多能性幹細胞由来の自己組織化ヒト心臓オルガノイドの生成
September 15th, 2021
ここでは、自己組織化によってヒト多能性幹細胞を用いて、発達的に関連するヒト心臓オルガノイド(hH)を効率的に作成するためのプロトコルについて述べた。このプロトコルは、発達的手がかりの逐次活性化に依存し、非常に複雑で機能的に関連するヒト心臓組織を生成する。
このプロトコルは、細胞株を越えて再現可能な、簡単な費用対効果の高い方法で発達中の人間の心臓に近い複雑な3D構造を作成することを可能にします。これは、チャンバーや血管ネットワークを含む心臓のすべての細胞タイプを生じさせる分化の3つのステップを持つ単一のプロトコルで構成されています。この技術は、広範囲のヒト心血管疾患をモデル化し、効果的な薬理学的治療法をスクリーニングすることを可能にする。
その設計の高いスループットの性質のおかげで。この方法は、発達中のヒト心臓およびそれに一般的に関連する疾患を調査するのに有用である。そのうちの一つは先天性心不全です。
このプロトコルには、基本的な細胞培養能力が必要です。オルガノイドの取り扱いだけでなく、気配りや繊細なピペットをお勧めします。最初に、分化の2日前に胚体またはEJBを作成します。
DBPS を使用してサブコンフルエント HPCs を少なくとも 10 秒間洗浄します。その後、DPBSを吸引します。室温ACUTAを1ミリリットル加え、顕微鏡下でチェックしながら、剥離を誘発するために3〜5分間、毎分約5回プレートを軽くタップします。
その後、PSC培地とチアス・アビンまたはティアスを1ミリリットル加えて反応を止めます。ウェル内のメディアを上下にピペットし、2〜3回、単一の細胞懸濁液を生成し、細胞を収集する。その後、単一細胞懸濁液を遠心分離管に移し、上清を吸引し、PSC培地とチアスの1ミリリットルで細胞を再使用して300倍G.吸引して5分間回転させます。
DPBSで細胞を希釈します。細胞カウンターまたはヘモシストメーターを使用して細胞を数え、PSC培地中の細胞をチアスで1ミリリットル当たり100,000細胞の濃度に希釈する。希釈した細胞の100マイクロリットルを、丸底超低アタッチメント96ウェルプレートの各ウェルに懸濁液を加える。
プレートを100倍Gで3分間遠心し、摂氏37度と炭酸ガス5%で24時間インキュベートする。24時間後、慎重に各井戸から媒体の50マイクロリットルを除去し、新鮮なPSC媒体の200コアのごみを追加し、井戸あたり250マイクロリットルの体積のために摂氏37度に暖めます。セルを摂氏37度、炭酸ガス5%で24時間インキュベートします。
各ウェルの片側から166マイクロリットルまたは2分の2の培地を取り除き、インスリンフリーB27サプリメントを含むRPMI 1640の166マイクロリットル、6マイクロモルモルチア990211、骨モルモジェネティックタンパク質4の1ミリリットル当たり0.875ナノグラム、ActivA.Incubateあたり1ミリリットル当たり1.5ナノグラムを37°Cで24時間取り出します。24時間後、各ウェルの片側から166マイクロリットルの培地を取り除き、インスリンフリーB27サプリメントで新鮮なRPMI 1640の166マイクロリットルを追加します。摂氏37度と5%の二酸化炭素で24時間インキュベートします。
2日目に心臓中皮の仕様を誘導するには、各ウェルから166マイクロリットルの培地を取り除き、166マイクロリットルのRPMI 1640を加え、インスリンフリーB27サプリメントと3つのマイクロモルWnt-C59を含み、48時間インキュベートを続けます。4日目には、各井戸から166マイクロリットルの培地を取り除き、インスリンフリーB27サプリメントで新鮮なRPMI 1640の166マイクロリットルを追加し、さらに48時間インキュベートします。6日目には、各井戸から166マイクロリットルの培地を取り除き、B27サプリメントでRPMI 1640の166マイクロリットルを追加します。
これとすべてのその後のメディアの変更のために、 インスリンで B27 サプリメントを使用して、さらに 24 時間インキュベート.7日目に、細胞培養は、プロ心筋分化の準備ができている。各井戸から166マイクロリットルの培地を取り出し、B27サプリメントと3つのマイクロモルチア99021を含む新鮮なRPMI 1640の166マイクロリットルを追加します。
その後、1時間インキュベートで、インキュベーターからプレートを1時間取り出した後、各ウェルの片側から166マイクロリットルの培地を取り除き、B27サプリメントを含む新鮮なRPMI 1640の166マイクロリットルを追加し、さらに48時間インキュベートを続けます。収集まで48時間ごとにこのプロセスを繰り返します。オルガノイドは15日目に分析と実験の準備ができているオルガノイド全体を移送し、P200ピペットの先端を切り取り、直径約2〜3ミリメートルの開口部から5〜10ミリメートル。
ピペットプランジャーを押し、オルガノイドと一緒に丸底ウェルに垂直にチップを挿入します。オルガノイドを収集し、ターゲット先に転送するのに十分な媒体の約100〜200マイクロリットルを取ります。分化 EBS が黒球形の質量として出現する前に、分化プロセスは、ちょうど 24 時間の Wnt 経路活性化と成長因子の追加でゼロ日目に開始されます。
さらに2日目にWnt C59を編集すると、オルガノイドは約200マイクロメートルから最大1ミリメートルに拡大されます。ヒト心臓オルガノイドは早ければ6日目に鼓動を始め、オルガノイドの100%は10日目までに目に見える拍動を示した。7日目のオルガノイドの高倍率画像は、ほとんどの手1発現細胞が起源の心筋細胞であり、手2が第2のハートフィールド、前駆細胞からの非筋細胞であることを明らかにした。
手1と手の両方のRNA転写物は、RNAシーケンシングデータで3日目以降に発現した。FHFマーカーは3日目と11日目に高く発現し、SFマーカーは13日目以降より高く発現した。免疫蛍光染色は、ヒトの心臓を構成する様々なヒト心臓細胞型系統の存在を明らかにした。
心筋および心外膜組織、心筋細胞、内皮細胞、および心臓線維芽細胞など。上記の細胞系統を発現するマーカーは、RNA SAC遺伝子発現プロファイルにおいても観察された。オルガノイドの個々の細胞の生きたカルシウムイメージングは、オルガノイドの電気生理学的機能を測定するために使用された。
Fluo-4蛍光強度は、定期的な作用電位を明らかにする細胞からのカルシウム入り口出口のために時間の経過とともに変化した。オルガノイドの高倍率領域にわたってカルシウム強度を示すヒートマップは、カルシウム過渡量および個々の細胞による強度の増加を示す。このプロトコルを試みるとき、EBおよびそれに続くオルガノイドはプレートの底に取り付けられていないことを覚えておいてください、そして我々は注意深い媒体の変更を必要とする媒体の他に取り外しと動き回る。
オルガノイドは、成熟技術に導入された長期間培養したり、機械的または電気的コンディショニングなどの外部刺激にさらされたり、毒素などのストレッサーにさらされたりすることさえできます。この技術は、研究ではアクセスできないヒト胎児心臓発達の段階へのアクセスを可能にし、心臓の発達と病因に関する新しい洞察への道を開く。
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概要
このプロトコルは、ヒトの多能性幹細胞を使用して、発達的に関連性の高いヒト心臓オルガノイド（hHO）を効率的に作ることを可能にします。この方法は、様々な心血管疾患をモデル化できる複雑で機能的に関連性の高い心臓組織を生成します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 心血管生物学
- 幹細胞研究
- オルガノイド技術
背景
- ヒト心臓オルガノイドは、心臓の発達を研究する上で重要です。
- それらは先天性心疾患やその他の心血管疾患に関する洞察を提供します。
- 現在の方法は再現性と複雑さに欠けています。
- このプロトコルはこれらの制限に対処することを目指しています。
研究の目的
- hHOを作成するための再現可能な方法を開発すること。
- ヒトの心血管疾患を効果的にモデル化すること。
- 薬理学的治療の高スループットスクリーニングを促進すること。
使用された方法
- 発達的なキューの連続的な活性化。
- 3ステップの分化プロトコル。
- ヒトの多能性幹細胞の利用。
- 血管ネットワークと心室の作成。
主な結果
- すべての心臓細胞タイプの成功的な生成。
- 発達中の心臓に似た複雑な3D構造の作成。
- 様々な心血管疾患をモデル化する能力。
- 高スループットな性質により、効果的な薬物スクリーニングが可能。
結論
- このプロトコルはhHO作成のための信頼できる方法を提供します。
- それは心臓の発達と疾患の理解を深めます。
- この技術は将来の心血管研究に有益です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables scalable, reproducible generation of human heart organoids (hHOs) from pluripotent stem cells, providing a physiologically relevant in vitro model for early-stage cardiovascular target validation and mechanistic de-risking. By recapitulating key developmental stages—including chamber formation, vascular network assembly, and electrophysiological activity—it supports predictive confidence in lead identification and preclinical disease modeling. The high-throughput 96-well format facilitates integration into discovery workflows for compound screening and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cardiac lineage specification and pathway modulation using Wnt signaling dynamics to validate therapeutic targets in human-relevant tissue.
- Operational Value: Produces organoids with atrial/ventricular cardiomyocytes, endocardial lining, and epicardial coverage, allowing functional assessment of target engagement across multiple cell types.
- Predictive Value: Robust beating and calcium flux activity from day 6 onward provide quantifiable functional readouts for early efficacy and safety screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates complex 3D tissues with vascular networks and chamber-like structures, enabling more physiologically predictive compound screening than 2D cultures.
- Operational Value: The 96-well ultra-low attachment format ensures reproducibility, scalability, and compatibility with automated liquid handling for medium-throughput screening campaigns.
- Assay Readiness: Organoids exhibit stable calcium transients and structural maturity by day 15, supporting consistent longitudinal assay windows for dose-response analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models congenital heart defects and other cardiovascular pathologies by capturing fetal heart developmental stages otherwise inaccessible in vitro.
- Translational Continuity: Expresses lineage-specific markers (HAND1, HAND2, NKX2-5, cTnT) and forms chamber-specific tissues, enabling correlation with clinical phenotypes.
- Risk Mitigation: Facilitates early detection of compound-induced cardiotoxicity through functional and structural endpoints, reducing late-stage attrition risk.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization to preclinical assessment, offering a human-relevant bridge between stem cell biology and disease modeling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cardiac developmental pathways and disease mechanisms via stepwise Wnt modulation and lineage-specific marker expression.
- Screening: Enables formation of assay-ready organoids in 96-well format with reproducible size and complexity, suitable for compound library screening.
- Analytics: Provides quantitative outputs including immunofluorescence-based lineage mapping, live calcium imaging (Fluo-4), and structural analysis of chambers and vascular networks.
- Translational Research: Models early human heart development and disease etiology, allowing preclinical evaluation of interventions in a contextually relevant system.
- Enterprise Reuse: The protocol’s simplicity, cost-effectiveness, and robustness across cell lines support adoption as a reusable platform technology across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by generating human heart organoids with multi-chamber morphology, vascularization, and electrophysiological function.
- Operational Value: Standardized 96-well workflow ensures reproducibility, minimizes variability, and scales efficiently for project-wide implementation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early mechanistic and functional data on compound effects in a human-relevant model.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on cardiotoxicity and efficacy profiles derived from complex tissue-level responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in pluripotent stem cell culture, embryoid body formation, and stepwise differentiation protocols.
- Dependent on access to ultra-low attachment 96-well plates, centrifugation equipment, and fluorescence or confocal imaging systems for analysis.
- Necessitates standardized media preparation and handling protocols to maintain organoid integrity during frequent medium changes.
- Adaptation to alternative disease models may require modulation of differentiation timing or supplementation with pathological stimuli.
- Long-term culture beyond day 15 may require maturation techniques or external conditioning to model adult-onset phenotypes.
