繊毛拍動頻度の定量化のための初代ヒト鼻上皮細胞モデルの収集、拡大、および分化
2021年11月10日
このプロトコルでは、鼻上皮細胞の収集、拡張、器官型気道上皮細胞モデルへの分化、および生細胞イメージングとカスタムビルドスクリプトによる繊毛拍動頻度の定量化について説明します。
鼻粘膜からの気道幹細胞の採取について述べる。これらの細胞は、実験室で増殖し、偽層状上皮に分化します。これはin vitroでの拡張と分化であり、in vivoの気道に類似しており、繊毛拍動頻度の定量に使用できる繊毛細胞などの特殊な細胞が存在することを意味します。
異なる個体間および異なる薬物に応答する繊毛拍動頻度の一貫した再現性のある定量を可能にするために、培養条件と画像取得を標準化します。繊毛拍動周波数測定は、原発性毛様体ジスキネジアなどの疾患の臨床ツールとして使用されます。嚢胞性線維症の臨床マーカーとして確立したいと考えています。
手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるケイトリン・アランとローラ・フォーセット、そして私の研究室のポスドクであるシャロン・ウォン博士です。まず、参加者に口から呼吸するように依頼します。次に、利き手に細胞診ブラシを取り、5桁目を参加者のあごに置いて手を固定し、細胞診ブラシを参加者の顔に対して45度の角度で参加者の鼻腔に挿入し、鼻道に通します。
ブラシを直立させて、参加者の顔に垂直になるようにした後、下鼻甲介の下の鼻の側壁に対して、ブラシを下鼻甲介の中央部から後部になるまでゆっくりとしっかりと進めます。ブラシを360度まで最大3回回転させます。次に、挿入操作を逆にして、セルがブラシから外れないように、それを静かに取り外します。
鼻細胞採取培地で準備した採取チューブにブラシを置き、採取チューブを氷の上に置きます。ブラシから細胞を取り除くために穏やかなボルテックスを行った後、氷上の収集チューブをバイオセーフティキャビネットに戻します。血清学的ピペットを使用して、細胞診ブラシを残して、培地を収集チューブから新しいチューブに移します。
次に、サンプルを遠心分離します。遠心分離後、細胞ペレットを1ミリリットルの条件付き初期化細胞培地に再懸濁します。次に、5ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、50ミリリットルのチューブの上に置かれたセルシーブに細胞を円を描くように通します。
単一細胞懸濁液を得るには、チューブの底から懸濁液を収集し、それを篩に複数回通します。次に、セルシーブを廃棄します。調製した透過性支持体インサート上に気道上皮細胞を播種するには、気泡を作らずに細胞をよく混合し、細胞が均質で懸濁状態であることを確認します。
次に、150マイクロリットルの細胞懸濁液を、調製した透過性支持体インサートの先端側に加える。気道上皮細胞を気液界面で分化させるには、分化またはALI培地で2日間培養します。次に、培地を吸引し、750マイクロリットルのALI培地を基底区画にのみ追加して、気液界面を作成します。
気道上皮細胞をECMドームに播種するには、解離した気道上皮細胞を適切な容量の90%ECMで再懸濁します。次に、ピペットをウェルの底部にできるだけ近い90度の角度で垂直に保持し、50マイクロリットルのECM細胞懸濁液をウェルの中心に分注します。ECMが固まるまで、プレートを摂氏37度で20分間インキュベートします。
ECMが固化している間に、気道オルガノイドシード培地(AOSM)を室温に温めて、再液化や添加時のECMドームの崩壊を防ぎます。インキュベーション後、ウェルの壁に分注することにより、500マイクロリットルの加温AOSMを各ウェルに加えます。ECMドームに直接メディアをピペットで入れないでください。
メディアを 2 日ごとに 4 日から 7 日間交換します。メディアを吸引するには、プレートを45度の角度で傾け、ECMドームから離れたウェルの下端から吸引します。4〜7日後、温めた気道オルガノイド分化培地(AODM)を各ウェルに500マイクロリットル加えてオルガノイド分化を開始し、2日ごとに7日間培地を交換します。
気道上皮細胞モデルを含む培養プレートを顕微鏡プレートインサートに入れ、顕微鏡環境チャンバーを閉じます。サンプルを、事前に温めた摂氏37度、5%二酸化炭素で満たされた顕微鏡チャンバーで30分間平衡化させます。顕微鏡の接眼レンズで、細胞モデルに焦点を合わせます。
次に、取得ソフトウェアを使用して、L100をクリックして、カメラが取り付けられているポートへの光路を切り替えます。緑色の再生ボタンをクリックして、ソフトウェアを介して顕微鏡の視野を視覚化します。繊毛に焦点が合っていることを確認し、必要に応じて調整します。
メニューからタイムラプス画像を取得するには、[取得]、[高速タイムラプス]の順にクリックします。ポップアップウィンドウで、保存場所とファイル名を選択し、1, 000フレームを取得します。顕微鏡の視野で繊毛をプレビューするには、[適用]をクリックしてから、緑色の[再生]ボタンをクリックします。
必要に応じてZフォーカスを調整します。次に、[今すぐ実行]をクリックして、高速タイムラプスをキャプチャします。必要なソフトウェアとツールボックスをインストールした後、適切なカスタム分析スクリプトとサポートスクリプトフォルダをコンピュータのローカルドライブにコピーします。
次に、コンピューティングソフトウェアで、[ホーム]タブをクリックし、[パスの設定]をクリックします。ポップアップウィンドウで、[サブフォルダーで追加]をクリックします。MATLAB 検索パスの下で、表示されているフォルダーを選択します。
次に、[保存して閉じる]をクリックします。解析スクリプトが左側のパネルに表示されていることを確認し、解析スクリプトがコンピューティングソフトウェアにリンクされていることを確認します。次に、取得したサンプルの生の画像ファイルをコンピューターのローカルドライブに転送します。
次に、BeatingCiliaBatchOMEfiles_joveをクリックします。コンピューティングソフトウェアのm分析スクリプトファイル。スクリプトを実行するには、[エディター] タブをクリックし、緑色の [再生] ボタンをクリックします。
表示されるプロンプトウィンドウで、分析する生の画像ファイルを選択します。フレームあたりの取得時間に露光時間を入力します。次に、[OK]をクリックします。GetFirstAmplitude を実行します。
AveSpectrum ファイルを含むフォルダーの m スクリプト。スクリプトが FirstAmplitudeStacked を出力するのを待ちます。XLSXファイルは、最も高い振幅周波数を含み、気道上皮繊毛拍動の生理学的範囲内にあります。
最初の振幅スタックから周波数値をコピーします。XLSXファイルを作成し、科学分析ソフトウェアを使用してプロットします。嚢胞性線維症の3人の参加者と3人の健康な対照参加者に由来する気道上皮細胞ALIモデルで測定された繊毛拍動頻度の結果が提示されます。
培養分化の14日目には、叩動繊毛が存在した。培養分化の14日目から、繊毛拍動頻度の統計学的に有意な増加はコホート間で観察されなかった。培養分化の21日目に、健康な対照参加者の平均繊毛拍動頻度は、嚢胞性線維症の参加者よりも有意に高かった。
さらに、粘液除去後の同じ細胞モデルで繊毛拍動頻度を画像化した場合、健常者と嚢胞性線維症患者の両方のALIモデルで粘液を除去した場合、繊毛拍動頻度が統計的に有意に増加しました。繊毛機能は環境要因の変化に非常に敏感であるため、イメージング環境は厳密に制御する必要があります。このプラットフォームは、CFTR機能を調節する薬物を特定できるように、患者固有の薬物スクリーニングのために確立される可能性があります。
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概要
本プロトコルでは、鼻粘膜から気道幹細胞を採取し、それらを分化させて気道上皮細胞の組織型モデルを作製する手順について概説します。また、ライブセルイメージングを用いて繊毛拍動頻度を定量化する方法についても解説します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 呼吸器内科
背景
- 気道幹細胞は鼻粘膜から採取することができます。
- これらの細胞はin vitroで増殖および分化させることが可能です。
- 得られたモデルはin vivoの気道上皮を模倣しています。
- 繊毛細胞は、繊毛機能を研究する上で極めて重要です。
研究目的
- 気道上皮細胞の培養条件を標準化する。
- 繊毛拍動周波数の再現性のある定量化を可能にする。
- 疾患の臨床マーカーとして、繊毛拍動周波数の有用性を検討する。
使用した方法
- 鼻粘膜からの気道幹細胞の採取。
- in vitroでの増殖および偽重層上皮への分化。
- 繊毛打拍頻度を評価するためのライブセルイメージング。
- データ解析用のカスタムスクリプト。
主な結果
- 鼻上皮細胞を機能的なモデルへと分化させることに成功した。
- 繊毛拍動頻度を測定するための標準化された手法を確立した。
- 臨床診断における繊毛拍動頻度の応用の可能性。
- 呼吸器疾患における繊毛の役割に関する知見。
結論
- このプロトコルは、気道上皮細胞を研究するための信頼性の高い手法を提供します。
- 繊毛打拍頻度の定量化は、呼吸器疾患の診断に役立つ可能性があります。
- さらなる研究により、臨床マーカーとしての有用性が検証されると考えられます。
よくある質問
産業界における重要性
初代ヒト鼻上皮モデルにおける繊毛打拍数（CBF）の定量化は、CFTR調節薬の有効性を評価するための生理学的に適切なシステムを提供します。このアプローチは、疾患に関連したモデルにおいてCFTRチャネル活性を機能的な繊毛出力に関連付けることで、ターゲットの妥当性確認を支援します。標準化され、環境制御された測定により、前臨床段階でのリスク低減に向けた、再現性のある患者個別の反応評価が可能になります。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： CFTR調節と、下流の表現型リードアウトとしての繊毛機能との関係を検証する。
- 実用的価値： ヒト初代細胞におけるCFTR依存的なメカニズムの仮説検証を可能にする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 化合物スクリーニングに向けた、繊毛活性の定量的かつダイナミックな読み取り値を生成する。
- 運用上の価値： 標準化された培養およびイメージング条件により、ドナーや条件が異なる場合でもアッセイの再現性が確保される。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値： 囊胞性線維症（CF）に関連する、粘液による繊毛抑制を含むヒト気道の病態生理をモデル化している。
- 運用的価値： 粘液除去後の繊毛回復の経時的な評価を可能にし、メカニズムの追究に向けた知見を提供する。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、CFTRモジュレータースクリーニングのための機能的なエンドポイントを提供することでディスカバリーバイオロジーに統合され、その出力結果はリード化合物の同定および前臨床検証へと活用されます。
- ディスカバリーバイオロジー：CFTR標的化合物に対する繊毛反応を定量化することで、メカニズム的なリスク低減を支援します。
- スクリーニング：ヒット化合物の確認および用量反応プロファイリングに適した、スケーラブルで定量的なCBF測定を提供します。
- 分析：カスタムスクリプトを用いて高速イメージングから頻度データを抽出し、治療群間での統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：天然の粘液産生を伴うヒト気道上皮をモデル化し、in vitroでの知見を臨床的なCFTR調節薬への反応へと橋渡しします。
- エンタープライズでの再利用：本プラットフォームは複数のCFTR調節薬プログラムに適用でき、一貫性のあるヒトに関連した機能評価が可能です。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 繊毛機能の直接測定により、CFTRモジュレーターの効果に関する予測の信頼性を提供する。
- 運用の価値： 環境制御と標準化されたプロトコルにより、ばらつきを低減し、ラボ間の再現性を高める。
- 戦略的価値： 患者層別化による反応予測を可能にし、CFTRモジュレーター開発におけるgo/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響： 前臨床評価の早期段階で非反応者を特定することにより、リスク調整済みの開発推進をサポートする。
実施上の検討事項
- 初代気道細胞の培養、分化、および無菌操作に関する専門知識が必要です。
- 高速ビデオ顕微鏡および環境制御可能なイメージングチャンバーに依存します。
- カスタムのMATLABベース解析スクリプトを実行するための計算インフラストラクチャが必要です。
- 研究を設計する際は、基底状態の繊毛拍動周波数におけるドナー間の個体差を考慮する必要があります。
- 信頼性の高いCBF測定には、環境安定性（温度、CO2、湿度）が極めて重要です。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:16
Collection of Nasal Inferior Turbinate Brushings
2:25
Airway Epithelial Cell Expansion and Maintenance
3:23
Seeding and Differentiation of Airway Epithelial Cells and Maintenance of Differentiated ALI Models
4:12
Three-Dimensional Airway Epithelial Organoids
5:54
Imaging Cilia Beat Frequency
7:18
Data Analysis and Quantification of Cilia Beat Frequency
9:20
Results: Cilia Beat Frequency in Airway Epithelial Cell ALI Models of Cystic Fibrosis Patients and Healthy Participants
10:36
Conclusion
