Name: シングルセルマルチオミクス実験のためのマウス頸動脈内腔からの内皮細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 学ぼう、マウス頸動脈から内皮細胞と核を単離するシングルセルマルチオミクス実験法。血流乱流条件下での分子経路と動脈硬化治療標的の探索に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、国立衛生研究所からの助成金HL119798、HL095070、およびHL139757からのHJへの資金提供によってサポートされました。HJは、ウォレスH.コールター特別教授の教授職によってもサポートされています。エモリー統合ゲノミクスコア(EIGC)によって提供されるサービスは、エモリー大学医学部によって助成され、また、賞番号の下で国立衛生研究所のジョージア臨床およびトランスレーショナルサイエンスアライアンスによって部分的にサポートされました。UL1TR002378。上記の内容は著者の責任であり、国立衛生研究所の公式見解を反映したものではありません。

以下に説明するすべての動物の手順は、エモリー大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。非高コレステロール血症、年齢および性別が一致したC57BL / 6マウスを使用して、性依存的な変動を軽減し、高コレステロール血症状態の合併症を相殺しました。
1.部分頸動脈結紮術(PCL)手術
注:LCAの部分頸動脈結紮は前述のように実施され、実証されました3。
<ol><li>麻酔気化器を使用した手順全体を通して、イソフルラン吸入(誘導のために酸素中に5%イソフルオラン、その後維持のために1.5%)によってマウスを麻酔します。マウスをデルタ相等温パッドに置き、手術中の体温の損失を防ぎます。</li>
	<li>露出角膜炎を防ぐために眼軟膏を塗布し、つま先のピンチ反応がないことで麻酔の深さを確認します。</li>
	<li>ブプレノルフィン0.05 mg / kgを皮下注射して、痛みを先制的に管理します。.ベタジンとイソプロパノール溶液を3回塗布して洗浄することにより、脱毛領域を消毒します。ベタジンが手術領域を滅菌するための最後のステップであり、中央から始めて側面で終わることを確認してください。</li>
	<li>無菌技術を使用して、頸部領域に腹側の正中線切開(~1 cm)を行い、鈍的解剖によってLCA分岐点を露出させます。</li>
	<li>左内頸動脈、外頸動脈、および後頭動脈を6-0絹縫合糸で結睭化する。上甲状腺動脈はそのままにしておきます。</li>
	<li>皮膚を近似し、組織接着剤および/または縫合糸で切開を閉じます。</li>
	<li>マウスを事前に温めた回復ケージ(37°Cに維持)に移し、手術後の低体温を避けるために清潔なタオルの上に最大1時間置きます。 注:私たちの経験では、術後の痛みの管理には通常、ブプレノルフィン(0.05 mg / kg)の先制単回投与で十分です。動物が最初の24時間後に苦しんでいる場合は、ブプレノルフィンの反復投与を行うことができます。.正しく実施されれば、この手順に関連する死亡率はなく、マウスへの術後ストレスは最小限である。マウスはそれぞれのケージに戻され、手術後に毎日監視されます。</li>
	<li>灌流セットアップを準備します。<ol><li>IVバッグに10 U / mLのヘパリンを含む0.9%NaCl(生理食塩水)を使用してください。IVバッグを地面から244〜274 cm(8〜9フィート)、または解剖板より約122〜152 cm(4〜5フィート)高く引っ掛けます。バタフライニードルを生理食塩水ラインの端に取り付け、IVラインから気泡を洗い流します。</li>
	</ol></li>
</ol>2.犠牲後の頸動脈の分離
<ol><li>施設IACUCプロトコルに従ったCO2 吸入によってマウスを屠殺する。</li>
	<li>マウスの皮膚に70%エタノールをスプレーし、吸着剤ペーパータオルを含む解剖ボード上の仰臥位に置きます。粘着テープまたは21 G針を使用して、マウスの足を解剖板上の吸着剤タオルに固定します。</li>
	<li>滅菌ハサミを使用して、腹部から胸部の上部までマウスの皮膚を取り除きます。</li>
	<li>はさみを使用して、鈍的解剖によって胸郭の下の腹壁を開きます。</li>
	<li>はさみを使用して、横隔膜の長さに沿って慎重に切開を行い、胸骨が持ち上げられるまで胸郭の両側の肋骨を通り抜け続けます。鉗子で胸骨をそっと持ち上げます。その後、胸郭を外して心臓を露出させます。</li>
	<li>胸腺と心臓の結合組織を慎重に取り除き、主要な血管を視覚化します。</li>
	<li>大静脈をハサミで切断して、血液が閉鎖循環から出るようにします。</li>
	<li>心臓の頂点を通ってIVラインに接続された21 Gのバタフライ針を左心室に挿入し、室温の生理食塩水で2〜3分間逆行性灌流させます。生理食塩水バッグを地面から8〜9フィートの高さに保つことにより、通常の生理食塩水の一定の流量が維持されていることを確認します。 注意: 肺と肝臓は青白くなり、最適な灌流を示します。各マウスに約20 mLの灌流バッファーを使用します。</li>
	<li>首の領域から皮膚を取り除き、すべての脂肪、筋肉、結合組織を取り除き、頸動脈を露出させます(図1A)。 注:残りの手順は、解剖顕微鏡下で行われます。</li>
	<li>視野を調整して、ライゲーション部位を特定します。10mmのマイクロ解剖ハサミを使用して、LCAの結紮部位の下に小さな切開を行い、灌流を可能にします。</li>
	<li>左心室を介してさらに1分間再度灌流し、LCAが十分に灌流され、目に見える血液の痕跡がないことを確認します。</li>
	<li>細い先端の鉗子と小さなスプリングはさみを使用して、頸動脈が体に付着した状態で頸動脈周囲の外膜組織を慎重に除去します。 注意: この洗浄ステップでは、生存不能細胞の数が増える可能性があるため、頸動脈を圧迫したり伸ばしたりしないように細心の注意を払ってください。正しく実施された場合、最終細胞懸濁液中の細胞生存率は通常>93%である。</li>
</ol>3. マウス頸動脈からの内皮細胞高濃縮単一細胞単離
注:下記の試薬は、事前に調製し、使用するまで4°Cで保存することができます:表 1にリストされている試薬を含む1xおよび0.1x単核溶解バッファー。 表1に列挙された試薬を含む単核洗浄バッファー; 表1にリストされている試薬を使用した単一核核バッファーレシピ。これらのバッファーの作業在庫は、メーカーのプロトコルに従って準備する必要があります。 消化バッファー組成:0.5%ウシ胎児血清(FBS)含有リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中のコラゲナーゼII型600 U / mLおよびDNase I 60 U / mL。
<ol><li>頸動脈がまだ付着している間に、頸動脈の外側を通常の生理食塩水で洗い、微量の血液を洗い流します。</li>
	<li>29G針を装着したインスリン注射器を用いて、左頸動脈遠位端の内腔に~50μLの消化バッファーを注入する。消化バッファーが頸動脈を満たし始めたら、頸動脈の近位端をマイクロクリップでクランプします(図1B)。さらに15〜20 μLの消化バッファーを内腔に導入し、消化バッファーの放出を避けるために遠位端をクリップします。</li>
	<li>マウスから頸動脈を注意深く移植し(図1B、C)、温かい(37°C)Hepes緩衝生理食塩水を含む35 mmディッシュに入れます。 注意: 両方のclを確認してくださいampsがしっかりと配置されています。クランプが緩むと、消化溶液が内腔から漏れ出し、得られる細胞数に影響を与える可能性があります。これが発生した場合は、頸動脈の開放端から29 Gの針を取り付けたインスリン注射器を使用して酵素溶液を追加し、クランプを再度固定します(図1D)。酵素緩衝液が再び漏れた場合は、外植プロセス中に頸動脈が切断される可能性があります。この場合、頸動脈を破棄し、サンプルを研究から除外します。頸動脈の乱暴な取り扱いを繰り返すと、細胞の生存率と単一細胞調製の品質が低下します。 左右の頸動脈を識別し、正しくラベルを付けるように注意してください。</li>
	<li>外植した頸動脈を断続的に揺動させながら37°Cで45分間インキュベートします。</li>
</ol>4.頸動脈を洗い流す
<ol><li>管腔酵素消化が完了したら、35 mm皿からクランプと一緒に頸動脈を取り外します。消化バッファーが漏れないように注意しながら、各クランプを慎重に取り外します。</li>
	<li>頸動脈の一端を細い鉗子で1.5mLの微量遠心チューブの上にそっと持ちます。もう一方の手で、100 μLの温かい消化バッファー(37°C)を含むインスリン注射器を取り付けた29 Gの針を内腔に挿入します(図1D)。</li>
	<li>頸動脈の内腔を微小遠心チューブにすばやく洗い流します。0.3 mLのFBSを1.5 mLチューブに加えて酵素反応をブロックします。チューブを氷の上に置きます。 注:フラッシングには、管腔酵素消化からの細胞が含まれています。FBSを添加して温度を下げると、酵素消化プロセスが停止します。調製物中の細胞数が多く、破片や脂肪組織が含まれている場合は、不要な組織の破片を除去するために、50または70μmの細胞ストレーナーの使用を強くお勧めします。単一細胞数を増やすには、複数の頸動脈を洗い流すことをお勧めします。ここでは、少なくとも5,000個の細胞を得るために、10〜12個の頸動脈を洗い流し、1つのサンプルとしてプールした。</li>
	<li>固定角度ローターを備えた遠心分離機を使用して、細胞を500 × g で4°Cで5分間遠心分離します( 材料の表を参照)。</li>
	<li>上清を廃棄し、細胞解離試薬( 材料表を参照)を含む消化バッファーに細胞ペレットを37°Cで5分間再懸濁して、すべての細胞を単一細胞に分離します。 注:調製物中の細胞数が少ない場合は、遠心分離機の速度を最大2,000〜3,000 × g まで上げて、細胞をスピンダウンします。さらに、0.5 mLの遠沈管を使用すると、チューブの底部にある細胞ペレットをよりよく視覚化できます。</li>
	<li>0.15 mLのFBSを0.5 mLチューブに加え、酵素反応をブロックします。</li>
	<li>ステップ4.4と同様に、固定角度ローターを備えた遠心分離機を使用して、単一細胞懸濁液を500 × g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を廃棄し、0.2 mLマイクロ遠心チューブ内のPBS中の100 μLの氷冷1%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液に細胞を再懸濁します。 注:0.2 mLの遠心分離チューブを使用すると、チューブの底にある単一細胞ペレットの視覚化が向上します。</li>
</ol>5. 単細胞・単核解析
<ol><li>scRNAseqのシングルセル調製物を再懸濁して提出します。<ol><li>100 μLの氷冷1%BSAを含むシングルセルペレットをPBS溶液に0.2 mLチューブに再懸濁します。</li>
		<li>シングルセルカプセル化のために細胞を再懸濁した後、マイクロフルイディクスベースのシングルセル分割およびバーコードシステムを使用して、すぐにシングルセルカプセル化およびバーコード化に進みます( 材料表を参照)。</li>
		<li>サンプルをゲノミクスコアに送信する前に、シングルセル調製物を数えて検査します。細胞凝集体がないことを確認してください。 注:BSA量を最大2%まで増やすことで、単一細胞の凝集をさらに最小限に抑えることができます。</li>
	</ol></li>
	<li>scATACseqの単一細胞調製物を再懸濁して提出します。<ol><li>細胞ペレットを氷冷した1x PBS中の0.04%BSAの100 μLに再懸濁し、単一細胞懸濁液を4°Cで500 × g で遠心分離します。</li>
		<li>単一細胞懸濁液を氷冷した0.1倍溶解バッファー(表1)で溶解し、氷上で5分間インキュベートします。</li>
		<li>ライセートをP-20ピペットで10回混合し、さらに10分間インキュベートします。</li>
		<li>500 μLのチルド洗浄バッファー(表1)を溶解細胞に加え、ピペットを使用して5回混合します。 注:70 μmのセルストレーナーを使用して、細胞懸濁液から破片をろ過し、2 mLチューブに移します。</li>
		<li>ライセートを500 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を廃棄し、核ペレットを希釈した核バッファー(150 μL)に再懸濁します( 材料の 表および 表1を参照)。血球計算盤11を用いて単核標品をカウントして検査する。</li>
		<li>単一核サンプルをゲノミクスコアに提出して、単一核転位、核分割、ライブラリ調製、およびシーケンシングを行います。 注:初期細胞数が少ない場合は、核に沿って破片を観察するのが一般的です。したがって、高いセル数から始めることをお勧めします。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+atherosclerosis+development+in+C57Bl6+mice+by+overexpressing+AAV-mediated+PCSK9+and+partial+carotid+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation.</a> Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).</li>
<li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+carotid+ligation+is+a+model+of+acutely+induced+disturbed+flow%2C+leading+to+rapid+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Heart+and+Circulation+Physiology%22%5BJournal%5D)">Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).</li>
<li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+disturbed+flow-induced+atherosclerosis+in+mouse+carotid+artery+by+partial+ligation+and+a+simple+method+of+RNA+isolation+from+carotid+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861(2010).</li>
<li>Dunn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-dependent+epigenetic+DNA+methylation+regulates+endothelial+gene+expression+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).</li>
<li>Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-dependent+regulation+of+genome-wide+mRNA+and+microRNA+expression+in+endothelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo.</a> Scientific Data. 1 (1), 140039(2014).</li>
<li>Ni, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+novel+mechanosensitive+genes+in+vivo+using+mouse+carotid+artery+endothelium+exposed+to+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow.</a> Blood. 116 (15), 66-73 (2010).</li>
<li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000(2013).</li>
<li>Andueza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+reprogramming+by+disturbed+flow+revealed+by+single-cell+RNA+and+chromatin+accessibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study.</a> Cell Reports. 33 (11), 108491(2020).</li>
<li>Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+single-cell+chromatin+analysis+with+Signac%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+integration+of+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li>
<li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cell+death+by+trypan+blue+uptake+and+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Discovery%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death and Discovery. 7 (1), 180(2021).</li>
<li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li>
<li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biology. 20 (1), 210(2019).</li>
</ol>

HJはFloKines Pharmaの創設者です。他の著者は、宣言する利益相反はありません。

この論文は、マウス頸動脈から単一細胞製剤を単離するための詳細なプロトコルを提供します。PCL手術が正しく行われれば、内皮細胞に対する d-flow の影響を正確に研究することができます。外頸動脈、内頸動脈、後頭動脈、上甲状腺動脈など、一般的な頸動脈の枝を正しく識別することが重要です。超音波検査によるフローパターンの検証は、 dフロー 条件の正常な発症をさらに検証します。PCL手術は年齢に関係なくマウスに行うことができますが、好ましい年齢は10±2週間です。高齢のマウスおよび高コレステロール血症の背景を有するマウスは、一般に、より外膜脂肪およびより硬い皮膚を有する傾向がある。 
周囲の組織や外膜脂肪を含まない頸動脈内皮濃縮単一細胞製剤を注意深く解剖することが不可欠です。頸動脈の内腔は、単一細胞製剤中の血球を汚染しないように徹底的に灌流する必要があります。不適切な組織の識別とラベル付けは、高い標準偏差をもたらす可能性があります。このプロトコルには、慎重な計画と時間管理が必要です。熟練した外科医とオペレーターは、1回のPCL手術を行うのに15〜20分...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63128">Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
Sandeep Kumar*1 
Aitor Andueza*1 
Juyoung Kim1 
Dong-Won Kang1 
Hanjoong Jo1,2 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University 
* These authors contributed equally
to:
Sandeep Kumar*1 
Aitor Andueza*1 
Nicolas Villa-Roel1 
Juyoung Kim1 
Dong-Won Kang1 
Hanjoong Jo1,2 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63128">Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments

この研究室は以前、d-flowの誘導が高脂血症マウスの迅速かつ頑丈なアテローム性動脈硬化症の発症につながることを実証しました1,2。dフロー誘発性アテローム性動脈硬化症の新しいマウスモデルは、部分頸動脈結紮(PCL)手術を使用して可能でした3。PCL手術は、結紮された左頸動脈(LCA)に低振動血流状態またはdフローを誘発します。対照的に、反対側の右頸動脈(RCA)は安定した層流(s流)に直面し続けています。以前は、内皮細胞に対するd-flowの影響を理解するために、部分結紮手術後に頸動脈を解剖し、フェノールおよびグアニジンイソチオシアネートベースの溶解剤(管腔RNA/DNAフラッシング法)2,4で洗い流し、内皮に富む「プールバルク」RNAまたはDNAを提供しました。次に、これらのプールされたバルクRNAまたはDNAを、トランスクリプトーム研究またはエピゲノムDNAメチローム研究のためにそれぞれ処理した4、5、6。これらの研究は、内皮生物学とアテローム性動脈硬化症における役割が広範囲に調査された複数の流れ感受性遺伝子とマイクロRNAを発見するのに役立ちました4,6,7。
しかし、内皮濃縮にもかかわらず、これらのバルクRNA/DNA研究は、d-flow誘発性アテローム性動脈硬化症における動脈壁における各細胞タイプの特定の役割を区別することができなかった。この制限を克服するために、内皮濃縮単一細胞(sc)単離およびscRNAおよびscATACシーケンシング研究を実施しました8。このために、C57Bl6マウスは、コントロールとしてsフロー曝露RCAを使用しながら、LCAにdフローを誘導するためのPCL手術を受けました。PCL手術の2日または2週間後、マウスを屠殺し、頸動脈を解剖してクリーンアップしました。LCAとRCAの両方の内腔にコラゲナーゼを注入し、ECを有意な画分として含む管腔コラゲナーゼ消化物および他の動脈細胞を採取した。シングルセル懸濁液(scRNAseq)またはシングルヌクレイ懸濁液(scATACseq)を調製し、10倍ゲノミクスセットアップを使用して各細胞または核の一意の識別子でバーコード化しました。RNAをcDNAライブラリー調製に供し、配列決定した。
scRNAseqおよびscATACseqデータセットは、Cell Ranger Single-Cell Softwareを使用して処理され、SeuratおよびSignac Rパッケージ9,10によってさらに分析された。各細胞と核には、これらの分析から細胞タイプが割り当てられ、マーカー遺伝子と固有の遺伝子発現パターンに基づいて細胞タイプにクラスター化されました。scRNAseqおよびscATACseqの結果は、これらの単一細胞調製物がECで濃縮され、平滑筋細胞(SMC)、線維芽細胞、および免疫細胞も含むことを示しました。
さらなる分析により、管腔消化におけるEC集団は非常に発散的で可塑性(8つの異なるECクラスター)であり、血流に反応することが明らかになりました。最も重要なことは、これらの結果は、 d-flow がECをアテロームで保護された抗炎症表現型から、炎症誘発性、内皮から間葉系への移行、内皮幹/前駆細胞への移行、そして最も驚くべきことに内皮から免疫細胞への移行を含むアテローム誘発性表現型に再プログラムすることを示しました。さらに、scATACseqデータは、新しいフロー依存性のクロマチンアクセシビリティの変化と転写因子結合部位をゲノムワイドに明らかにし、いくつかの新しい仮説の基礎を形成します。マウス頸動脈から単一細胞マルチオミクス研究のための単一内皮細胞を調製するための方法論とプロトコルを以下に詳述します。

<table><tbody><tr><td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (Cell Culture Grade)</td> <td>Corning</td><td>21040CMX12</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>022-43-108-1</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile</td><td>Fablab</td><td>FL4022</td><td></td></tr><tr><td>50 mL SuperClear Centrifuge Tubes</td><td>Labcon</td><td>3191-335-0</td><td></td></tr><tr><td>6-0 シルク縫合</td>滅菌 <td>Covidien</td><td>s-1172 c2</td><td></td></tr><tr><td>70 & マイクロ;m Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged</td><td>Thermo Fisher Scientic</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Accutase solution, 滅菌ろ過</td><td>済み Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>ATAC バッファー (トランスポジションミックスの成分 I)</td><td>10x Genomics</td><td>2000122</td><td></td></tr><tr><td>ATAC 酵素 (トランスポジションミックスの成分 II)</td><td>10x Genomics</td><td>2000123/ 2000138</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン</td><td>Med-Vet International</td><td>RXBUPRENOR5-V</td><td></td></tr><tr><td>クロムコントローラー&Next GEM アクセサリーキット</td><td>10X Genomics</td><td>1000204</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM シングルセル 3' 試薬キット v3.1</td><td>10X Genomics</td><td>1000121</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM シングルセル ATAC 試薬キット v1.1</td><td>10X Genomics</td><td>1000175</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>MP Biomedicals</td><td>2100502.5</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141-100MG</td><td></td></tr><tr><td>解剖鉗子</td><td>Roboz Surgical Instruments Co</td><td>RS-5005</td><td></td></tr><tr><td>Dnase1</td><td>New England Biolabs Inc</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機(ベンチトップモデル#5425)</td><td>Eppendorf</td><td>22620444230VR</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 - プレミアムセレクト</td><td>R&D systems</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>固定角ローター</td><td>Eppendorf</td><td>FA-45-24-11-Kit ローター</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 緩衝生理食塩水</td><td>ミリポア シグマ</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>インスリン注射器 (3/10 mL 29 G 注射器)</td><td>BD</td><td>305932</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson vet</td><td>789 313 89</td><td></td></tr><tr><td>MACs スマートストレーナー (30 & マイクロ;m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers(100 & マイクロ;m)</td><td>&nbsp;Miltenyi Biotec</td><td>130-098-463</td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水 (0.9% 塩化ナトリウム)</td><td>Baxter International Inc</td><td>2B1323</td><td></td></tr><tr><td>核緩衝液 (20x)</td><td>10x Genomics</td><td>PN 2000153/2000207</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)、pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientic</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>小型ハサミ</td><td>Roboz Surgical Instruments Co</td><td>RS-5675</td><td></td></tr><tr><td>ロックRoboz</td><td>Surgical Instruments Co.</td>で鉗子を適用するステンレス鋼マイクロクリップ<td>RS-5480</td><td>または類似</td></tr><tr><td>の組織 Mend II</td><td>Webster Veteinanry</td><td>07-856-7946</td><td></td></tr><tr><td>Type II Collagenase</td><td>MP biomedicals</td><td>2100502.1</td><td></td></tr><tr><td>Deposited Data</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>scATACseq FastQ files</td><td>NCBI</td><td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td><td></td></tr><tr><td>scRNAseq FastQ files</td><td>NCBI</td><td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td><td></td></tr><tr><td>Software and Algorithms</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Ranger 3.1.0</td><td>10X Genomics</td><td>https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp</td><td></td></tr><tr><td>Cicero</td><td>Pliner et al., 2018</td><td>https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/</td><td></td></tr> <tr><td>Ggplot2 v3.2.1</td><td>Hadley Wickham</td><td>https://cran.r-project.org</td><td></td></tr><tr><td>Harmony</td><td>Korsunsky et al., 2019 https://github.com/immunogenomics/harmony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Schneider et al., 2012</td><td>https://imagej.nih.gov</td><td></td></tr><tr><td>Monocle 2.8.0</td><td>Qiu et al., 2017</td><td>https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release</td><td></td></tr><tr><td>R version 3.6.2</td><td>R Foundation</td><td></td><td></td>https://www.r-project.org</tr><tr><td>Seurat 3.1.3</td><td>Stuart et al., 2019</td><td>https://github.com/satijalab/seurat</td><td></td></tr><tr><td>Signac 0.2.5</td><td>Stuart et al., 2019</td><td>https://github.com/timoast/signac</td><td></td></tr></tbody></table>

シングルセルマルチオミクス実験のためのマウス頸動脈内腔からの内皮細胞の単離

Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

アテローム性動脈硬化症は、血流障害(d-flow)にさらされる動脈領域の炎症性疾患です。 D-flow は、内皮における遺伝子の発現をトランスクリプトームおよびエピゲノムレベルで調節し、動脈硬化促進反応をもたらす。最近、マウス部分頸動脈結紮(PCL)モデルを使用して、トランスクリプトミクスおよびクロマチンアクセシビリティの変化を単一細胞分解能で決定するために、シングルセルRNAシーケンシング(scRNAseq)およびシングルセルアッセイフォートランスポザーゼアクセスクロマチンシーケンシング(scATACseq)研究が実施されました。内皮細胞(EC)は動脈壁の全細胞集団のごく一部であるため、管腔消化法を使用してEC濃縮シングルセル製剤を入手しました。この研究では、マウスは、右頸動脈(RCA)を対照として使用しながら、左頸動脈(LCA)に d-flow を誘導するPCL手術を受けました。頸動脈はPCL手術の2日後または2週間後に解剖されました。各頸動脈の内腔にコラゲナーゼ消化を行い、内皮濃縮単一細胞または単一核を得た。これらの単一細胞および単一核調製物は、続いて10倍ゲノミクスマイクロ流体セットアップを使用してバーコード化されました。次に、バーコード化された単一細胞と単一核を、ハイスループットDNAシーケンサーでのRNA調製、ライブラリ生成、およびシーケンシングに利用しました。バイオインフォマティクス処理後、scRNAseqおよびscATACseqデータセットは、主にECからなる管腔消化からさまざまな細胞タイプを同定しました。平滑筋細胞、線維芽細胞、および免疫細胞も存在した。このEC濃縮法は、全動脈消化法では困難であった内皮に対する血流の影響を理解するのに役立ちました。EC濃縮シングルセル調製法は、これらの遺伝子に対する血流の影響が研究されていないECノックアウトおよびトランスジェニックマウスにおけるシングルセルオミクス研究を行うために使用できます。重要なことに、この技術は、同様の機構研究を行うために、ヒト動脈外植片からEC濃縮単一細胞を単離するように適合させることができる。

44匹のマウスで部分頸動脈結紮手術を行い、部分結紮手術の1日後に超音波検査を行うことでLCAの d-flow の発症を検証しました。部分結紮手術が成功すると、血流速度が低下し、LCA3の血流が逆転(流れが乱れる)します。頸動脈は結紮後2日または2週間で解剖した.各頸動脈の内腔にコラゲナーゼ消化を行い、内皮濃縮単細胞または単核懸濁液を調製した。細胞収率を高めるために、10個のRCAおよびLCAから単一細胞懸濁液をプールした。その後、調製した細胞/核をバーコード化し、配列決定した。sc-RNAseq研究では、得られた単一細胞の数は~9,700でした。4サンプルからの細胞の分布を 表2に示す。
同様に、scATACseq研究では、調製した12個のRCAおよびLCAから単一細胞を単離し、トランスポザーゼ処理を行い、バーコード化し、配列決定しました。シーケンシングは18,324個の単一核について行われ、1,291個(2日間RCA [2D-R])、5,351個(2日間LCA [2D-L])、5,...

我々は、1細胞オミクス実験を行うために、安定したまたは乱れた流動条件にさらされたマウス頸動脈の内腔から内皮細胞および核を単離する方法を提示する。

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

血管では、内皮細胞の数が非常に少ないため、それらを研究することは困難になります。私たちのプロトコルはこの制限を排除し、新しい分子経路と治療法を研究することを可能にします。私たちのプロトコルにより、内皮濃縮サンプルを取得し、急性および慢性の乱れがこの細胞型にどのように影響するかを研究できます。内皮細胞をより詳細に研究する能力は、標的遺伝子を定義することを可能にし、したがって内皮細胞を標的とするアテローム性動脈硬化症の潜在的な治療法を可能にする。頸動脈の隔離はトリッキーであり、忍耐と経験が必要です。はじめに、1キログラムあたり0.05ミリグラムのブプレノルフィンを皮下注射することによって動物を準備します。ベタジンとイソプロパノール溶液を使用して脱毛領域を3回滅菌します。首の領域で約1センチメートルの腹側正中線切開を行います。次に、LCA分岐点を鈍的解剖によって公開します。左内頸動脈、外頸動脈、後頭動脈を6-0縫合糸で結睦し、上甲状腺動脈はそのままにします。組織接着剤または縫合糸で切開を閉じます。摂氏37度に保たれた予熱した回復ケージにマウスを移します。術後の低体温を避けるために、マウスを清潔なタオルの上に最大1時間置きます。心臓の頂点を介して左心室に接続されたIVラインに21ゲージの針を挿入します。室温で通常の生理食塩水を使用して2〜3分間逆行性灌流させます。.IVラインを注入または使用しながら安定した圧力をかけ、生理食塩水バッグを8〜9フィートの高さに保つことにより、一定の流量を維持します。頸動脈を露出させるために、すべての脂肪、筋肉、結合組織で首の領域から皮膚を取り除きます。次に、頸動脈の周りの外膜組織を取り除き、頸動脈を体に付着させます。LCAの結紮部位の下に切開を行い、灌流を可能にします。左心室を通してLCAをさらに1分間灌流して、血液の痕跡を取り除きます。頸動脈の外側を通常の生理食塩水で洗い、微量の血液を取り除きます。29ゲージの針を備えたインスリン注射器を使用して、左頸動脈の遠位端の内腔に50マイクロリットルの消化バッファーを注入します。マイクロクリップを使用して、消化バッファーで満たされた頸動脈の近位端をクランプします。15〜20マイクロリットルの消化バッファーを内腔に加え、消化バッファーの放出を避けるために遠位端をクリップします。マウスの頸動脈を、温かい摂氏37度のHEPES緩衝生理食塩水を含む35ミリメートルの皿に移します。そして断続的に揺れながら摂氏37度で45分間それらをインキュベートします。管腔酵素消化が完了した後、35ミリメートル皿からクランプで頸動脈を取り外します。消化バッファーが漏れないように、クランプを慎重に取り外します。頸動脈の一端を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブの上に保持します。インスリン注射器を備えた29ゲージの針を挿入することにより、100マイクロリットルの温かい消化バッファーを内腔に追加します。マイクロ遠心チューブ内の頸動脈の内腔をすばやく洗い流し、0.3マイクロリットルのFBSをチューブに加えて反応を停止します。マイクロ遠心チューブを氷の上に置きます。固定角ローターを備えた遠心分離機を使用して、細胞を摂氏4度で500Gで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。細胞解離試薬を含む消化バッファーに細胞を再懸濁し、摂氏37度で5分間インキュベートして単一細胞に分離します。0.5ミリリットルのチューブに0.15ミリリットルのFBSを加えて酵素反応をブロックし、遠心分離を繰り返します。上清を廃棄し、0.2ミリリットルのマイクロ遠心チューブ内のPBS中の100マイクロリットルの氷冷1%BSA溶液に細胞を再懸濁します。シングルセル解析の場合は、ペレットを100マイクロリットルの氷冷1%BSAでPBSに0.2ミリリットルのチューブに再懸濁します。単核分析では、細胞ペレットを氷冷PBS中の0.04%BSAの100マイクロリットルに再懸濁し、単一細胞懸濁液を摂氏4度で5分間500Gで遠心分離します。単一細胞懸濁液を氷冷溶解バッファーで分解し、氷上で5分間インキュベートします。ライセートをP20ピペットと混合し、さらに10分間インキュベートします。その後、ライセートを0.5ミリリットルのチューブに移します。ly細胞を500マイクロリットルのバッファーで洗浄し、ピペットを使用して混合します。その後、遠心分離を繰り返します。上清を捨て、核ペレットを150マイクロリットルの希釈核緩衝液に再懸濁した。血球計算盤を使用して単一核製剤を数えます。単一核シーケンシング研究に続いて、単一細胞および単一核が得られ、明視野顕微鏡および位相差顕微鏡によって視覚化されました。単一細胞懸濁液からの単一核調製の効率も実証された。シングルセルRNAシーケンシング研究の後、細胞あたりの遺伝子の分布、細胞あたりの一意の分子識別子、細胞あたりのミトコンドリアリード、シーケンシング飽和データなどのさまざまなパラメーターが得られました。シングルセルATAC配列研究のために、ヌクレオソームバンディングパターンを含むインサートサイズ分布は観察されなかった。正規化されたTSS濃縮スコアも観察された。さらに、パーセントフラグメントはピークで読み取ります。ピーク領域断片、TSS濃縮スコア、ブラックリストゲノムサイトにおけるリードの比率、およびヌクレオソームシグナル比を決定した。酵素消化は細胞にとってストレスであるため、サンプルを氷上に維持し、できるだけ早く手順を実行することが重要です。この方法を使用して、マウスから内皮細胞を取得し、プレート化することができます。この手法を使用して、バルクOmixベースの研究を実行することもできます。この技術は、生体内の内皮細胞に対する血流障害の影響を単一細胞様式で研究するための道を開いた。

isolation-endothelial-cells-from-lumen-mouse-carotid-arteries-for

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

これは、マウスの総頚動脈のintraplaque新血管形成（4週間）と（二週間で）乱流の条件とその後のアテローム性動脈硬化症の発展の原因となる部分的な頸動脈結紮術を、説明します。我々はまた、高純度内皮RNAを提供する、頸動脈内膜からのRNA分離の新しい方法を説明します。...

部分的ライゲーションによるマウス頸動脈における乱流誘発アテローム性動脈硬化症と頸動脈内皮からのRNA単離の方法における簡便な方法のモデル

我々は、ネイティブ、そのまま微小血管内皮にカルシウムシグナル伝達を可視化して操作するための準備を提示する。内皮チューブは新鮮に、骨格筋、隣接セル内との間で、生体内の形態および動的なシグナリングに保持供給マウス抵抗動脈から単離した。内皮チューブは、他の組織および器官の微小血管から調製することができる。...

マウス抵抗動脈から毛細血管内皮の管の隔離

心臓弁内皮細胞(VEC)を分離する能力は、弁の発生、維持、および疾患のメカニズムを理解するために重要です。...

ネズミ弁内皮細胞の単離

血管内皮細胞は、多くの重要な心血管疾患において重要な役割を果たしています。この記事では、特別な機器を使用せずにマウス大動脈から内皮細胞を分離および増殖する簡単な方法について説明します。私たちのプロトコルは、内皮細胞の生理病理学におけるメカニズムを特定する効果的な手段を提供します。...

マウス大動脈内皮細胞の単離および初代培養

このプロトコルは、イメージングや分子生物学的実験を行う目的でマウスの冠状細胞を分離する方法を共有するために準備されています。...

マウスの冠動脈内皮細胞の単離

このプロトコルは、細胞収量、純度、および生存率に最適化されたマウス生後網膜内皮細胞の単離方法について説明しています。これらの細胞は、次世代シーケンシングアプローチに適しています。...

次世代シーケンシングのためのマウス網膜内皮細胞の単離

この記事では、新生児マウスから初代肺内皮細胞を単離し、培養しました。...

初代マウス肺内皮細胞の単離

プロトコルは、ヒト腸間膜動脈からの内皮細胞の単離、培養、およびプロファイリングを記載している。さらに、空間トランスクリプトミクスのためにヒト動脈を調製する方法が提供される。プロテオミクス、トランスクリプトミクス、および機能アッセイは、単離された細胞に対して行うことができる。このプロトコルは、任意の中型または大型の動脈に転用することができる。...

トランスクリプトームレベルでのヒト原発性腸間膜動脈内皮細胞の単離とプロファイリング

このプロトコルは、マウス脂肪デポーの解剖および内皮細胞集団を遊離させてから同定するためのそれぞれの動脈の単離および消化のための方法を詳述する。ダウンストリームアプリケーションで使用される新たに単離された細胞は、血管細胞生物学と血管機能障害のメカニズムの理解を促進します。...

下流アプリケーションのための異なる脂肪デポからの血管内皮細胞の分離と同定(英語)

この論文では、真皮リンパ管からマウス内皮細胞を磁気ビーズベースで単離する方法について説明しています。単離されたリンパ内皮細胞は、下流の in vitro 実験やタンパク質発現解析に使用できます。...

マウス真皮リンパ管内皮細胞の単離

ここでは、マウス頸動脈の単一細胞懸濁液を調製するための2段階の細胞消化プロトコルについて説明します。...

シングルセルシーケンシングのためのマウス頸動脈からのシングルセル懸濁液の調製

学ぼう、マウス頸動脈から内皮細胞と核を単離するシングルセルマルチオミクス実験法。血流乱流条件下での分子経路と動脈硬化治療標的の探索に応用可能です。

シングルセルマルチオミクス実験のためのマウス頸動脈内腔からの内皮細胞の単離

さらに動画を探す