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正確で深い定量プロテオーム分析のための成人皮下帯のクライオセクション解剖
正確で深い定量プロテオーム分析のための成人皮下帯のクライオセクション解剖
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JoVE Journal Neuroscience
Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis

正確で深い定量プロテオーム分析のための成人皮下帯のクライオセクション解剖

Full Text
3,874 Views
06:24 min
October 7, 2021

DOI: 10.3791/63047-v

Christian Friess1, Magdalena Götz1,2,3, Jacob Kjell1,2,4

1Division of Physiological Genomics, Biomedical Center,Ludwig Maximilian University of Munich, 2Institute for Stem Cell Research,Helmholtz Zentrum München, 3SYNERGY, Excellence Cluster Systems Neurology,University of Munich, 4Department of Clinical Neuroscience,Karolinska Institutet

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Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents a cryo-section-dissection method for the precise and efficient preparation of the murine ventricular neurogenic niche, enabling deep quantitative proteome analysis. By minimizing tissue perturbation, this technique is particularly suitable for exploring the molecular microenvironment across various biological contexts, such as health and disease.

Key Study Components

Area of Science

  • Neuroscience
  • Proteomics
  • Neurogenesis

Background

  • The ventricular neurogenic niche plays a critical role in neurogenesis in the murine brain.
  • Existing methods for isolating this niche can cause significant tissue damage.
  • Precise dissection is necessary for detailed molecular analysis.

Purpose of Study

  • To develop a method that enables accurate extraction of the ventricular neurogenic niche.
  • To facilitate quantitative analysis of proteins involved in neurogenesis.
  • To assess its applicability in different species and health conditions.

Methods Used

  • Cryo-section-dissection of the mouse brain was employed.
  • The study utilized male C57BL/6 mice, focusing on their ventricular neurogenic niche.
  • No multiomics workflow was mentioned, but proteomic analysis was highlighted.
  • Key steps included the removal of specific brain sections and subsequent freezing for analysis.
  • The technique requires dexterity in scalpel use during dissection.

Main Results

  • The method achieved robust identification and quantification of neurogenesis-related proteins.
  • Cryo-section-dissection yielded fewer contaminants compared to laser capture microdissection, improving data integrity.
  • Significantly, this approach revealed unique neurogenesis regulators.

Conclusions

  • This study demonstrates a novel approach for isolating neurogenic niches, enhancing the understanding of neurogenesis.
  • The technique enables deeper insights into protein profiles associated with neuroplasticity and regeneration.
  • Findings have implications for studying neurogenic regulation in diverse biological and pathological contexts.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of the cryo-section-dissection method?
It provides precise isolation with minimal tissue damage, crucial for accurate proteomic analysis.
How is the ventricular neurogenic niche extracted?
The method involves precise scalpel cuts to remove specific brain structures, followed by freezing for sectioning.
What types of outcomes can this method produce?
The technique enables the identification of proteins involved in neurogenesis, allowing for deeper molecular insights.
Can this method be applied to other species?
Yes, while developed for mice, the technique is adaptable for use in various species.
Are there any key limitations of this method?
The technique requires skilled handling of instruments, particularly the use of a scalpel for accurate cuts.
What is the significance of the findings?
The study identifies novel regulators of neurogenesis, providing a foundation for future research in neuroplasticity.
How might this influence studies of neurological disorders?
By improving our understanding of neurogenic processes, this method could aid in developing therapies for cognitive deficits associated with neurological diseases.

極度切除は、深い定量的プロテオーム分析のために、マウス脳内で最大の神経原性ニッチの新鮮な凍結製剤を可能にする。この方法は正確で効率的であり、最小限の組織摂動を引き起こす。そのため、このニッチの分子微小環境や、他の臓器、領域、種の研究に最適です。

我々の解剖法は、心室神経原性ニッチの正確な単離を可能にし、したがって、このニッチの分子微小環境を研究するのに適している。この解剖方法の主な利点は、正確で効率的であり、プロテオーム分析のための質量分析と互換性がある間、最小限の組織摂動を引き起こすということです。このプロトコルでは、マウスの脳から心室の神経性ニッチを抽出しますが、この方法は他の種や健康や病気の様々な状態にも適用できます。

このテクニックには、いくつかのトレーニングが必要な場合があります。特に、心室神経原性ニッチを露出して抽出するときのメスカットで。8〜10週齢のC57黒/6オスマウスを安楽死させた後、手動解剖によって脳を抽出し、氷冷解剖培地を含む培養皿に入れる。

メスを使用して、嗅球と皮質の内極の間にまっすぐなコロナカットを行うことによって嗅球を取り除きます。次に、コロナカットを行って皮質の前極を取り除き、側心室がコロナ平面に見えるようにします。次に、はさみを使用して、側側心室を皮質表面から心室内腔に開始して、上から両方の側心室を開く。

この切り口は、心室屈曲に続いてC字型にして伸ばします。次に、左右の矢状切開部の尾端を接続し、追加のコロナカットを採用する。次に、心室壁を覆う皮質と脳梁を取り除く。

組織が心室壁に取り付けられている場合は、追加の切り傷を行うか、組織を取り除くためにはさみで皮質と脳梁を持ち上げます。次に鉗子を使用して、側心室を覆う皮質および脳梁を取り除く。鉗子を使用して、慎重に心室の壁を広げ、脈絡叢を除去する。

次に、ガラススライドの上に脳を置き、ドライアイスの上にスライドを置き、オープン構成の心室壁で脳を凍結します。切除する前に、脳が凍結組織用の埋め込み媒体を備えた後部脳のクライオスタット付着プレートに取り付けられていることを確認してください。さらに、埋め込み培地が前脳、特に心室に接触しないようにしてください。

次いで、脳の50~100マイクロメートルの厚さのコロナ部分を横心室の終わりまで切り取り、その切片をスライドガラスに取り付けます。ガラススライドをドライアイスの上に置き、解剖顕微鏡で下さい。ドライアイスからスライスを15〜30秒間持ち上げて、短くて不完全な解凍を達成し、線条体のコンパクトミエリンを密な白い点として観察します。

次に、あらかじめ冷却されたメスを使用して、隣接する線条体から皮下ゾーンを分離し、冷却されたメスの鈍い端を使用して、それを全体の部分として、または2〜4個に切り離してマイクロ遠心管に移します。その後、内側の心室ゾーンに対して同じことを行います。ミエリンに関連する、線条体の糖タンパク質陽性の内部カプセルは、全マウントサンプルで同定されたが、免疫体系化学を介したクライオセクション解剖サンプルではめったに同定されなかった。

全山サンプル中の線条体汚染は、体性感覚皮質サンプルと比較して、腹膜領域におけるミエリンタンパク質の濃縮によって確認された。対照的に、クライオセクション解剖サンプルにおけるこれらのミエリンマーカータンパク質の比較は、皮下帯および体性感覚皮質サンプルに有意な差を示さなかった。質量分析結果をクライオセクション解剖とレーザー捕捉マイクロ解剖の結果を比較すると、レーザー捕捉マイクロ解剖は定量化されたタンパク質の約半分を生み出したが、組織採取時間は約2倍であった。

原理成分分析は、円として描かれた凍結セクション解剖で収集されたものよりも、正方形として描かれたレーザー捕捉マイクロ解剖で収集されたサンプルの間で大きな変動性があることを明らかにした。皮下および内側のエペンディマルゾーンのクライオセクション解剖とレーザーキャプチャマイクロ解剖の間の2D注釈濃縮試験は、細胞外空間に関連するタンパク質の方法と領域の両方で同様の濃縮を明らかにした。クライオセクション解剖は、皮下ゾーン関連細胞外マトリックスタンパク質における神経新生のより強固な同定と定量化を提供する。

テナシンCの場合、クライオセクション解剖のみが、内側のエペンディマルゾーンと比較して、皮下帯に濃縮を示した。スライド上の脳のセクションが完全に解凍されないことを確認します。全体的に、一貫した結果を得るために、解剖手順の手順を実践することをお勧めします。

解剖方法は、成長因子やサイトカインなどの非常に低い豊富なタンパク質を容易に検出できる他のタンパク質分析方法と併用することもできます。このマイクロディセクション法は、新しい神経新生調節因子を同定することを可能にし、他の人が様々な文脈で神経新生の他の調節因子を同定することを可能にすると信じています。

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神経科学 問題176

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