Name: 大腸菌およびその他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離および精製(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 学ぶ大腸菌由来細胞外小胞のスケーラブルな単離・精製法。ろ過とサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、大容量培養から高純度のEVを効率的に回収し、治療応用やin vivo研究への応用可能性を示します。

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上記の研究は、NIH TL1 TR002549-03トレーニング助成金によってサポートされました。粒子サイズ分析装置へのアクセスを容易にしてくれたジョンC.ティルトン博士とザカリートロイヤー博士(ケースウエスタンリザーブ大学)に感謝します。Lew Brown(スペクトラダイン)は、粒度分布データの分析に関する技術支援を提供します。コーネル大学のデビッド・パットナム博士は、pClyA-GFPプラスミド14を提供しました。ペンシルベニア大学のマーク・グーリアン博士は、 大腸菌 MP113を提供してくれました。

<ol><li>Yanez-Mo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066(2015).</li>
<li>Chatterjee, S. N., Das, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+observations+on+the+excretion+of+cell-wall+material+by+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae.</a> Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).</li>
<li>Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+beta-lactamase+is+packaged+into+membrane+vesicles+and+secreted+from+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).</li>
<li>Yonezawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicles+of+Helicobacter+pylori+TK1402+are+involved+in+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation.</a> BMC Microbiology. 9, 197(2009).</li>
<li>Mashburn, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+traffic+signals+and+facilitate+group+activities+in+a+prokaryote%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote.</a> Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).</li>
<li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li>
<li>Petousis-Harris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+a+group+B+outer+membrane+vesicle+meningococcal+vaccine+against+gonorrhoea+in+New+Zealand%3A+a+retrospective+case-control+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study.</a> Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).</li>
<li>Kim, O. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+suppress+tumor+by+interferon-gamma-mediated+antitumor+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response.</a> Nature Communications. 8 (1), 626(2017).</li>
<li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Consortium, E. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EV-TRACK%3A+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li>
<li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+and+enhanced+tumor+delivery+of+engineered+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 105, 195-205 (2016).</li>
<li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable%2C+cGMP-compatible+purification+of+extracellular+vesicles+carrying+bioactive+human+heterodimeric+IL-15%2Flactadherin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088(2018).</li>
<li>Lasaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+isolate+for+studying+colonization+of+the+mouse+intestine+and+its+application+to+two-component+signaling+knockouts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts.</a> Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).</li>
<li>Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+gram-negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).</li>
<li>Reimer, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+outer+membrane+vesicle+isolation+methods+with+an+Escherichia+coli+tolA+mutant+reveals+a+hypervesiculating+phenotype+with+outer-inner+membrane+vesicle+content%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628801(2021).</li>
</ol>

著者は宣言する利益相反はありません。

上記のプロトコルでは、スケーラブルで、さまざまなグラム陰性/陽性および好気性/嫌気性細菌からEVを確実に分離する方法が説明されています。手順全体を通していくつかの潜在的な停止点がありますが、馴化細菌培養培地からEVを分離するのに48時間以上かかることは避けることをお勧めします。
まず、細菌を培養して馴化細菌培養培地を生成することからなる。培養時間を少なくとも48時間に増やし、最適な増殖培地を使用すると、EV収量を最大化するのに役立つことがわかりました。各細菌種は、これら2つのパラメータに関して最適化する必要がある可能性があります。細菌培養の量は、目的の用途に十分なEVを確実に分離するためにも重要です。インビ トロ 試験では、EVは通常、最低100 mLから単離されますが、 インビボ 試験では、EVは通常、>1 Lの培地から単離されます。ここでも、各細菌株のEV生産特性とダウンストリームアッセイに必要なEV量によって、最小開始培養量が決まります。
コンディショニングされた培地が利用可能になった...

細胞外小胞(EV)は、脂質、タンパク質、糖鎖、核酸で構成されるナノメートルサイズのリポソーム様構造であり、原核細胞と真核細胞の両方から分泌されます1。グラム陰性菌2からのEVの放出を視覚化する初期の研究以来、細菌のEVに起因する生物学的機能の数(直径20〜300 nm)は過去数十年で絶えず増加しています。それらの機能には、抗生物質耐性の転移3、バイオフィルム形成4、クオラムセンシング5、および毒素送達6が含まれます。また、細菌性EVを治療薬として使用すること、特にワクチン学7 とがん治療8への関心も高まっています。
EV研究への関心が高まっているにもかかわらず、隔離方法に関する技術的な課題がまだあります。具体的には、再現性があり、スケーラブルで、多様なEV産生生物に適合する分離法が求められています。EVの分離と研究方法を計画および報告するための統一された一連の原則を作成するために、国際細胞外小胞学会はMISEVポジションペーパー9を発行および更新します。さらに、EV-TRACKコンソーシアムは、透明性を高めるために、公開された原稿で使用されているEV分離の詳細な方法論を報告するためのオープンプラットフォームを提供します10。
このプロトコルでは、哺乳類細胞培養物からのEVの単離に使用された以前の方法論が、細菌細胞培養物からのEVの単離を可能にするために適応されました11,12。私たちは、スケーラブルなさまざまな微生物からEVを分離し、EVの純度と収量のバランスをとる方法を採用することを目指しました(MISEVポジションペーパー9で説明されています)。遠心分離とろ過によって細菌の細胞や破片を除去した後、培養液は遠心装置限外ろ過(最大~100 mLの容量の場合)またはポンプ駆動のTFF(大容量の場合)のいずれかによって濃縮されます。その後、EVは、小型EVの精製に最適化されたカラムを使用してSECによって分離されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63155/63155fig01.jpg"> 図1:細菌EV分離ワークフローの概略図。 略語:EV =細胞外小胞;TFF =タンジェンシャルフローろ過;SEC = サイズ排除クロマトグラフィー;MWCO =分子量カットオフ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63155/63155fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
Escherichia coliのマウス共生株(すなわち、大腸菌MP113)をモデル生物として使用し、以前に報告されているように、細胞ライシンAへの融合によってEV関連ナノルシフェラーゼを発現するように改変した14。ここで使用される方法は、少なくとも最大数リットルの細菌培養を処理し、EV関連タンパク質と非EV関連タンパク質を効果的に分離することができる。最後に、この方法は、他のグラム陽性菌種およびグラム陰性菌種にも使用することができる。報告された実験のすべての関連データは、EV-TRACKナレッジベース(EV-TRACK ID:EV210211)10に提出されました。

<table><tbody><tr><td>0.5 mL フラットキャップ、薄肉 PCR チューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>3430</td> Qubit 16% パラホルムアルデヒド(ホルムアルデヒド)水溶液<td>で正確な測定値を得るには、薄肉 PCR チューブを使用することが重要です</td></tr><tr><td></td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>250 mL ファイバーライトポリプロピレン遠心分離ボトル</td><td>ThermoFisher</td><td>010-1495</td><td></td></tr><tr><td>500 mL ファイバーライトポリプロピレン遠心分離機ボトル</td><td>ThermoFisher</td><td>010-1493</td><td></td></tr><tr><td>65 mm ポリプロピレン丸底/円錐形ボトルアダプター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>392077</td><td>ビバセルをローター</td></tr><tr><td><>エムに適合させることができます Akkermansia mucinophila</td><td>ATCC</td><td>BAA-835</td><td></td></tr><tr><td>Amicon-15 (100 kDa MWCO)</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-20XPI遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>ベックマンから販売終了。アバンティJ-26XPは、最も近い現代モデルです。</td></tr><tr><td>Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482</td><td>ATCC</td><td>29148</td><td></td></tr><tr><td>Bifidobacterium breve</td><td>NCIMB</td><td>B8807</td><td></td></tr><tr><td>Bifidobacterium dentium</td><td>ATCC</td><td>27678</td><td></td></tr><tr><td>ブレインハートインフュージョン(BHI)ブロス</td><td>Himedia</td><td>M2101</td><td>オートクレーブ後、BHIブロスと寒天の両方を嫌気性チャンバーに導入し、メナジオン(1 &micro;g / L)、ヘマチン(1.2 &micro;g / L)、およびL-システイン塩酸塩(0.05%)。次いで、嫌気性細菌株を接種する前に、嫌気性条件下で少なくとも24時間インキュベー</td></tr>トした。<tr><td>C-300 マイクロ流体カートリッジ</td><td>Spectradyne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN19032105</td><td></td></tr><tr><td>電子顕微鏡</td><td>FEI 社</td><td>Tecnai G2 SpiritBT</td><td></td></tr><<tr><td>em>Escherichia coli HST08 (Steller competent cells)</td><td>Takara</td><td>636763</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli MP1</td><td>Dr. Mark Goulian (gift)</td><td></td><td>マウス腸由来の共生細菌</td></tr><tr><td>Fiberlite 500 mL to 250 mL アダプター</td><td>ThermoFisher</td><td>010-0151-05</td><td>Fiberliteローターと併用して、250 mLボトルを小型の細菌培養開始に使用</td></tr>可能 <tr><td>Fiberlite固定角遠心分離機ローター</td><td>ThermoFisher</td><td>F12-6x500-LEX</td><td>は500 mLボトル6本に適合</td></tr><tr><td>Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper</td><td>Electron Microscopescopy sciences</td><td>FCF-400-CU</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド(EMグレード、10%水溶液)</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>16100</td><td></td></tr><tr><td>ヘマチン</td><td>ChemCruz</td><td>207729B</td><td>ストック溶液は0.2 M L-ヒスチジン溶液で作られました&nbsp; 1.2 mg/mL</td></tr><tr><td>Infinite M Nano+ Microplate reader</td><td>Tecan</td><td></td><td>この等価物は、mCherry蛍光</td></tr><tr><td>In-Fusion&nbsp;HD Cloning Plus</td><td>Takara</td><td>638909</td><td>PCRフラッジメントのPCRライン化ベクターへのクローニング用</td></tr><tr><td>JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>Lauria Bertani (LB) broth, Miller</td><td>Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine Hydrochloride</td><td>J.T. Baker</td><td>2071-05</td><td>秤量し、嫌気性バイオビクス内のオートクレーブ滅菌BHI培地に直接添加する必要があります。チャンバー</td></tr><tr><td>Masterflex フィッティング、ポリプロピレン、ストレート、メス ルアー - ホース バーブ アダプター、1/8" ID; 25/PK</td><td>コールパーマー -</td><td>ろ過チューブ回路用</td>特殊 <td>HV-30800-08</td> 接続アダプター</tr><tr><td>Masterflex フィッティング、ポリプロピレン、ストレート、オス ルアー - ホース バーブ アダプター、1/8" 内径; 25/PK</td><td>コールパーマー - ろ過</td><td>チューブ回路</td><td></td></tr><tr><td>用特殊 HV-30800-24 接続アダプターMasterflex L/S アナログ可変速コンソールドライブ、20 〜 600 rpm</td><td>Masterflex</td><td>HV-07555-00</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 精密チューブ用イージーロードヘッド、4ローラー、PARA ハウジング、SS ローター</td><td>Masterflex</td><td>EW-07514-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 精密ポンプチューブ、PharmaPure、L/S 16; 25 フィート</td><td>コールパーマー</td><td>EW-06435-16</td><td>低結合/低浸出チューブ</td></tr><tr><td>メナディオン (ビタミン K3)</td><td>MP</td><td>102259</td><td>ストック溶液は、エタノールで1 mg / mL</td></tr><tr><td>MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1 / PK</td><td>Repligen</td><td>D04-E100-05-N</td> TFFデバイスとして作られました 私たちは<td>大腸菌培養上清</td></tr><tr><td>Nano-Gloルシフェラーゼアッセイシステム</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td>このアッセイキットは、nlucレポータータンパク質</td></tr><tr><td>NanoLuc(Nluc)ルシフェラーゼ抗体の発光を測定するために使用されました。 クローン965808</td><td>R&D Systems</td><td>MAB10026</td><td></td></tr><tr><td>nCS1 マイクロ流体抵抗パルス検出装置</td><td>Spectradyne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nCS1 Viewer</td> 粒子<td>径分布用</td><td>スペクトル</td><td></td>分析ソフトウェア</tr><tr><td>OneTaq 2x マスターミックスと標準バッファー</td><td>NEB</td><td>M0482</td><td>DNA ポリメラーゼマスターミックス コロニーチェックのためのルーチン PCR 反応を行うために使用</td></tr><tr><td>Protein LoBind, 2.0 mL, PCRクリーンチューブ</td><td>Eppendorf</td><td>30108450</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0492</td><td>DNA ポリメラーゼマスターミックス</td></tr><tr><td>qEV オリジナル 35 nm</td><td>Izon</td><td></td><td>最大ローディングボリューム 0.5 mL</td></tr><tr><td>qEV ラック</td><td>Izon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qEV-2、35 nm</td><td>Izon</td><td></td><td>2 mL</td></tr><tr><td>Qubit 蛍光光度計</td>の最大負荷量 <td>ThermoFisher</td><td></td><td>アイテムは販売終了しました。最も近い利用可能な製品は、Qubit 4.0 Fluorometer (cat.いいえ。Q33238)</td></tr><tr><td>Qubitタンパク質アッセイキット</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33211</td><td>室温で保存してください。標準は4°Cで保存されます。</td></tr><tr><td>Sorvall Lynx 4000 遠心分離機</td><td>ThermoFisher</td><td>75006580</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax i3x マイクロプレートリーダー</td><td>分子デバイス</td><td></td><td>この装置は、ナノルシフェラーゼ生物発光の測定に使用されました</td></tr><tr><td>Stericup Quick-release-GP 滅菌真空ろ過システム (150、250、または 500 mL)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE</td><td>1つまたは複数のフィルターを使用して、作業ボリュームに対応できます。私たちの経験では、製品サイズに記載されているボリュームの2倍をフィルタリングできます。</td></tr><tr><td>酢酸ウラニル</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>ビニール嫌気性チャンバー</td><td>Coy Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vivacell 100, 100,000 MWCO PES</td><td>ザルトリウス</td><td>VC1042</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Anotop 10 Plus シリンジ フィルター (0.02 ミクロン)</td> <td>MilliporeSigma</td><td>WHA68093002</td><td>MRPS 希釈剤をろ過します</td></tr></tbody></table>

大腸菌およびその他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離および精製(英語)

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

多様な細菌種は、脂質、タンパク質、核酸、糖鎖、および親細胞に由来する他の分子からなる細胞外小胞(EV)を~20~300nm分泌します。EVは、種内および種間のコミュニケーションベクトルとして機能すると同時に、感染とコロニー形成の文脈における細菌と宿主生物の間の相互作用にも貢献します。健康と病気におけるEVに起因する多数の機能を考えると、 in vitro および in vivo 研究のためにEVを分離することへの関心が高まっています。物理的特性、すなわちサイズに基づいてEVを分離することで、多様な細菌培養物からの小胞の分離が容易になるという仮説が立てられました。 
単離ワークフローは、細菌培養物からEVを単離するための遠心分離、ろ過、限外ろ過、およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)で構成されています。ポンプ駆動のタンジェンシャルフローろ過(TFF)ステップが組み込まれ、スケーラビリティが向上し、数リットルの開始細胞培養から材料を分離できるようになりました。大腸 菌 をモデル系として、EV関連ナノルシフェラーゼおよび非EV関連mCherryをレポータータンパク質として発現させた。ナノルシフェラーゼは、そのN末端をサイトリシンAと融合させることによってEVを標的としました。関連するサイトライシンA-nanoLucを有する20〜100 nm EVを含む初期のクロマトグラフィー画分は、遊離タンパク質を含む後の画分とは異なっていました。EV関連ナノルシフェラーゼの存在は、免疫金標識および透過型電子顕微鏡によって確認された。このEV分離ワークフローは、他のヒト腸関連グラム陰性菌種およびグラム陽性菌種に適用できます。結論として、遠心分離、ろ過、限外ろ過/ TFF、およびSECを組み合わせることで、多様な細菌種からEVをスケーラブルに分離できます。標準化された分離ワークフローを採用することで、種を超えた微生物EVの比較研究が容易になります。

どのSECクロマトグラフィー画分がEV用に濃縮されているかを評価するために、SECカラムにTFFによって1,000倍濃縮された2 mLの 大腸菌 MP1馴化培養液をロードし、順次画分を収集しました。MRPSを使用すると、フラクション1〜6に最も多くのEVが含まれていることがわかりました(図2A)。その後の画分にはEVがほとんど含まれておらず、EVフリーのタンパク質の代わりに含まれていました(図2B)。EVは主に直径&lt;100nmでした(図2C)。TEMは、特にフラクション2〜6でEV濃縮とサイズを確認しました(図2D)。
この方法がEVを非EV関連タンパク質から分離できることをさらに確実にするために、細胞ライシンA-ナノルシフェラーゼ融合タンパク質および遊離(非融合)mCherryを発現する 大腸菌 MP1...

細菌は、生理活性のある生体分子を運ぶナノメートルサイズの細胞外小胞(EV)を分泌します。EVの研究は、それらの生合成、微生物-微生物および宿主-微生物の相互作用および疾患における役割、ならびにそれらの潜在的な治療用途を理解することに焦点を当てています。EV研究の標準化を促進するために、さまざまな細菌からEVをスケーラブルに分離するためのワークフローが提示されます。

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

このプロトコルは、再現性の高い方法でさまざまな細菌から細胞外小胞を分離する方法を提供するため、重要です。この技術の素晴らしいところは、細菌培養の非常に大規模な環境からEVを分離するために使用できるため、in vivo研究が可能になることです。私たちが示すデータは前臨床アプリケーションを反映していますが、このプロトコルが治療用の細菌性EVの製造に適応できることは予測可能です。この方法は、わずかな変更でスケーラブルな細胞培養システムに適用できます。プロトコルのスケーラビリティのため、必要な開始量の細菌細胞培養を処理するために、適切なサイズのフィルターとSECカラムを用意することが重要です。手順を実演しているのは、ジャスティン・ラティア博士の研究室のアシスタントテクノロジストであるセイディー・ジョンソン、ジャスティン・ラティア博士の研究室の腫瘍学フェローであるディオニュシウス・ワトソン、そして私の研究室の研究技術者であるアキーム・サントスです。まず、滅菌ループを使用して、大腸菌の単一コロニーを250〜1000ミリリットルのルリアベルターニまたはLBブロスに接種します。次いで、培養物を振とうインキュベーター内で毎分300回転、摂氏37度で好気的にインキュベートする。48時間のインキュベーション後、細胞培養物を清浄な500ミリリットルのポリプロピレン製遠心分離機ボトルに移し、大容量の固定角度ローターで摂氏4度、5, 000倍Gで15分間遠心分離することにより、細菌培養培地を清澄化します。上清を10, 000倍Gで15分間慎重に遠心分離機に注ぎ、上清をきれいな遠心分離機ボトルに移します。次に、上澄み液を適切なサイズの0.2ミクロンのポリエーテルスルホン真空駆動フィルター装置に移し、ろ過装置を真空壁供給に接続します。ろ過速度が大幅に低下した場合は、ろ過されていない材料を新しいデバイスに移動します。ろ過された媒体は、摂氏4度で一晩保存することも、すぐにさらに処理することもできます。生細胞が完全に除去されたことを確認するには、ろ過した上清のアリコートを適切な寒天プレートに広げ、細菌株に最適な条件でインキュベートした後にコロニーがないことを確認します。100ミリリットルの容量でろ過された培地を濃縮するには、90ミリリットルのろ過された培養液を100キロダルトンの分子量カットオフを備えた遠心限外ろ過装置のリザーバーにロードし、上部のリザーバーの体積が0.5ミリリットル未満に濃縮されるまで、摂氏4度と2、000倍Gで15〜30分間隔でスイングバケットローターで培地を遠心分離します。残りのろ過された培養培地をリザーバーに補充するには、デバイスの下部にあるフロースルーを取り外してバランスを取り直します。リザーバー内の濃縮培地の粘度が目に見えて上昇した場合は、培地をPBSで希釈し、遠心分離によって再濃縮して、分子量カットオフの100キロダルトンよりも小さい非細胞外小胞またはEVタンパク質を減らします。次に、濃縮培地を低タンパク質結合チューブに移し、摂氏4度で一晩保存します 100ミリリットルを超える容量のろ過媒体を濃縮するには、分子量カットオフが100キロダルトンの適切なサイズの接線フローろ過またはTFFデバイスを選択します。原稿で説明されているようにろ過回路を組み立てた後、200ミリリットルのPBSをメス容器にポンプで送り、目的の流量に対応する適切な速度を決定します。速度が設定されたら、ろ過された馴化培地を室温で毎分約200ミリリットルで循環させ、100キロダルトン未満の分子を収集し、馴化培地の体積が100〜200ミリリットルに減少するまで、別の容器内の廃棄物として限外ろ過膜を通過します。ろ過した容量をPBSで順次2倍に希釈し、ポンプで培地を小さな容器に循環させ続け、容量を75〜100ミリリットルに濃縮し、次に25ミリリットルと10ミリリットルに濃縮します。フィードチューブをサンプルリザーバーから持ち上げ、ポンプでフィルターをパージして、最大量のサンプルを回収します。濃縮サンプルを分子量カットオフ100キロダルトンの15ミリリットルの遠心限外ろ過装置に移動し、上部リザーバー内の培地の体積が2ミリリットル未満になるまで、摂氏4度、G2, 000倍のGで15〜30分間隔でスイングバケットローターで遠心分離します。濃縮培地を低タンパク質結合チューブに移し、摂氏4度で一晩保存します。EVを単離するには、100ミリリットル未満の出発原料に対して10ミリリットルの床容量の小さなカラムを使用し、100ミリリットルを超える出発物質に対して47ミリリットルの床容量のより大きなカラムを使用して、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を実行します。実験の数時間前に、SECカラムとPBSを室温に戻し、続いて標準的なラボスタンドとホルダーを使用してカラムを垂直位置に安定させます。SECカラムに接続する前に、5ミリリットルのPBSをフリットを通って廃棄物容器に流して、サンプルリザーバーをハイドレートします。次に、カラムのインレットキャップを緩めてサンプルリザーバーに2ミリリットルのPBSを追加し、PBSがフリットから滴り落ちるようにリザーバーをカラムに注意深く接続します。カラムを平衡化するために、47ミリリットルのPBSをサンプルリザーバーに加え、続いてSECカラムの底部のキャップを外します。次に、ロードされたすべてのサンプルバッファーをカラムに流し、フロースルーを破棄します。2ミリリットルのサンプルをサンプルリザーバーにロードした後、サンプルをカラムに完全に入れ、フロースルーを収集します。直ちに14.25ミリリットルの容量からサンプル容量を引いた容量でPBSをサンプルリザーバーに追加し、カラムボイドボリュームに等しい量を廃棄しながら、溶液がカラムを流れるようにします。次に、2ミリリットルの低結合マイクロチューブをSECカラムの真下に配置し、2ミリリットルのPBSをカラムに通した後、最初のフロースルーまたはフラクション1を収集します。引き続き2ミリリットルのPBSをサンプルリザーバーに追加して、後続の各フラクションを収集します。収集した画分は、短期保管の場合は摂氏4度、長期保存の場合はマイナス80°Cで保管します。EVの回収画分の無菌性試験では、アッセイに使用する画分100マイクロリットルを3ミリリットルの培養液に接種します。その後、濁度を観察しながら最適な条件下で培地を少なくとも3日間培養する。あるいは、画分サンプルを、産生細菌を増殖させるために使用される培地を含む寒天プレートに適用し、次いでコロニー形成を検査することができる。次に、凍結融解サイクルを避けるために、個々の画分またはプールされた画分の25〜50%を摂氏マイナス80度の低タンパク質結合チューブに移してEVを保管します。代表的な分析は、初期のクロマトグラフィー画分における大腸菌MP1 EVの溶出を示しています。フラクション1〜6は、平均直径が100ナノメートル未満のEVが最も多く含まれていました。同時に、その後の画分にはEVフリーのタンパク質が含まれており、EVはほとんど含まれていませんでした。EVの濃縮とサイズは、透過型電子顕微鏡によって、特にフラクション2〜6で確認されました。EV濃縮画分2〜7はナノルシフェラーゼ活性が高いが、後の画分と比較して非EV関連mCherryからの蛍光シグナルは非常に低いことが観察された。イムノゴールド標識により、画分2〜5のナノルシフェラーゼのEV会合が確認されました。他の細菌種へのプロトコルの適用性は、多様な嫌気性細菌の培養物からEVを単離することによって評価されました。初期のクロマトグラフィー画分1〜4は、直径サイズが100ナノメートル未満のEV用に濃縮されていることが観察されました。複雑な脳と心臓の注入(BHI)は、EVの総収量の25%未満でEVサイズの粒子を含んでいました。細菌細胞培養の開始量を処理できるTFFデバイスを使用することが重要です。この技術により、複雑な動物モデルにおけるEVの機能について生物学的に疑問を投げかけるのに十分なEVを生成できます。

scalable-isolation-purification-extracellular-vesicles-from

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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学ぶ大腸菌由来細胞外小胞のスケーラブルな単離・精製法。ろ過とサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、大容量培養から高純度のEVを効率的に回収し、治療応用やin vivo研究への応用可能性を示します。

大腸菌およびその他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離および精製(英語)

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