超音波処理プロトコルを実行します。細胞が均等に超音波処理されていることを確認するために、最初の2つの休息サイクル中にチューブを上下に動かします。エネルギー入力を記録します。 注: 安全のために、超音波処理中に適切な聴覚保護を着用してください。細胞が破壊されるにつれて粘度が低下し、淡いクリーム湿った細胞ペレットは均質な褐色の液体に変わるはずです。推奨エネルギー入力は、湿潤細胞のmLあたり240Jです。細胞が部分的にしか取り除かれなければ、懸濁液は、特にチューブの側面に、細胞の粘性塊でクリーム色で表示されます。</li>
		<li>チューブを2〜3回反転し、細胞が完全に破壊されるまで頻繁に混合し、追加の1つまたは2つの10のサイクルのための超音波処理を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 mL 細胞懸濁液を超音波処理して細胞リシス<ol>
<li>細胞が凍結された場合、細胞のリシス前に振盪して、ペレットを含む50mLチューブをぬるま湯に速やかに解凍する。ペレットが解凍し始めるとすぐにチューブを湿った氷に移し、10分間冷やします。</li>
		<li>細胞を沈下するために500 x g でチューブを簡単に回転させます。</li>
		<li>超音波処理のための氷水のビーカーに50 mLチューブを置きます。 注:細胞抽出物の過熱に対する感度が高いため、タンパク質の沈殿や酵素活性の低下を防ぐためにチューブがウォームアップしないようにすることが重要です。</li>
		<li>直径6mmの先端を備えた超音波式プローブを使用し、70%(v/v)エタノールとddH2Oで洗浄します( 図1の6mmプローブの視覚的な概略図を参照)。ソニエーターチップをセル懸濁液(〜5 mL)に下げ、液体表面から約1cm下に下げます。</li>
		<li>超音波処理器に次の設定を入力します:20 kHz周波数、65%振幅、10秒パルスオンタイム、10秒パルスオフ時間、1分の合計超音波処理時間/mmmLウェットセル(合計5分)。</li>
		<li>超音波処理プロトコルを実行します。細胞が均等に超音波処理されていることを確認するために、最初の2つの休息サイクル中にチューブを上下に動かします。 注: 安全のために、超音波処理中に適切な聴覚保護を着用してください。細胞が破壊されると粘度が低下し、淡いクリーム湿った細胞ペレットは均質な褐色の液体に変わるはずです。エネルギー入力を記録します。湿細胞のmLあたり240Jの最適エネルギー入力(5分超音波処理から合計で約1200J)が推奨されます。</li>
		<li>一部のセルがそのまま残っている場合は、手順 3.1.5 からのガイダンスに従います。</li>
		<li>細胞抽出物を2 mLマイクロ遠心チューブに移します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 細胞抽出物の明確化と流出反応
<ol><li>4°Cで10分間16,000× g で細胞を遠心分離し、細胞の破片を除去する。上清を1 mLアリコートとして1.5 mLマイクロ遠心分離管に移します。</li>
	<li>細胞抽出物に対してランオフ反応を行います。細胞抽出物を含む1.5 mLチューブを、30°Cで60分間、ヒートブロックまたはインキュベーターで振盪することなくインキュベートします。</li>
	<li>細胞抽出物を16,000× g で4°Cで10分間遠心する。 上清を15mL遠心管に入れます。上清を均質になるまでチューブを5回反転させて混ぜ、氷の上に置きます。気泡の形成を避けるために穏やかに反転します。</li>
	<li>細胞抽出物の10μLをS30Bバッファーで100倍希釈し、3回の技術的反復でブラッドフォードアッセイを使用して全タンパク質濃度を測定します(ブラッドフォードアッセイガイダンスについては 補足材料S2 を参照)。</li>
	<li>タンパク質濃度が20〜25mg/mLの場合、細胞抽出物を100μLのアリコートとして新しい1.5mLチューブに移し、液体窒素中でフラッシュフリーズし、-80°Cで保存します。 注: 安全のために、顔の盾や手袋を含む液体窒素を扱うときは、適切なPPEを着用してください。</li>
	<li>タンパク質濃度が20mg/mL<場合は、粗抽出調製手順を繰り返して、高品質の細胞抽出物とTX-TL収率が以前に発表されたwork5と同等であることを保証します。</li>
</ol>プラスミドDNAテンプレートの調製
<ol><li>メーカーの指示に従って適切なプラスミドDNA精製キットを使用して、新たに形質転換した大腸菌プラスミド株(DH10β、JM109)からpTU1-A-SP44-mScarlet-Iプラスミド(pUC19起源)を50mLのLB培養物(100mg/mLカルベニシリン付き)で栽培して精製します。</li>
	<li>2 x 300 μL のヌクレアーゼを含まない水にプラスミドを溶出し、分画を組み合わせます。</li>
	<li>3 M酢酸ナトリウム(pH 5.2)の0.1ボリューム(66 μL)を加えます。</li>
	<li>0.7ボリューム(462 μL)のイソプロパノールを追加します。</li>
	<li>DNAを-20°Cで30分間インキュベートします。</li>
	<li>遠心分離機16,000× g で4°Cで30分間、上清を捨てます。</li>
	<li>2 mLの70%(v/v)エタノールをDNAペレットに加えます。</li>
	<li>チューブを3〜4回反転し、プラスミドDNAペレットを再懸濁させた。</li>
	<li>遠心分離機は4°Cで5分間16,000× g で5°Cで、上清を捨てます。</li>
	<li>ステップ 5.7 ~ 5.9 を繰り返し、目に見える液体をすべて取り除きます。</li>
	<li>DNAペレットを10〜30分間空気乾燥するか、真空遠心分離機で5分間乾燥します。</li>
	<li>600 μL のヌクレアーゼを含まない ddH2O で乾燥ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>分光光度計を用いてDNA濃度と純度を測定します。</li>
	<li>50~100 μLのアリコートを用意し、-20°Cで保存します。 注:無細胞反応のボリューム制約が厳しいため、500~1000 ng/μLの範囲で高いDNA濃度を推奨します。プラスミドDNAストックを80 nMに希釈します。168 ng/μL pTU1-A-SP44-mScarlet-I プラスミドは80 nMに相当する。 </li>
</ol>6. ストレプトマイセス マスターミックス(SMM)ソリューションの調製
<ol><li>アミノ酸溶液<ol>
<li>手動エラーを回避し、オンラインで提供されているメーカーの指示に従って、準備時間を短縮するためにアミノ酸サンプラーキットを使用してください。</li>
		<li>ddH2Oを用いた20xアミノ酸ストック溶液を6mM(5mM L-Leu)の最終濃度に希釈します。</li>
		<li>さらに2.4x SMM溶液内で 2.4mM (2mM L-Leu)に希釈する( 表3参照)。 注:TX-TL反応の最終濃度は1mM 19xアミノ酸と0.83 mM L-Leuです。</li>
	</ol>
</li>
	<li>エネルギー溶液および添加剤<ol>
<li>表 3 に記載されているレシピに従って、2.4x SMM ソリューションの他のコンポーネントを準備します。</li>
		<li>または、表 3 に記載されているレシピに従って、2.4x 最小エネルギーソリューション (MES) を準備します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 標準 のベネズエラ TX-TL反応を設定する
<ol><li>細胞抽出物、 SMM (または MES)溶液、およびプラスミドDNAを氷上で解凍する。-20°Cで384ウェルプレートを予冷してください。</li>
	<li>TX-TL反応は、体積の25%がプラスミドDNA、33.33%が細胞抽出物、41.67%が SMM 溶液である場合に設定します。開始時刻のバイアスを避けるために氷の上にそれらを保ちます。 注:反応数に基づいて必要な試薬の量を計算するための標準TX-TLテンプレート(表4)が提供されています。33 μL反応の標準体積は、11 μLの細胞抽出物、13.75 μL SMM、プラスミドDNA 8.25 μLです。</li>
	<li>溶液が均質であることを確認するために、〜5sの混合物を低速設定で穏やかに渦を出す。発泡/泡形成を避けてください。</li>
	<li>気泡を導入することなく、技術的な三重として384ウェルプレートの3つのウェルに10 μLアリコートを移します。透明なカバーでプレートを密封し、400× g で5s回転させます。</li>
	<li>28°Cで反応をインキュベーター(終点の読み取り値)またはプレートリーダーで振らずにインキュベートします。 注: 反応は、通常、完了するまでに 3 - 4 時間を必要とします。プレートリーダーおよび mScarlet-I 標準測定のガイダンスについては 、補足材料 S2 を参照してください。</li>
</ol>

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

この原稿では、高収率のS.ベネズエラTX-TLプロトコルは、TX-TLシステムの経験豊富なユーザーと新しいユーザーの両方のために行う簡単な詳細な手順で説明されています。既存のストレプトマイセス45および大腸菌TX-TL41プロトコルからいくつかの機能が削除され、S.ベネズエラTX-TL5,26の最小かつ高収率プロトコルが確立されました。ここで推奨されるワークフローは、S.ベネズエラが選択された豊かな媒体で急速に成長していることを確認し、夕方に最終的な文化を接種できるようにすることです。これは、翌朝のピーク成長時に細胞の収穫を可能にし、ユーザーは、同じ日に活性細胞抽出物を収穫し、準備することができます。この合理化されたプロトコルに従うことで、1人の研究者が3日間の枠組みでプロトコルを便利に完成させることが期待されます。mRNA/タンパク質分...

無細胞転写翻訳(TX-TL)システムは、合成生物学の概念的なエンジニアリングフレームワークである迅速な設計構築テスト学習サイクルを実装するための、合成生物学のための理想的なプロトタイピングプラットフォームを提供します。また、開放反応環境における高価値組換えタンパク質生産に対するTX-TLシステムへの関心が高まっている2は、例えば、抗体薬物コンジュゲート3に非標準アミノ酸を組み込む。具体的には、TX-TLは、細胞抽出物、プラスミドまたは線形DNA、およびバッチまたは半連続反応でタンパク質合成を触媒するエネルギー溶液を必要とする。エシェリヒア・コリTX-TLは、支配的な無細胞システムである一方で、多くの非モデルTX-TLシステムは、さまざまなアプリケーションのために注目を集めています 4,5,6,7,8.TX-TLの主な利点は、柔軟な拡張性(ナノリットルからリットルスケール)9,10、強力な再現性、自動化されたワークフロー8、11、12です。特に、TX-TLの自動化により、遺伝的部分および調節要素の加速的な特性評価が可能となる8,12,13.
反応のセットアップの面では、TX-TLは、一次および二次的なエネルギー源、ならびにアミノ酸、補因子、添加剤、およびテンプレートDNA配列の両方を必要とする。ヌクレオチド三リン酸(NTP)は、初期mRNA(ATP、GTP、CTP、およびUTP)およびタンパク質合成(ATPおよびGTPのみ)を駆動する一次エネルギー源を提供します。TX-TL収率を高めるために、NTPはマルトーゼ14、マルトデキストリン15、グルコース14、3-ホスホグリセリン酸(3-PGA)16、ホスホエノールピルビン酸17、L-グルタミン酸18などの二次エネルギー源の同化を通じて再生される。この固有の代謝活性は驚くほど多目的であり、特に新興のTX-TLシステムでは、まだ十分に研究されていません。各エネルギー源は、スケールアップTX-TL反応に重要な考慮すべきATP収量、化学的安定性、コストの点で、それぞれ異なる特性と利点を有します。これまでのところ、 大腸菌 TX-TLの電流プロトコルは、3-PGA(30 mM)、マルトデキストリン(60mM)、D-リボース(30mM)を二次エネルギー源として使用して、モデルグリーン蛍光タンパク質(GFP)で最大4.0mg/mL(約157μM)に達しています。
最近、TX-TLシステム20,21,22の二次代謝産物生合成経路の研究に対する関心が高まっています。具体的には、アクチノバクテリアは、抗生物質および農薬23,24を含む二次代謝産物の主要な供給源である。彼らのゲノムは、二次代謝産物生合成のための酵素経路をコードする、いわゆる生合成遺伝子クラスター(BGC)で濃縮されています。アクチノバクテリアの遺伝子部分と生合成経路の研究のために、ストレプトマイセスベースのTX-TLシステムの範囲が最近開発された5,6,25,26。これらの特殊なストレプトマイセスTX-TLシステムは、以下の理由で潜在的に有益である:[1]ストレプトマイセスspp.26からの酵素のための天然タンパク質折りたたみ環境の提供;[2] 高G+C(%)遺伝子発現に最適なtRNAプールへのアクセス;[3] 生合成前駆体の供給のためにハイジャックされる可能性のある活発な一次代謝;[4] 天然細胞抽出物に存在する二次代謝からの酵素、前駆体、または補因子の提供。したがって、これらのユニークな機能を活用するために、高収率S.ベネズエラTX-TLツールキットが最近設立されました5。
ストレプトミセスベネズエラは、工業バイオテクノロジーの豊富な歴史を持つ合成生物学の新たな宿主であり、アクチノバクテリア30,31,32の細胞分裂と遺伝子調節を研究するためのモデルシステムとして使用されています。主型のS.ベネズエラATCC 10712は、7377のコード配列、21rRNA、67 tRNA、および30個の生合成遺伝子クラスター27をコードする72.5%G+C含有量(加盟番号:CP029197)を有する8.22 Mbの比較的大きなゲノムを有する。合成生物学では、S. ベネズエラ ATCC 10712 は生合成経路の異種発現のための魅力的なシャーシです。他のほとんどのストレプトマイセス染色とは異なり、急速な倍倍時間(〜40分)、遺伝的および実験ツールの広範な範囲5,28、骨髄凝集の欠如、および液体培地における胞子形成を含むいくつかの重要な利点を提供する28,33。いくつかの研究はまた、ポリケチド、リボソームおよび非リボソームペプチド34、35、36、37、38を含む二次代謝産物の多様な配列の異種産生のためのS.ベネズエラの使用を実証している。これらの組み合わせの特徴は、この株は、合成生物学や代謝工学のアプリケーションのための魅力的な微生物宿主になります。S.ベネズエラは異種遺伝子発現の支配的なストレプトマイセスモデルではありませんが、さらなる発展に伴い、天然物発見におけるより広範な使用のために準備されています。
この原稿は、以前に公開された元のプロトコル26から更新された高収率S.ベネズエラTX-TLシステムの詳細なプロトコル(図1)を提示する。この研究では、エネルギー溶液と反応条件が最適化され、標準プラスミドpTU1-A-SP44-mScarlet-Iを用いた4時間、10μLバッチ反応でmScarlet-Iレポータータンパク質のタンパク質収量を最大260μg/mLに増加させます。このプラスミドは、タンパク質発現を検出する様々な方法を有効にするように特別に設計されています。このプロトコルも合理化され、エネルギーシステムは、収量を損なうことなく無細胞反応を設定する複雑さとコストを削減するために最適化されています。最適化されたTX-TLシステムに加えて、遺伝子発現を微調整し、TX-TLをリアルタイムでモニタリングするための蛍光ツールとして開発された遺伝部分のライブラリを開発し、ストレプトマイセスspp.および関連するアクチノバクテリアからの遺伝子発現および天然物生合成経路を試作するための汎用性の高いプラットフォームを作成しました。
この研究では、推奨標準プラスミド(pTU1-A-SP44-mScarlet-I)を使用して、新しい実験室でS.ベネズエラTX-TLワークフローを確立し、AddGeneで利用可能です(補足表S1を参照)。pTU1-A-SP44-mScarlet-I は、他のオープンリーディングフレーム (ORF) を柔軟に学習できます。mScarlet-I ORFは、S.ベネズエラ遺伝子発現に対してコドン最適化されています。SP44プロモーターは、大腸菌およびストレプトマイセスspp.39の両方で高活性である強力な構成プロモーターです。プラスミドは、2つのユニークな制限酵素部位(NdeI、BamHI)を有し、C末端FLAGタグとフルオレセインアーセニカルヘアピン(FlAsH)バインダータグシステムを有する新しいORFをフレーム内でサブクローニングすることを可能にする。あるいは、両方のタグを、新しい遺伝子をサブクローニングした後に停止コドンを含めて除去することができる。この塩基ベクターにより、様々なタンパク質の高収率発現、すなわち、オキシテトラサイクリン生合成経路からのタンパク質と、ストレプトマイセスリモサスからの非リボソームペプチド合成酵素(NRPS)の発現が実証されている(図2)。mRNA検出の観点から、pTU1-A-SP44-mScarlet-I標準プラスミドは、3,5-ジフルオロ-4-ヒドロキシベンジリデンイミダゾリニヨン(DFHBI)プローブで検出するためのdBroccoliアプタマー(3'未翻訳領域)を含んでいます。柔軟性を高めるために、EcoFlex40互換のMoClo部品のツールセットもAddGeneで利用可能になりました。 EcoFlex互換ストレプトマイセスシャトルベクター(pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP)およびスーパーフォルダグリーン蛍光タンパク質(sfGFP)を発現するpTU1-A-SP44変異プラスミドの範囲、mScarlet-I、mVenus-I、β-グルクリダーゼ(GUS)を含む。特に、pSF1C-AプラスミドはpAV-gapdh28に由来し、MoCloアセンブリのBsaI/BsmBI部位を硬化する。pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFPはEcoFlex40のpTU1-A-RFP/pTU2-A-RFPに相当しますが、ストレプトマイセスsppの共役および染色体統合のための追加機能が含まれています。phiC31インテグラーゼシステム28を使用して。
プロトコルの第1段階は 、S.ベネズエラATCC 10712または密接に関連株の成長、中指数相での細胞収穫、細胞洗浄ステップ、およびS30AおよびS30Bバッファーの平衡化を含む。この段階は3日を要し、細胞増殖の時間は、以下に説明するように残りの成分を調製するために使用することができる。採取した細胞は、超音波処理によって分解され、明確化され、流出反応を受ける。この調製の最終段階では、細胞抽出物を-80°Cで長期保存して活性の損失を最小限に抑えることができます。このプロトコルを使用したTX-TL反応の組み立てでは、スト レプトマイセス マスターミックス(SMM)が提示され、同等の収率を与える最小エネルギー溶液フォーマット(MES)のオプションが表示されます。さらに、S .ベネズエラ ATCC 10712の新鮮な培養物を-80°CグリセロールストックからGYM寒天プレートにストリークし、28°Cで少なくとも48〜72時間インキュベートして、単一のコロニーが見えるまで推奨されます。次の手順では、新鮮なカルチャのみを使用する必要があります。

<table><tbody><tr><td>2.5 L UltraYield フラスコ</td><td>Thomson</td><td>931136-B</td><td></td></tr><tr><td>3-PGA (>93%)</td> <td>Sigma</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>384 ウェル ブラック/クリア ボトムプレート</td><td>ThermoFisher</td><td>10692202</td><td></td></tr><tr><td>塩化アンモニウム (98%)</td> <td>Fluorochem</td><td>44722</td><td></td></tr><tr><td>ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM 溶液、>99%)</td> <td>ThermoFisher</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>カルベニシリン(純度については供給者にお問い合わせください)</td><td>メルフォード</td><td>C46000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース(純度については供給者に連絡してください)</td><td>メルフォード</td><td>G32040</td><td></td></tr><tr><td>DFHBI(&ge;98% - HPLC)</td> <td>Sigma</td><td>SML1627</td><td></td></tr><tr><td>DTT (純度についてはサプライヤーにお問い合わせください)</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td></td></tr><tr><td>FlAsH-EDT2 (純度についてはサプライヤーにお問い合わせください)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-363644</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-6-phosphate (>98%)</td><td>Sigma</td><td>G7879</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Free Acid (純度についてはサプライヤーにお問い合わせください)</td><td>Melford</td><td>B2001</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン酸ヘミマグネシウム塩四水和物(>98%)</td><td>シグマ</td><td>49605</td><td></td></tr>塩化<tr><td>マグネシウム(98%)</td><td>フルオロケム</td><td>494356</td><td></td></tr><tr><td>麦芽抽出物</td><td>シグマ</td><td>70167-500G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-6000</td>シ<td>グ</td><td>マ807491</td><td></td></tr><tr><td>ピアス96ウェルマイクロダイアリシスプレート、10K MWCO</td><td>サーモフィッシャー88260</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリ(ビニール硫酸塩カリウム</td><td></td><td>Sigma 271969</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン酸カリウム (>99%)</td> <td>Sigma</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>RTS アミノ酸サンプラー</td><td>5 Prime</td><td>2401530</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (99%)</td> <td>Fluorochem</td><td>94554</td><td></td></tr><tr><td>Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE カラム (1 g)</td><td>Sigma</td><td>505471</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>メルフォード</td><td>Y1333</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>イクイップメント</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>BMG</td><td>オメガ</td><td></td></tr></tbody></table>

合成生物学と天然物アプリケーションのための高収量スト レプトマイス 転写翻訳ツールキット

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

ストレプトマイセス spp.は、臨床抗生物質および工業薬品の主要な供給源である。 ベネズエラのレンサトミース ATCC 10712は、成長が急速に進む菌株であり、クロラムフェニコール、ヒドマイシン、ピクロマイシンの天然生産者であり、次世代の合成生物学シャーシとして魅力的な候補です。したがって、 S.ベネズエラ ATCC 10712の開発を加速する遺伝的ツールは、他の ストレプトマイセス spp.モデルと同様に、天然物工学および発見のために非常に望ましい。この上、専用 のS.ベネズエラ ATCC 10712無細胞システムは、高G+C(%)遺伝子の高収率異種発現を可能にするために、このプロトコルに提供されています。このプロトコルは、96ウェルまたは384ウェルプレート形式の小規模(10-100 μL)バッチ反応に適していますが、反応はスケーラブルである可能性があります。無細胞システムは堅牢で、最小限のセットアップで組み換えタンパク質の範囲のための高収率(〜5-10 μ M)を達成することができます。また、mRNAやタンパク質合成のリアルタイム測定、タグ付きタンパク質のインゲル蛍光染色用の広範なプラスミドツールセットも組み込まれています。このプロトコルは、高スループットの遺伝子発現特性解析ワークフローや、アクチノマイセテスゲノムに存在する高G+C(%)遺伝子からの酵素経路の研究と統合することもできる。

この詳細なプロトコルは、S. ベネズエラ ATCC 10712 モデル株に基づいてストレプトマイセス TX-TL システムを確立するユーザーを支援する例として提供されています(図 1)。ユーザーは、他のストレプトマイス株を研究しようとするかもしれません;ただし、より長い倍率の時間または明確な成長の好みを持つ他の株の成長/収穫段階は、ピーク結果を達成するためにカスタム最適化する必要があります。代表的な結果については、pTU1-A-SP44-mScarlet-I標準プラスミド(図2および図3)からのmScarlet-I蛍光タンパク質を、S.ベネズエラTX-TLにおいて高収率発現を検出方法の範囲(SDS-PAGE、蛍光)で提供するように最適化した。また、この標準的なプラスミドを、S.リモサス由来の一部の二次代謝産物酵素の合成を...

このプロトコルは、 ストレプトマイセスベネズエラ 細胞非転写変換(TX-TL)システムから組み換えタンパク質の高収率を合成するための強化された方法を詳述する。

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a ...

当社のプロトコルは、セネダマイセスベネズエラ細胞フリー転写翻訳の簡略化されたワークフローを提供します。私たちのシステムは、この非モデル生物からの代謝酵素および経路を利用する。主な利点は、高いGC含有量を有する遺伝子の異種発現、良好なタンパク質転送環境の提供、生合成経路の微調整のためのオープンシステムである。私たちの方法は、ストレプトマイセスと関連する高GC細菌の研究に新たな機会を開きます。これは、これらの細菌の酵素や遺伝子発現を研究することができます。この手法は、新しいユーザーによる実装を容易にするために開発されました。経験や慣れ親しんだ経験を必要とする唯一のステップは、高度に活性な粗抽出物を生成する超音波処理です。3日目に前培養細胞の収穫を開始するには、600ナノメートルで光学密度またはOD測定のために新鮮なGYN培地で1対10の割合で一晩培養を希釈する。600ナノメートルの培養のODが0.3未満の場合、揺れ速度を毎分250〜300回転に上げ、ODが0.3に達するまで成長する。さらに2時間以上成長しません。ODが0.3より大きい場合は、培養物を遠心分離容器に移し、湿った氷の上で30分間急速に冷却します。細胞培養が冷めるのを待っている間に、新鮮な1モルジチオトレイトール、S30AおよびS30Bバッファーの4ミリリットルを調製し、氷の上に保ちます。空の50ミリリットル遠心管の重量を量った後、マイナス20度で予冷してください。氷の上のS30Aバッファーの1リットルに1モルジチオソトレイトールの2ミリリットルを追加し、よく混ぜます.6,000倍Gで細胞を摂氏4度で10分間遠心分離する。素早い動きで上清を捨てた後、S30Aバッファーの250ミリリットルを加え、細胞の塊が均一に分散するまで遠心ボトルを激しく振って細胞を再懸濁する。その後、再び6分間遠心分離します。遠心分離後、上清を捨ててS30Aバッファーの添加を繰り返し、続いて、示されるように遠心分離を行う。次に、氷上のS30Bバッファーの1リットルに1モルDTTの2ミリリットルを加え、よく混ぜます。細胞に250ミリリットルのS30Bバッファーを加え、遠心分離を繰り返します。細胞ペレットをS30Bバッファーの10ミリリットルに再懸濁し、細胞懸濁液をあらかじめ計量した50ミリリットル遠心管に移します。必要に応じて、S30Bバッファーの追加5〜10ミリリットルで残留細胞を移し、S30Bで50ミリリットルの体積にチューブを充填します。細胞を10分間遠心分離します。上清を破棄し、前の設定で遠心分離を繰り返します。上清を捨て、残りのS30B上清を100~200マイクロリットルピペットで吸引し、湿細胞ペレットを秤量する。1グラムの湿潤細胞ごとに、0.9ミリリットルのS30Bバッファーを加えます。パスツールピペットまたは渦を使用して細胞を再中断します。遠心分離機は細胞を沈下するために約10秒間500Gまで短時間で沈下する。超音波処理器の先端をセルサスペンションに下げ、先端が液体表面から約1センチメートル下に置きます。超音波処理器の設定で異なるパラメータを入力します。周波数を20キロヘルツ、振幅を65%パルスオン/オフ時間を10秒に設定し、合計超音波処理時間を1分に設定します。超音波処理を開始し、細胞が均等に超音波処理されていることを確認するために、最初の2つの休息サイクル中にチューブを上下に動かします。細胞が完全にlysedされていない場合は、チューブを2〜3回反転させ、細胞が完全に破壊されるまで頻繁に混合して追加の1〜2回の10秒サイクルの超音波処理を繰り返します。細胞の破片を除去するために細胞を遠心分離し、その上清を1ミリリットルのアリコートとして1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移す。細胞抽出物の流出反応の場合、セル抽出物を含む細胞を30°Cで60分間、またはシェーカーなしでインキュベーターでインキュベーターでインキュベートします。転写翻訳反応のために、細胞抽出液SMMまたはMES溶液を解凍し、プラスミドDNAを氷上にします。マイナス20度で384ウェルプレートを予冷します。体積の25%がプラスミドDNA、33.33%が細胞抽出物、41.67%がSMM溶液である氷上に転写翻訳反応を設定します。低速度設定で約5秒間、混合物を穏やかに渦巻き、発泡または泡の形成を避けながら溶液が均質であることを確認する。気泡を導入することなく、技術的な三重として384ウェルプレートの3つの井戸に10マイクロリットルの3つのアリコートを移します。透明なカバーでプレートを密封した後、5秒間Gの400倍のプレートを回転させ、インキュベーターまたはプレートリーダーで28°Cで反応を振らずにインキュベートします。ストレプトマイセスベネズエラの無細胞転写変換は、pTU1-A-SP44標準プラスミドからの蛍光タンパク質の高収率発現と、ゲル電気泳動によって検出された生合成酵素に最適化されました。pTU1-A-SP44-mScarlet-I標準プラスミドの発現は、いくつかの方法を用いて測定した。dBroccoli RNAアプタマーを用いたmRNAのリアルタイム蛍光測定では、FlAsHタグシステムを用いた未熟なmScarlet-Iタンパク質、および成熟したmScarlet-Iタンパク質を実施した。FlAsHタグを用いたmScarlet-Iのインゲル蛍光染色は、全無細胞タンパク質のクマシーブルー染色に加えて行った。この手順に従って、活性アッセイは、標準的な方法を使用して困難である酵素および経路を研究するために行うことができる。また、スケールアップされた生合成と高スループットの遺伝子発現に向けても拡張されています。高GC菌の代謝酵素を研究する技術を開発しています。私たちは、無細胞反応でスケールアップされた生合成を研究するシステムの可能性を示しました。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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を経て製造複合抗生物質エリスロマイシンをフィーチャーロジック、実験の手順、および異種天然物合成の可能性<em&gt; E大腸菌の</em

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自動 Microbioreactor 技術を用いた異種タンパク質生産の最適化のための汎用プロトコル

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ジテルペノイド天然物の酵素生産と精製のためのカスタマイズ可能なアプローチ

質量分析誘導ゲノムマイニングプロトコルが確立され、ここに記載されています。ゲノム配列情報とLC-MS/MS解析に基づき、複雑な微生物や植物抽出物からの分子の同定を容易にすることを目的としています。...

新しい天然物を発見するためのツールとしての質量分析誘導ゲノムマイニング

このプロトコルの目的は、ゴールデンゲートクローニングに基づくモジュラークローニングシステムを使用して、マルチ遺伝子構造を組み立てるための詳細なステップバイステップガイドを提供することです。また、当社の経験に基づいて最適なアセンブリを確保するための重要な手順に関する推奨事項も示します。...

モジュラーゴールデンゲートクローニングを用いた多遺伝子構造の迅速な組み立て

ここに提示するのは、エシェリヒア・コリBL21...

線状DNAテンプレートを用いたエキソヌクレアーゼ欠損細胞抽出物からの無細胞タンパク質合成(英語)

学ぶ Streptomyces venezuelae の無細胞転写翻訳システムを用いた高収量タンパク質合成法。高GC含量遺伝子のヘテロログ発現と代謝酵素研究に応用可能な簡便なワークフローです。

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