Name: 多能性幹細胞由来の自己組織化ヒト心臓オルガノイドの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学ぶ 多能性幹細胞を用いた自己組織化ヒト心臓オルガノイドの生成法。3段階の分化プロトコルで心臓の全細胞タイプと血管ネットワークを再現し、心血管疾患のモデリングと薬剤スクリーニングに応用可能です。

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この研究は、国立衛生研究所の国立心臓、肺、血液研究所の賞番号K01HL135464とR01HL151505の下で、および賞番号19IPLOI34660342の下で米国心臓協会によってサポートされました。MSU薬理毒性学科のMSUアドバンスト顕微鏡コアとウィリアム・ジャクソン博士は、コンフォーカル顕微鏡、IQ顕微鏡コア、シーケンシングサービスのためのMSUゲノミクスコアへのアクセスに感謝したいと思います。また、アギーレラボのメンバーの皆様の貴重なコメントやアドバイスに感謝申し上げたいと思います。

1. hPSCの文化とメンテナンス
注:ヒト誘導PSC(hiPSC)またはヒト胚性幹細胞(hESC)は、分化またはさらなる凍結保存のためにEBを生成するために使用される前に、解凍後に少なくとも2回連続した通路のために培養する必要があります。hPSCは、基質膜外細胞マトリックス(BM-ECM)コーティングされた6ウェル培養プレート上のPSC培地( 材料表参照)で培養される。6ウェルプレートでhPSCにメディアチェンジを行う場合は、細胞の上に直接置かずにウェルの内側に直接培地を追加して、不要な細胞の剥離やストレスを防ぎます。ユーザーは、37 °Cで温めてはならないPSCメディアを温める前に警戒する必要があります。このプロトコルで使用されるすべてのPSCメディアは耐熱性であった。
<ol><li>BM-ECMでウェルプレートをコーティングするには、BM-ECMのアリコート(メーカーの指示に従って-20°Cで保存)を氷上で解凍し、BM-ECMの0.5mgを冷たいダルベックの改変イーグル培地(DMEM)/F12培地(DMEM)/F12培地(4°Cで保存)と12mL混合します。DMEM/F12-BM-ECM混合物の2 mLを6ウェルプレートの各ウェルに分配し、37°Cで少なくとも2時間インキュベートします。</li>
	<li>細胞を解凍するには、まず、37°Cビーズまたは水浴中のhPSC cryovialを1〜2分間解凍し、少量の氷のみが見えるまで行う。解凍した細胞を遠心分離管に移し、2μMのROCK阻害剤、チアゾビビン(チアズ)、遠心分離機を300× g で5分間ゆっくりと添加してPSC培地を8〜9mL加えます。上清を取り除き、チアズの2 μMを補充したPSC培地の細胞ペレットを再懸濁します。培養液中の細胞を37°Cでの凍結細胞濃度および培養に応じて1〜2ウェルに分配し、PSC培地を変える前に24時間のCO2 を5%とする。</li>
	<li>48時間間隔でセル上の媒体を変更します。DMEM/F12(1 mL/well)およびPSC培地(2mL/ウェル)を使用して、それぞれ、スケッシュと培地の変更を行います。 注:新しいメディアの変更は、栄養素の新たな供給源を細胞に提供しながら、ワッシュは、細胞の廃棄物や破片を除去するのに役立ちます。</li>
	<li>培地を吸引し、1xダルベッコのリン酸緩衝溶液(カルシウムなし、マグネシウムなし)の1mLで各ウェルを洗浄することにより、亜合流(60〜80%コンフルエント)で細胞を通過させる。DPBS)。DPBSを吸引し、hPSC用解離試薬の1mLを加え( 材料表参照)、10s後の試薬の薄膜以外の全ての吸引を続ける。</li>
	<li>細胞間に隙間が形成されるまでhPSC用解離試薬の薄膜で2〜5分間インキュベートする。 注: 解離を停止する時間はセル行に依存します。</li>
	<li>2 μM のチアズ (PSC 培地 +チアズ) を添加した PSC 培地 1 mL をウェルに加え、プレートを軽くタップして細胞の剥離を誘導します。分離した細胞を培地に1〜2回ピペットして大きなコロニーを分割し、PSC培地+チアズの細胞を1:6ウェル比で再懸濁した(1から12mLの培養培地に再懸濁した細胞)。BM-ECMコーティングされた井戸の細胞を再プレートします。</li>
</ol>2. 3D自己集合型ヒト心臓オルガノイドの生成
<ol><li>胚体(EB)形成: 注:胚の体形成前に観察可能な分化細胞を制限することが不可欠です。60-80%の合流度で6ウェルプレートの2〜3つの井戸は、オルガノイドの単一の96ウェルプレートのための十分な細胞を得る。すべての媒体は、EBまたはオルガノイドへの温度ショックを最小限に抑えるために、媒体が変化する前に37°Cビーズまたはウォーターバスでアリクォートされ、温めるべきである(これは細胞解離試薬を含まない)。図 1A,B を参照してください。<ol>
<li>日 -2<ol>
<li>EBを作成するには、-2日目に、サブコンフルエントhPSC(60〜80%コンフルエント)を少なくとも10 sのDPBSで洗浄し、細胞の破片を洗浄し、DPBSを吸引します。</li>
			<li>細胞を取り外して単一細胞状態に放出するには、1 mLの室温細胞解離試薬( 材料表を参照)を各ウェルに3〜6分間加えます。顕微鏡下でチェックしながら剥離を誘発するために、毎分〜5回プレートを軽くタップします。PSC培地+チアズを1 mL加えた反応を止める。</li>
			<li>細胞を収集し、残りの凝集体を分割するには、ウェル2〜3回でメディアを上下にピペットし、単一細胞懸濁液を生成する。単一細胞懸濁液を遠心管に移し、300×gで5分間回転 させる。</li>
			<li>所望の細胞濃度を得るために、上清を捨て、PSC培地+チアズの1mLで細胞を再懸濁する。細胞カウンターまたはヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、PSC培地+チアズの細胞を10万細胞/mLの濃度に希釈します。</li>
			<li>EB形成のために細胞を分配するには、マルチチャンネルピペットを使用して、ラウンドボトム超低アタッチメント96ウェルプレートの各ウェルに100 μL(10,000細胞)を加えます。プレートを100× g で3分間遠心し、37°Cで24時間、5%CO2でインキュベートします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>1日目<ol>
<li>各ウェルから50μLの培地を慎重に取り出し、37°Cに温めた新鮮なPSC培地200μLを加えて、井戸あたり250μLの最終容積を達成します。37°C、5%CO2で24時間培養します。 注:井戸の底部にあるEBを邪魔しないように、井戸の側面に慎重に媒体を取り外して追加してください。EBの繊細な性質と懸濁液培養のために、EBsを乱さないように培地を交換する際には、各ウェルに少量の液体を残す必要があります。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>ヒト心臓オルガノイド(hHO)分化: 注:すべてのメディアは、メディアの変更前に37°Cビーズまたはウォーターバスで温める必要があります。井戸の底部にあるオルガノイドの発生を妨げないように、井戸の側面に慎重に媒体を取り除き、追加します。撹拌を最小限に抑え、阻害剤や成長因子を徐々に除去するために、メディアの変更の間に、スヒールは必要ありません。2%B-27サプリメント(材料表)を有するRPMIは、分化プロトコル全体にわたって使用された。B-27サプリメントは、指定されない限りインスリンを含む(0-5日目にインスリンフリー)。 図 1C を参照してください。<ol>
<li>0日目<ol>
<li>中皮系に対する分化を開始するには、 各ウェルから培地の166 μLを除去し(総ウェル体積の2/3) 、インスリンフリーB-27サプリメント、6 μM CHIR99021、1.875 ng/mL骨形態形成タンパク質4(BMP4)、および1.5 ng/mL Activin Aを加えて4900μRの最終濃度を得る 1.25 ng/mL BMP4、および1 ng/mLアクティビンA.インキュベート37°C、5%CO2で24時間インキュベート。</li>
		</ol>
</li>
		<li>1日目<ol>
<li>各ウェルから培地の166 μLを取り除き、インスリンフリーB-27サプリメントで新鮮なRPMI 1640の166 μLを追加します。37°Cで24時間、5%CO2でインキュベートする。</li>
		</ol>
</li>
		<li>2日目<ol>
<li>心臓中皮質の仕様を誘導するには、各ウェルから166μLの培地を取り出し、インスリンフリーB-27サプリメントを含むRPMI 1640の166 μLと3 μM Wnt-C59を加え、37°Cで48時間インキュベートします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>4日目<ol>
<li>各ウェルから培地の166 μLを取り除き、インスリンフリーB-27サプリメントで新鮮なRPMI 1640の166 μLを追加します。37°Cで48時間、5%CO2でインキュベートする。</li>
		</ol>
</li>
		<li>6日目<ol>
<li>各ウェルから166 μLの培地を取り出し、B-27サプリメントで166 μLのRPMI 1640を追加します。37°Cで24時間、5%CO2でインキュベートする。</li>
		</ol>
</li>
		<li>7日目<ol>
<li>プロエピカルジアル分化を誘導するには、各ウェルから166μLの培地を取り出し、B-27サプリメントを含む新鮮なRPMI 1640の166 μLを加え、2 μM CHIR99021の最終ウェル濃度を3μM CHIR99021に加えます。37°Cで1時間、5%CO2でインキュベートする。</li>
			<li>各ウェルから166 μLの培地を取り出し、B-27サプリメントを含む新鮮なRPMI 1640を166 μL加えます。37°Cで48時間、5%CO2でインキュベートする。 注:オルガノイドはメディアの変更のために動きやすいので、7日目にこの2番目の中程度の変更には特別な注意が必要です。</li>
			<li>7日目以降から分析または実験のために収集または転送まで、各ウェルから166 μLの培地を取り除き、B-27サプリメントを含む166 μLの新鮮なRPMI 1640を加えて、48時間ごとに培地変更を行います。 注:オルガノイドは、以前の発達段階が興味を持っていない限り、15日目に分析と実験の準備ができています。それらは、長期培養または成熟実験のために15日目を過ぎて培養することができる。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. オルガノイド解析
<ol><li>オルガノイド全体の転送(生きているかまたは固定される) 注:生きたオルガノイドの転写のために、使用されるピペットの先端が無菌であることを確認してください。<ol>
<li>チップ開口部からP200ピペットチップを5~10mm切り落とし、直径2~3mmの広い開口部を得ます。</li>
		<li>ピペットが完全に垂直(プレートに垂直)になるように、オルガノイドを含む丸底のウェルに先端をまっすぐに挿入します。チップを媒体に挿入する前に、ピペットプランジャーが既に押されていることを確認してください。</li>
		<li>ピペットプランジャーをゆっくりと放出し、オルガノイドを収集するのに十分な媒体(100〜200 μL)を取り上げます。</li>
		<li>オルガノイドを培地中の標的宛先に移す(例えば、固定用、ライブイメージング、電気生理学記録、新しいプレート培養)。</li>
	</ol></li>
	<li>オルガノイドの固定 注:オルガノイドの固定と染色は、96ウェル培養プレートまたはマイクロ遠心チューブのいずれかで行うことができます。パラホルムアルデヒド(PFA)は、ヒュームフードでのみ取り扱う必要があります。<ol>
<li>マイクロ遠心チューブの固定のために、チューブあたり1〜8オルガノイドでチューブを分離するために生きたオルガノイドを移管する。 注:チューブあたり8オルガノイドを超えないようにしてください。</li>
		<li>オルガノイドに触れることなく、できるだけ多くの媒体をチューブから慎重に取り出し、廃棄してください。</li>
		<li>各チューブまたはウェルに4%PFAを加えます(マイクロ遠心分離チューブあたり300〜400 μL、96ウェルプレートのウェルあたり100〜200 μL)。室温で30~45分間インキュベートします。 注:1時間を超えるインキュベーション時間は、抗原の取得手順を必要とし、推奨されません。</li>
		<li>オルガノイドを邪魔することなく、PFAを安全に廃棄してください。4%PFAに使用した同じ体積を使用して、1.5 g/Lグリシン(DPBS/Gly)を加えたDPBSで3つのスリーチを行い、5分間の間に5分間待つ。DPBS/Glyを除去し、免疫染色またはその他の分析に進むか、DPBSを追加し、最大2週間の将来の使用のために4°Cで保存します。 注:固定オルガノイドを2週間以上保存すると、組織の劣化や汚染が発生する可能性があり、推奨されません。</li>
	</ol></li>
	<li>全マウント免疫蛍光染色<ol>
<li>100 μLのブロッキング/パーメアビライゼーション溶液(10%正常ロバ血清+ 0.5% ウシ血清アルブミン(BSA)+ 0.5%トリトンX-100(1x DPBS)を、固定オルガノイドを含む各ウェルまたはチューブに加えます。シェーカーで一晩室温でインキュベートします。 注:チューブあたり8オルガノイドを超えないようにしてください。</li>
		<li>オルガノイドに触れることなく、できるだけ多くのブロッキング溶液を慎重に除去し、廃棄してください。DPBSで3つのスッシュを行い、5分の間にスミを待つ。</li>
		<li>一次抗体溶液(1%正常ロバ血清+ 0.5%BSA + 0.5%トリトンX-100 1x DPBS)を推奨濃度で調製します。シェーカーで4°Cで24時間インキュベートします。</li>
		<li>オルガノイドに触れることなく、できるだけ多くの抗体溶液を慎重に除去し、廃棄してください。DPBSで3つのスッシュを行い、5分の間にスミを待つ。</li>
		<li>推奨される濃度で目的の二次抗体を用いて、二次抗体溶液(1%正常ロバ血清+0.5%BSA+0.5%トリトンX-100(1x DPBS)を調製します。抗体が蛍光標識されている場合は、シェーカー上で24時間、暗闇の中で4°C(例えば、アルミ箔で覆われている)でインキュベートする。</li>
		<li>オルガノイドに触れることなく、できるだけ多くの抗体溶液を慎重に除去し、廃棄してください。DPBSで3つのスッシュを行い、5分の間にスミを待つ。</li>
		<li>オルガノイドを含むカバースリップが配置されるスライドの端近くに、取り付け媒体( 材料表を参照)に取り付けたビーズ(直径90~300 μm)でスライドを準備します。 注:続行する前に、ビーズの周りの取り付け媒体を乾燥させることをお勧めします。これによりビーズが動き回るのを防ぐことができます。 図 2 を参照してください。</li>
		<li>切られたピペットチップを使用して染色されたオルガノイドをスライドに移し、ビーズの間で、スライド上でオルガノイド間の接触を避けるために間隔を確保する。ロールアップされた実験室のワイプのコーナーを使用して、オルガノイドの周りの余分な液体を慎重に除去します。</li>
		<li>オルガノイドを取り付け清算媒体(フルクトースグリセロールクリアリング溶液は60%(vol/vol)グリセロール、2.5 Mフルクトース)37 で覆い、1スライド当たり120-150μLの取り付け用媒体を使用します。 注:それは非常に粘性であるため、取り付けクリアメディアで作業するときはカットピペットチップを使用することをお勧めします。</li>
		<li>取り付けクリアソリューションで覆われたオルガノイドでスライドの上にカバースリップを置き、スライド上のカバースリップをゆっくりと押し、オルガノイドが取り付けられたビーズの間であることを確認します。</li>
		<li>トップコートネイルニスを使用して、スライド上のカバースリップの周囲をシールします。スライドを室温で1時間乾燥させます。暗闇の中で4°Cで長期保存を行います。</li>
	</ol></li>
	<li>生きた心臓オルガノイドにおけるカルシウム過渡イメージング 注:メーカーの指示によると、Fluo4-AMは、0.5 mMの最終ストック溶液濃度にジメチルスルホキシド(DMSO)で再構成されました。フルー4-AMは、96ウェルプレートでオルガノイドウェルに直接添加した。<ol>
<li>RPMI 1640培地を用いてオルガノイドに2本の打ち込みを行う。<ol>
<li>使用済みの培地を166μL取り出します。</li>
			<li>166 μLの加温 RPMI 1640 培地を加え、166 μL の培地を取り出し、166 μL の新鮮な RPMI 1640 培地を追加します。 注:廃棄物や細胞の破片を除去するために、このスワッシュを行います。媒体の3分の2は、機能的アッセイの前に井戸底のオルガノイドを乱さないように、打ち上げ中に井戸から取り除かれる。</li>
		</ol>
</li>
		<li>オルガノイドにフルー4-AM培地を加えます。<ol>
<li>B-27サプリメントを含むRPMI 1640にDMSOで再構成されたフル4-AMを加え、1.5 μMの溶液を調製します。</li>
			<li>ウェルから166μLの培地を取り出します。</li>
			<li>B-27サプリメントを含むRPMI 1640に1.5 μM Fluo4-AMの166 μLを加え、最終ウェル濃度1 μMを含み、37°Cでインキュベートし、30分間5%CO2 をインキュベートします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ステップ 3.4.1 のように 2 つのス述を行います。</li>
		<li>B-27サプリメントを含むRPMI 1640の166 μLをウェルに加えます。</li>
		<li>P200ピペットチップのカットチップを使用して、オルガノイドをガラス底のペトリ皿(例えば、#1.5高性能カバーグラス付き8ウェルチャンバーカバーガラス)に100-200 μLの培地で移します。 注:オルガノイド全体の転送に関するセクション3.1を参照してください。</li>
		<li>画像オルガノイドは、37°C、5%CO2の温度およびCO2制御チャンバーを備えた顕微鏡下で生きています。</li>
		<li>オルガノイドの様々な場所でいくつかの10〜20 sのビデオを記録し、カルシウムが細胞に出入りするにつれて蛍光強度レベルの増加と減少を示す。 注: 高解像度の録画の場合は、10 fps 以上の速度で録音することをお勧めします。50 fps を推奨します。</li>
		<li>対象領域を選択し、時間の経過に伴う強度レベルを測定することにより、画像解析ソフトウェア(ImageJなど)を使用してビデオを解析します。</li>
		<li>ΔF/F0 と時間(ミリ秒)とプロットを使用して、強度記録を正規化します。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者は宣言する利害の対立を持っていません。

ヒト幹細胞由来心筋細胞および心臓由来の他の細胞の最近の進歩は、ヒト心臓の発達22,24,25および疾患26,27,28をモデル化し、治療をスクリーニングするためのツールとして使用されています29,30および有毒物質31,32.ここでは、EJB を生成して高度に複雑な hHOs に分け込める、実装が容易で、非常に再現性の高いプロトコルを報告します。このプロトコルは、hPSCやhESCs23を...

先天性心不全(CHD)は、ヒトにおける先天性欠損の最も一般的なタイプであり、全ての出生の約1%に影響を及ぼす1,2,3。ほとんどの場合、CHD の理由は不明のままです。開発中の人間の心臓に近いヒトの心臓モデルを実験室で作成する能力は、代理動物モデルではなく、ヒトにおけるCHDの根本的な原因を直接研究するための重要な前進を構成する。
実験室で成長した組織モデルの縮図は、細胞組成および生理機能に関心のある器官に似たオルガノイド、3D細胞構築物である。オルガノイドは幹細胞や前駆細胞に由来することが多く、脳4,5、腎臓6、7、腸8、9、肺10、11、肝臓12,13、膵臓などの多くの臓器のモデル化に成功しています14,15、ちょうどいくつかの名前を付けるために。最近の研究は、体外で心臓の発達を研究するために自己集合性心臓オルガノイドを作成する実現可能性を実証することが明らかになってきました。これらのモデルには、マウス胚性幹細胞(mESC)を使用して、房室仕様18までの初期心臓発達16,17、ヒト多能性幹細胞(hPSC)をモデル化し、多発層心内膜オルガノイド19および非常に複雑な細胞組成を有するチャンバードカーディオイド20を生成することを含む。
本論文は、高い複雑なhHOsを効率的かつ費用対効果の高い方法で生成するための、新しい3段階のWNT変調プロトコルを紹介する。オルガノイドは96ウェルプレートで生成され、容易に自動化できるスケーラブルでハイスループットなシステムをもたらします。この方法は、中皮および心中皮形成、第1および第2の心臓フィールド仕様、前EPICAR器官形成、および房室仕様を含む、hPSC凝集体を作成し、心新生の発達段階を引き起こすことに依存する。分化の15日後、hhOsは、心臓に見られるすべての主要な細胞系統、明確に定義された内部チャンバー、心房および心室室、およびオルガノイド全体の血管ネットワークを含む。この高度で再現性の高い心臓オルガノイドシステムは、心臓の発達、疾患、薬理学的スクリーニングの研究において、構造的、機能的、分子的、および転写学的分析を調査するのに適しています。

<table><tbody><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse</td><td>Invitrogen</td><td>A-21202</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse</td><td>Invitrogen</td><td>A-21203</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A-21207</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 ロバ アンチヤギ</td><td>Invitrogen</td><td>A32849</td><td>1:200</td></tr><tr><td>HAND1</td><td>Abcam</td><td>ab196622</td><td>ウサギ; 1:200</td></tr><tr><td>HAND2</td><td></td><td>Abcam ab200040</td><td>ウサギ; 1:200</td></tr><tr><td>NFAT2</td><td>Abcam</td><td>ab25916</td><td>ウサギ; 1:100</td></tr><tr><td>PECAM1</td><td>DSHB</td><td>P2B1</td><td>ウサギ; 1:50</td></tr><tr><td>TNNT2</td><td>Abcam</td><td>ab8295</td><td>マウス;1:200</td></tr><tr><td>THY1</td><td>Abcam</td><td>ab133350</td><td>ウサギ; 1:200</td></tr><tr><td>TJP1</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-19090</td><td>ヤギ; 1:250</td></tr><tr><td>VIM</td><td>Abcam</td><td>ab11256</td><td>ヤギ; 1:250</td></tr><tr><td>WT1</td><td>Abcam</td><td>ab89901</td><td>ウサギ; 1:200</td></tr><tr><td>培地および試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>NC9464543</td><td>細胞解離試薬</td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R&D Systems</td><td>338AC010</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (マイナスインスリン)</td><td>Gibco</td><td>A1895601</td><td>インスリンフリー細胞培養サプリメント</td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>細胞培養サプリメント</td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>Gibco</td><td>PHC9534</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Bioworld</td><td>50253966</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck</td><td>442310</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)-フルクトース</td><td>ミリポア</td><td>Sigma F0127</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>ジメチル スルホキシド</td><td>ミリポア Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Flex Medium Kit</td><td>Gibco</td><td>A2858501</td><td>1% を含む多能性幹細胞 (PSC) 培地ペニシリン-ストレプトマイシン</td></tr><tr><td>Fluo4-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>ミリポア Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>ミリポア Sigma</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル GFR</td><td>コーニング</td><td>CB40230</td><td>基底膜細胞外マトリックス (BM-ECM)</td></tr><tr><td>ノーマル ロバ血清</td><td>ミリポア Σ</td><td>S30-100mL</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>MP バイオメディカル</td><td>IC15014601</td><td>PBS バッファーに溶解した粉末 &ndash; 4%</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液 (10x)</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Polybead Microspheres</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>73155</td><td>90 &micro;m</td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>NC0729236</td><td>hPSC用解離試薬</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Millipore Sigma</td><td>SML1045</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Gibco</td><td>1525006</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Vibrance Antifadeマウント 培地</td><td>ベクター研究所</td><td>H170010</td><td></td></tr><tr><td>WNT-C59</td><td>Selleck</td><td>NC0710557</td><td></td></tr><tr><td>その他の</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>02682002</td><td></td></tr><tr><td>15 mL ファルコン チューブ</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>1495970C</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 極低温バイアル</td><td>コーニング</td><td>13-700-500</td><td></td></tr><tr><td>50mL 試薬リザーバー</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13681502</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル平底 細胞培養プレート</td><td>コーニング</td><td>0720083</td><td></td></tr><tr><td>8 ウェルチャンバーカバー #1.5 高性能カバーガラス</td><td>セルビス</td><td>C8-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル クリア超低アタッチメント マイクロプレート</td><td>共演</td><td>07201680</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>画像処理ソフトウェア</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>06-666</td><td>laboratory wipes</td></tr><tr><td>Micro Cover Glass</td><td>VWR</td><td>48393-241</td><td>24 x 50 mm No. 1.5</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>Moxi Cell Counter</td><td>Orflo Technologies</td><td>&nbsp;MXZ001</td><td></td></tr><tr><td>Moxi Z セルカウントカセット &ndash;タイプM</td><td>オルフロー&nbsp;テクノロジー</td><td>MXC001</td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット</td><td>フィッシャーブランド</td><td>FBE1200300</td><td>30-300 & マイクロ;L</td></tr><tr><td>オリンパス cellVivo</td><td>オリンパス</td><td></td><td>カクリウムイメージング、Imagej</td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1による分析 遠心分離機</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>75004261</td><td></td></tr><tr><td>サーマルミキサー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-687-717</td><td></td></tr><tr><td>トップコート ネイルヴァリッシュ</td><td>Seche Vite</td><td></td><td>どのスーパーマーケットからでも購入可能</td></tr></tbody></table>

多能性幹細胞由来の自己組織化ヒト心臓オルガノイドの生成

Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells

健康と病気におけるヒト心臓の発達を研究する能力は、 インビトロでのヒト心臓の複雑さをモデル化する能力によって非常に制限される。オルガノイドやオルガンオンチップなどの複雑な 生体内 表現型をモデル化できる、より効率的な臓器のようなプラットフォームを開発することは、人間の心臓の発達と病気を研究する能力を高めるでしょう。本論文では、ヒト多能性幹細胞を用いた自己組織化と、低分子阻害剤を用いた段階的発達経路活性化により、非常に複雑なヒト心臓オルガノイド(hH)を生成するプロトコルについて述べている。胚体(EBs)は、ラウンドボトム、超低付着ウェルを備えた96ウェルプレートで生成され、個別の構築物の懸濁培養を促進します。
EBsは、心臓中皮運命を誘導するための最初のWnt経路活性化、決定的な心臓系統を作成するためのWnt阻害の第2ステップ、および前EPICAR組織を誘導する第3のWnt活性化ステップを含む3段階のWntシグナル伝達変調戦略によってhHOsへの分化を受ける。これらのステップは、96ウェル形式で行われ、非常に効率的で再現性が高く、1回の実行ごとに大量のオルガノイドを生成します。分化の3日目から11日目までの免疫蛍光イメージングによる分析は、心房および心室心筋細胞の領域を有する心筋組織および内腔内の内膜組織を含む、15日目のhHOs内の第1および第2の心臓フィールド仕様および非常に複雑な組織を明らかにする。オルガノイドはまた、構造全体に複雑な血管ネットワークを示し、外膜組織の外部内層を示す。機能的な観点から、hHOsは強く打ち負かし、Fluo-4ライブイメージングによって決定される正常なカルシウム活性を示す。全体として、このプロトコルは、ヒト臓器様心臓組織 におけるインビトロ 研究のための強固なプラットフォームを構成する。

インビトロで自己組織化hHOを達成するために、我々は、Wnt経路モジュレーターを使用した心筋細胞21および心外細胞22の2D単層分化および成長因子BMP4およびアクチビンAを用いた3D前心臓オルガノイド16に関して以前に説明した分化プロトコルを修正し、組み合わせた図Wnt経路活性化因子CHIR99021の濃度と曝露期間は、ヒトPSCに由来する高度に再現性の高い複雑なhHHOsを得るように最適化された。
EBは、0日目に分化を開始する前に、24時間後に培地変化で48時間インキュベートした。0日目には、各ウェルの中心にある黒色球状の凝集体として、光顕微鏡下で見える必要があります(図1B)。分化プロトコルは、ちょうど24時間のWnt経路活性化および成長...

ここでは、自己組織化によってヒト多能性幹細胞を用いて、発達的に関連するヒト心臓オルガノイド(hH)を効率的に作成するためのプロトコルについて述べた。このプロトコルは、発達的手がかりの逐次活性化に依存し、非常に複雑で機能的に関連するヒト心臓組織を生成する。

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in ...

このプロトコルは、細胞株を越えて再現可能な、簡単な費用対効果の高い方法で発達中の人間の心臓に近い複雑な3D構造を作成することを可能にします。これは、チャンバーや血管ネットワークを含む心臓のすべての細胞タイプを生じさせる分化の3つのステップを持つ単一のプロトコルで構成されています。この技術は、広範囲のヒト心血管疾患をモデル化し、効果的な薬理学的治療法をスクリーニングすることを可能にする。その設計の高いスループットの性質のおかげで。この方法は、発達中のヒト心臓およびそれに一般的に関連する疾患を調査するのに有用である。そのうちの一つは先天性心不全です。このプロトコルには、基本的な細胞培養能力が必要です。オルガノイドの取り扱いだけでなく、気配りや繊細なピペットをお勧めします。最初に、分化の2日前に胚体またはEJBを作成します。DBPS を使用してサブコンフルエント HPCs を少なくとも 10 秒間洗浄します。その後、DPBSを吸引します。室温ACUTAを1ミリリットル加え、顕微鏡下でチェックしながら、剥離を誘発するために3〜5分間、毎分約5回プレートを軽くタップします。その後、PSC培地とチアス・アビンまたはティアスを1ミリリットル加えて反応を止めます。ウェル内のメディアを上下にピペットし、2〜3回、単一の細胞懸濁液を生成し、細胞を収集する。その後、単一細胞懸濁液を遠心分離管に移し、上清を吸引し、PSC培地とチアスの1ミリリットルで細胞を再使用して300倍G.吸引して5分間回転させます。DPBSで細胞を希釈します。細胞カウンターまたはヘモシストメーターを使用して細胞を数え、PSC培地中の細胞をチアスで1ミリリットル当たり100,000細胞の濃度に希釈する。希釈した細胞の100マイクロリットルを、丸底超低アタッチメント96ウェルプレートの各ウェルに懸濁液を加える。プレートを100倍Gで3分間遠心し、摂氏37度と炭酸ガス5%で24時間インキュベートする。24時間後、慎重に各井戸から媒体の50マイクロリットルを除去し、新鮮なPSC媒体の200コアのごみを追加し、井戸あたり250マイクロリットルの体積のために摂氏37度に暖めます。セルを摂氏37度、炭酸ガス5%で24時間インキュベートします。各ウェルの片側から166マイクロリットルまたは2分の2の培地を取り除き、インスリンフリーB27サプリメントを含むRPMI 1640の166マイクロリットル、6マイクロモルモルチア990211、骨モルモジェネティックタンパク質4の1ミリリットル当たり0.875ナノグラム、ActivA.Incubateあたり1ミリリットル当たり1.5ナノグラムを37°Cで24時間取り出します。24時間後、各ウェルの片側から166マイクロリットルの培地を取り除き、インスリンフリーB27サプリメントで新鮮なRPMI 1640の166マイクロリットルを追加します。摂氏37度と5%の二酸化炭素で24時間インキュベートします。2日目に心臓中皮の仕様を誘導するには、各ウェルから166マイクロリットルの培地を取り除き、166マイクロリットルのRPMI 1640を加え、インスリンフリーB27サプリメントと3つのマイクロモルWnt-C59を含み、48時間インキュベートを続けます。4日目には、各井戸から166マイクロリットルの培地を取り除き、インスリンフリーB27サプリメントで新鮮なRPMI 1640の166マイクロリットルを追加し、さらに48時間インキュベートします。6日目には、各井戸から166マイクロリットルの培地を取り除き、B27サプリメントでRPMI 1640の166マイクロリットルを追加します。これとすべてのその後のメディアの変更のために、 インスリンで B27 サプリメントを使用して、さらに 24 時間インキュベート.7日目に、細胞培養は、プロ心筋分化の準備ができている。各井戸から166マイクロリットルの培地を取り出し、B27サプリメントと3つのマイクロモルチア99021を含む新鮮なRPMI 1640の166マイクロリットルを追加します。その後、1時間インキュベートで、インキュベーターからプレートを1時間取り出した後、各ウェルの片側から166マイクロリットルの培地を取り除き、B27サプリメントを含む新鮮なRPMI 1640の166マイクロリットルを追加し、さらに48時間インキュベートを続けます。収集まで48時間ごとにこのプロセスを繰り返します。オルガノイドは15日目に分析と実験の準備ができているオルガノイド全体を移送し、P200ピペットの先端を切り取り、直径約2〜3ミリメートルの開口部から5〜10ミリメートル。ピペットプランジャーを押し、オルガノイドと一緒に丸底ウェルに垂直にチップを挿入します。オルガノイドを収集し、ターゲット先に転送するのに十分な媒体の約100〜200マイクロリットルを取ります。分化 EBS が黒球形の質量として出現する前に、分化プロセスは、ちょうど 24 時間の Wnt 経路活性化と成長因子の追加でゼロ日目に開始されます。さらに2日目にWnt C59を編集すると、オルガノイドは約200マイクロメートルから最大1ミリメートルに拡大されます。ヒト心臓オルガノイドは早ければ6日目に鼓動を始め、オルガノイドの100%は10日目までに目に見える拍動を示した。7日目のオルガノイドの高倍率画像は、ほとんどの手1発現細胞が起源の心筋細胞であり、手2が第2のハートフィールド、前駆細胞からの非筋細胞であることを明らかにした。手1と手の両方のRNA転写物は、RNAシーケンシングデータで3日目以降に発現した。FHFマーカーは3日目と11日目に高く発現し、SFマーカーは13日目以降より高く発現した。免疫蛍光染色は、ヒトの心臓を構成する様々なヒト心臓細胞型系統の存在を明らかにした。心筋および心外膜組織、心筋細胞、内皮細胞、および心臓線維芽細胞など。上記の細胞系統を発現するマーカーは、RNA SAC遺伝子発現プロファイルにおいても観察された。オルガノイドの個々の細胞の生きたカルシウムイメージングは、オルガノイドの電気生理学的機能を測定するために使用された。Fluo-4蛍光強度は、定期的な作用電位を明らかにする細胞からのカルシウム入り口出口のために時間の経過とともに変化した。オルガノイドの高倍率領域にわたってカルシウム強度を示すヒートマップは、カルシウム過渡量および個々の細胞による強度の増加を示す。このプロトコルを試みるとき、EBおよびそれに続くオルガノイドはプレートの底に取り付けられていないことを覚えておいてください、そして我々は注意深い媒体の変更を必要とする媒体の他に取り外しと動き回る。オルガノイドは、成熟技術に導入された長期間培養したり、機械的または電気的コンディショニングなどの外部刺激にさらされたり、毒素などのストレッサーにさらされたりすることさえできます。この技術は、研究ではアクセスできないヒト胎児心臓発達の段階へのアクセスを可能にし、心臓の発達と病因に関する新しい洞察への道を開く。

generating-self-assembling-human-heart-organoids-derived-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このビデオでは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)から前脳型オルガノイドの作成を概説し、幹細胞凝集体から脳の皮質を模倣してさまざまなニューロンタイプに分化する複雑な構造への進行を示しています。...

ヒト人工多能性幹細胞からの前脳型大脳オルガノイドの生成

ここで我々 アクチビン A のレンチ ウイルスを介した Id1...

最初心臓フィールドのような心臓前駆細胞およびひと多能性幹細胞からのような心室心筋細胞の生成

このプロトコルは、脳細胞の多様性と細胞組織の多くの特徴を維持しながら、外因性成長因子または基下膜マトリックスを用いることなく、単純化された低コストの方法で脳オルガノイドを生成する手段として生成された。...

ヒト胚性幹細胞から脳オルガノイドを生成するための静的自己指向法

ここでは、ヒト多能性幹細胞(hPSC)から腎臓オルガノイドを生成するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、2週間以内に腎臓オルガノイドを生成する。得られた腎臓オルガノイドは、大規模なスピナーフラスコまたはマルチウェル磁気攪拌プレートで培養して、薬物試験アプローチを並行させることができます。...

ヒト多能性幹細胞から腎臓オルガノイドを生成するための簡略化された方法

このプロトコルの目的は、生体整血、コラーゲンベースのヒドロゲル、心臓組織工学、薬物スクリーニング、および疾患モデリングにおける応用のために、心臓線維芽細胞(CF)と共培養された幹細胞由来心筋細胞で構成される、高度に整列したヒト心臓組織の三次元(3D)微小流体モデルの開発を説明し、実証することである。...

マイクロ流体プラットフォーム内での3D組織化ヒト心臓組織の開発

ここでは、ハイスループットの多次元フォーマットで培養されたヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞からの心臓スフェロイド(CS)の生成と凍結保存のための一連のプロトコルを紹介します。この3次元モデルは、疾患モデリング、ハイスループットスクリーニングのための堅牢なプラットフォームとして機能し、凍結保存後もその機能を維持します。...

ヒト誘起多能性幹細胞由来心臓スフェロイドの作製、ハイスループットスクリーニング、バイオバンキング

このプロトコルは、ヒト多能性および人工多能性幹細胞からの自己組織化血管の生成を記載する。これらの血管ネットワークは、周皮細胞、平滑筋アクチン、および連続した基底膜に囲まれた広範で接続された内皮ネットワークを示します。...

多能性幹細胞からのヒト血管オルガノイドの作製

このプロトコールは、ヒト多能性幹細胞を使用して血管オルガノイドを生成する方法を示します。...

ヒト人工多能性幹細胞からの血管オルガノイド作製

自己組織化型ヒト心臓オルガノイド(hCOs)は、ヒトの心臓発生や疾患をモデル化するための新興システムです。ここでは、低酸素再酸素化によるhCOの生成および損傷の方法論と、損傷後の予想される組織学的および機能的転帰の詳細を提供します。...

自己組織化ヒト心型心肌における低酸素再酸素損傷モデル

ここでは、極低温固体ミリングによって、哺乳動物細胞を破壊し、得られた細胞粉末から細胞抽出物を生成し、そして抗体結合ミクロンスケールの常磁性ビーズ上にアフィニティー捕捉により、目的のタンパク質複合体を単離するためのプロトコルを説明します。...

Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

学ぶ 多能性幹細胞を用いた自己組織化ヒト心臓オルガノイドの生成法。3段階の分化プロトコルで心臓の全細胞タイプと血管ネットワークを再現し、心血管疾患のモデリングと薬剤スクリーニングに応用可能です。

多能性幹細胞由来の自己組織化ヒト心臓オルガノイドの生成

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