Name: マウスから骨髄由来樹状細胞を単離および培養するための経済的かつ効率的なプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 29 s
Description: 学ぶマウス骨髄由来樹状細胞の単離・培養法。GM-CSF/IL-4を用いた7日間培養で高純度DCを効率的に取得し、腫瘍免疫学研究のコストと時間を大幅削減する革新的プロトコルです。

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この研究は、天津科学技術計画プログラム(20JCQNJC00550)、天津健康科学技術プロジェクト(TJWJ202021QN033およびTJWJ202021QN034)の支援を受けました。

すべての手順は、南京医科大学動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
骨髄の単離とBM細胞の調製
<ol><li>C57BL/6マウス(18~22g、6~8週齢)をCO2 窒息で屠殺する。マウスを操作台に固定します。表面を70%エタノールで消毒する。</li>
	<li>脚の皮膚を切って筋肉と大腿動脈を露出させます。2つの鉗子を使用して大腿動脈を締め付けて引き裂き、近位端を腹部に向かって引き抜く。 注:大腿動脈を直接切断しないでください。さもなければ、それは過度の出血を引き起こし、視野を汚染するでしょう。</li>
	<li>大腿骨の周りのすべての筋肉を切断します。</li>
	<li>股関節脱臼の音が聞こえ、大腿骨頭の脱が見えるまで、マウスの下肢をゆっくりと外側に伸ばします。</li>
	<li>大腿骨頭の内側に沿ってはさみを使って下肢を体から分離します。</li>
	<li>膝関節の端から後肢を切断して、自由で完全な大腿骨を得る。</li>
	<li>ガーゼを使って大腿骨に付着した筋肉を取り除きます。 注:筋肉を直接引き裂かないでください。マウスの大腿骨は繊細であり、その完全性を維持しなければならない。</li>
	<li>大腿骨を75%アルコールに2〜5分間浸します。</li>
</ol>2. BMDCの誘導培養
<ol><li>残留アルコールをPBSですすいでください。止血鉗子を使用して大腿骨の中央部と底部をクランプし、もう1つのセットを使用して大腿骨の下端をクランプします。止血鉗子は大腿骨に横方向に適用され、大腿骨は骨端シールラインから分離される。 注:骨端線は、大腿骨が骨折するまで容易には見えません。このステップと次のステップはすべて、滅菌環境で実行されます。</li>
	<li>1mLシリンジ(針:0.6 mm x 25 mm)を使用して骨端ラインブレイクから骨髄腔を貫通し、針を回転させて大腿骨頭および骨髄腔を貫通する。骨が白くなるまで、GM-CSF/IL-4を含む1mLの完全培地を用いて骨髄腔をパルスし、フラッシュする。 注:完全培養培地:10%FBS、1%ペニシリン - ストレプトマイシン、55μM β-メルカプトエタノール、10 ng / mL GM-CSF、および10 ng / mL IL-4。</li>
	<li>すべての細胞を24 mLの完全培養培地(約5 x 105cells/ mL)に再懸濁する。混合後、すべての培地を4mL/ウェルの6ウェルプレート上に播種し、次いで5%CO2 と共に37°Cで2日間インキュベートした。 注:赤血球を溶解する必要はありません。</li>
	<li>2日後にすべての培地をGM-CSF/IL-4 7を含む培地に交換してください。4日目、6日目、および8日目に、培地の半分を10 ng/mL GM-CSF/IL-4を含む完全培地と交換する。 注:このステップでは、赤血球およびリンパ球などの浮遊細胞が除去される。</li>
	<li>細胞増殖を記録するために毎日写真を撮ります。6日目から始めて、1日に1ウェルの細胞を採取して細胞数をカウントし、CD11c、CD80、およびMHC II発現6、7を検出した。</li>
</ol>3. CD11c、CD80、およびMHC IIの発現のフローサイトメトリー検出
<ol><li>DCをPBSで洗浄した後、100μLのFACSバッファーに1 x 106細胞を再懸濁し、0.5μgの抗マウスCD16 /32抗体を加え、氷上で10分間インキュベートして非特異的抗原部位をブロックします。</li>
	<li>1 μg の Percp/cy5.5-CD11c、0.5 μg の PE-CD80、および 0.04 μg の APC-MHC II 抗体を加え、氷上で 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>1,000 x gで4°Cで3分間遠心分離し、上清を除去し、1mLの4%パラホルムアルデヒドを加え、4°Cで30分間固定し、300μLのFACS緩衝液に再懸濁する。</li>
	<li>フローサイトメトリーを実行します。</li>
</ol>

<ol><li>Huang, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-loaded+monocyte+administration+induces+potent+therapeutic+antitumor+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).</li>
<li>Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+loading+of+CTL+epitopes+onto+MHC+class+I+complexes+on+dendritic+cell+surface+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo.</a> Biomaterials. 182, 92-103 (2018).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li>
<li>Jiang, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactosylated+liposome+as+a+dendritic+cell-targeted+mucosal+vaccine+for+inducing+protective+anti-tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity.</a> Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+immunotherapies+to+improve+anticancer+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 566401(2020).</li>
<li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li>
<li>Son, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+bulk-culture+method+for+generating+mature+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells.</a> Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+protein+vaccine+based+on+Ag85B+and+STEAP1+induces+a+protective+immune+response+against+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer.</a> Vaccines. 9 (7), 786(2021).</li>
<li>Olweus, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+ontogeny%3A+A+human+dendritic+cell+lineage+of+myeloid+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).</li>
<li>Martin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concept+of+lymphoid+versus+myeloid+dendritic+cell+lineages+revisited%3A+both+CD8alpha%28-%29+and+CD8alpha%28%2B%29+dendritic+cells+are+generated+from+CD4%28low%29+lymphoid-committed+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors.</a> Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).</li>
<li>Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+human+and+mouse+dendritic+cell+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function.</a> Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).</li>
<li>Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+evolutionary+conservation+of+dendritic+cell+subset+identity+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions.</a> Frontiers in Immunology. 6, 260(2015).</li>
<li>Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%3A+in+vitro+differentiation+using+low+doses+of+recombinant+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).</li>
<li>Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+murine+dendritic+cells+from+flt3-ligand-supplemented+bone+marrow+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures.</a> Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).</li>
<li>Mayordomo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+dendritic+cells+pulsed+with+synthetic+tumour+peptides+elicit+protective+and+therapeutic+antitumour+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity.</a> Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).</li>
<li>Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-based+immunization+by+in+vivo+transfection+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells.</a> Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).</li>
<li>Brunner, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-prandial+administration+of+the+insulin+analogue+insulin+aspart+in+patients+with+type+1+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus.</a> Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).</li>
<li>Koido, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+antitumor+immunity+by+vaccination+of+dendritic+cells+transfected+with+MUC1+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA.</a> Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).</li>
<li>Jonasson, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strength+of+the+porcine+proximal+femoral+epiphyseal+plate%3A+The+effect+of+different+loading+directions+and+the+role+of+the+perichondrial+fibrocartilaginous+complex+and+epiphyseal+tubercle+-+An+experimental+biomechanical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Orthopaedics%22%5BJournal%5D)">Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle - An experimental biomechanical study.</a> Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4(2014).</li>
<li>Labeur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tumor+immunity+by+bone+marrow-derived+dendritic+cells+correlates+with+dendritic+cell+maturation+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage.</a> Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).</li>
<li>Hinkel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+dendritic+cells+generated+from+nonfractionated+bulk+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures+induce+growth+of+cytotoxic+T+cells+against+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma.</a> Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).</li>
</ol>

すべての著者は、利益相反はなく、開示するものは何もないと宣言します。

ヒトおよびマウスは、古典的なDC(cDC、cDC1およびcDC2を含む)、形質細胞様DC(pDC)、および単球由来DC(MoDC)を含む異なるDCサブセットを有する9、10、11。cDC1sは細胞内病原体および癌に対する細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を調節し、cDC2sは細胞外病原体、寄生虫、およびアレルゲンに対する免疫応答を調節することが一般に受け入れられている12。かなりの数のDCを、GM−CSFおよびIL−4の存在下でマウスのBM前駆細胞からインビトロで産生することができる6、13、14。DCの純度と量は、DC免疫療法の成功に重要な役割を果たします。研究者らは、1 x 105〜1 x 106 ...

樹状細胞(DC)は、ナイーブT細胞を活性化し、感染症、アレルギー疾患、および腫瘍細胞に対して特異的な細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を誘導するための最も強力な抗原提示細胞(APC)である1,2,3。DCは自然免疫と獲得免疫との間の主要なリンクであり、免疫学的防御および免疫寛容の維持に不可欠な役割を果たす。過去40年間、多くの研究者がDCのサブセットと炎症と免疫におけるその機能を定義しようとしてきました。これらの研究によると、DCは骨髄細胞からの骨髄系およびリンパ系に沿って発達する。腫瘍ワクチンは近年、重要なマイルストーンを獲得し、有望な未来を持っています。機械的には、腫瘍ワクチンは、腫瘍抗原を用いて細胞傷害性Tリンパ球を活性化することによって免疫応答を調節し、腫瘍増殖を防止する。DCに基づくワクチンは、腫瘍免疫療法において重要な役割を果たしており、最も有望な抗腫瘍療法の1つとして同定されている1,4。さらに、DCは、新しい分子標的薬および免疫チェックポイント阻害剤の試験に広く使用されている5。
研究者は、DCの役割をさらに研究するために、多数の高純度DCを緊急に必要としています。しかし、DCは様々な組織や血液ではまれであり、ヒトや動物の血球のわずか1%しか占めていません。骨髄樹状細胞(BMDC)の 体外 培養は、大量のDC細胞を得るための重要な方法である。一方、骨髄からDCを生成するためのLutzプロトコルは、研究者によって広く使用されています6。このプロトコルはDC細胞を得るのに有効であるが、複雑で高価であり、高濃度のサイトカインの添加および赤血球の溶解を伴う。
本研究では、マウス骨髄(BM)からほぼすべての骨髄細胞を単離し、GM-CSFおよびIL-4の濃度を低くして、 インビトロでの7~9日後のBMDCへの分化誘導方法を報告する。この手順は、ほとんどすべての骨髄細胞を採取し、それらを完全な培地に懸濁するのに10分しかかかりません。簡単に言えば、我々はこの研究においてBMDCのための効率的かつ費用対効果の高い培養方法を提供する。

<table><tbody><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール</td><td>Solarbio</td><td>M8211</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>APC-MHC II</td><td>Biolegend</td><td>116417</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10100</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD80</td><td>Biolegend</td><td>104707</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Solarbio</td><td>P1400</td><td></td></tr><tr><td>Percp/cy5.5-CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117327</td><td></td></tr><tr><td>PRMI-1640</td><td>サーモ</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス GM-CSF</td><td>Solarbio</td><td>P00184</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス IL-4</td><td>Solarbio</td><td>P00196</td><td></td></tr><tr><td>TruStain Fc PLUS (抗マウス CD16/32) 抗体</td><td></td><td>Biolegend 156603</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスから骨髄由来樹状細胞を単離および培養するための経済的かつ効率的なプロトコル

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

樹状細胞(DC)の需要は、免疫学研究が進むにつれて徐々に増加しています。しかし、DCはすべての組織において稀である。DCを単離するための従来の方法は、主に、顆粒球 - マクロファージコロニー刺激因子/インターロイキン−4(GM-CSF/IL-4)を大量(>10ng/mL)注射することによって骨髄(BM)をDCに分化させることを含み、手順を複雑かつ高価にする。このプロトコールでは、10 ng/mL GM-CSF/IL-4培地で培養したすべてのBM細胞を用いて、3〜4回の半培養交換の後、マウス(2つの大腿骨)あたり最大2.7 x107個の CD11c+ 細胞(DC)を純度80%〜95%で回収した。培養10日後、CD11c、CD80、およびMHC IIの発現は増加したが、細胞数は減少した。細胞数は培養7日後にピークに達した。さらに、この方法は、すべての骨髄細胞を採取するのに10分しかかからず、培養1週間後に多数のDCが得られた。

1 x 107-1.7 x107細胞を2つの大腿骨から抽出し、6ウェルプレートに植え付ける前に24 mLの培地に再懸濁した(図1A)。2日後、培養液を完全に交換して非接着細胞を除去した。培地を交換する前に、かなりの数の浮遊細胞が観察された(図1B)。培養の3日後、小細胞コロニーが形成され始めた。6日目に、コロニーのサイズと数は大幅に増加しました。7日目に、細胞数はピークに達し(22 x 106-27 x106)、その後徐々に減少した(図2A)。DC細胞の表面は、より長い偽足症で粗くなり、典型的な成熟DC細胞形態を示す(図2B)。フローサイトメトリー分析により、全細胞に対するCD11c陽性の割合は6日目に71%であったのに対し、10日目には96.1%に増加した(図2C</st...

ここでは、10 ng/mL GM-CSF/IL-4で7日間培養した後、マウスから高純度骨髄由来樹状細胞を単離・生成する経済的かつ効率的な方法を紹介します。

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

マウスから骨髄由来樹状細胞を単離および生成する経済的かつ効率的なプロトコル。動物被験者に関する手続きは、南京医科大学の機関動物倫理委員会によって承認されています。腫瘍免疫研究の増加に伴い、DC細胞の需要は徐々に増加しています。しかし、DCはすべての組織において稀である。主に骨髄をDCに分化誘導する従来の方法は複雑で費用がかかる。2。骨髄の単離およびBM細胞の調製 我々はマウスを屠殺し、マウス手術台に固定する。左露出した筋肉と大腿動脈の皮膚を切断する。大腿動脈を直接切断しないでください。さもなければ、それは重い出血を引き起こし、視野を汚染するでしょう。大腿骨の周りのすべての筋肉を切断します。マウスの下肢を大腿骨頭の脱出までゆっくりと外側に伸ばし、観察することができる。下肢を体から離します。自由で完全な大腿骨を得るために後肢を切る。ガーゼを使って筋肉を取り除きます。筋肉を直接引き裂かないでください。マウスの大腿骨は壊れやすいです。大腿骨を75%アルコールに2〜5分間入れます。3。BMDCの注入培養はPBSで残留アルコールをすすいでください。大腿骨の中央部および底部を止血鉗子でクランプし、大腿骨の下端を別の止血鉗子でクランプする。止血鉗子は文字通り大腿骨に適用され、大腿骨は骨端線から壊れる。骨端ラインから骨髄腔を突き刺すために1mlシリンジを使用する。骨が白くなるまで骨髄腔を洗い流す完全な培地2つの部分を使用してください。フラッシング液を集める。GM CSF/IL-4を含む完全培地を24mlに補充し、1ウェルあたり4mlの6ウェルプレートに播種する。4.結果2日後、GM-CSF/IL-4を含むすべての培地を交換してください。4日目、6日目、8日目にGM-CSF/IL-4を含む完全培地を半分交換した。細胞数は7日目にピークに達し、その後徐々に減少した。DC細胞は、典型的な成熟DC細胞形態を示す多数のシナプスを形成した。フローサブメトリック分析は、CD11cの比率が6日目に71%のものを課し、広い比率が10日目に96.1%に増加することを示す。CD11c、CD80およびMSC2の発現は、培養時間の増加とともに徐々に増加した。5.まとめ要するに、骨髄細胞の分離に10分しかかからないマウス由来の樹状細胞を単離・生成するための経済的で効率的なプロトコールを確立したのです。多数の高純度DCを、1mlあたり10ng、GM−CSF、およびIL−4で6〜7日間の培養後に回収した。

economical-efficient-protocol-for-isolating-culturing-bone-marrow

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