Name: 生細胞顕微鏡による拡散時の細胞端突出ダイナミクスの測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 50 s
Description: 学ぶ細胞端突出アッセイを用いた細胞遊走ダイナミクスの測定法。生細胞顕微鏡とキモグラフィー解析で突出・後退・ラッフルの頻度と距離を定量化し、細胞運動性に関わるタンパク質とシグナル伝達機構の同定に有用です。

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この研究は、NIH MH115939、NS112121、NS105640、R56MH122449-01A1(アンソニー・J・コレスケ宛)およびイスラエル科学財団(助成金番号1462/17および2142/21)(ハバ・ギル・ヘン宛)の助成金によって支援された。

このプロトコルに記載されているすべての方法は、バーイラン大学の機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。
メモ: このセクションで説明する手順を段階的にグラフィカルに図 1 に示します。
1. 細胞培養
注:プロトコルで使用される細胞は、野生型C57BL/6マウスのE11.5-13.5胚から生成されたマウス胚性線維芽細胞(MEF)である。一次MEFは、ジャックス研究所のプロトコル13に従って生成されました。5つの異なる胚からの細胞を一緒にプールし、SV40ラージT抗原を発現するレトロウイルスベクターによる感染によって不死化し、続いて4mMヒスチジノールで3週間選択した。
<ol><li>1 g/L グルコース、1% グルタミン、1% ペニシリン-ストレプトマイシン、および 10% ウシ胎児血清 (FBS) を含むダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) を含む組織培養プレート中の培養細胞 ( 材料表を参照) を、37 °C で 5% CO2 で加湿したインキュベーター内で培養します。</li>
	<li>細胞を90%〜95%コンフルエントになるまで培養し、2〜3日ごとに1:5の比率で分割する。</li>
</ol>2. ガラス底皿コーティング
注:ガラス底ディッシュコーティングは、滅菌条件下で組織培養フード内で行う必要があります。
<ol><li>ガラス底ディッシュ(材料表)の中央に2mLの1N HCl溶液を加え、室温(RT)で20分間インキュベートする。 メモ:この段階は、後でイメージングを中断する可能性のあるガラスから残留物を除去するためのものです。</li>
	<li>ガラス底の皿を、それぞれ2mLの1x PBS(材料表)で3回洗う。</li>
	<li>フィブロネクチン( 材料表を参照)を1x PBSで10μg/mLに希釈する。希釈したフィブロネクチン溶液200μLをディッシュのガラス中心に加える。37°C(組織培養インキュベーター)で1時間インキュベートする。 注:あるいは、ガラス底ディッシュを平らな表面上で4°Cで一晩インキュベートすることもできます。</li>
	<li>フィブロネクチンコーティングのインキュベーション時間中に、1x PBS中の1%BSA(材料表)溶液を調製し、0.2μmのフィルターを通して濾過し、予め加温した水浴中で70°Cで30分間インキュベートすることによって変性させた。</li>
	<li>コーティングされたガラス底の皿を、それぞれ2mLの1x PBSで3回洗浄する。</li>
	<li>変性BSA溶液2mLをガラス中心に加え、37°Cで1時間インキュベートする(組織培養インキュベーター)。 注:あるいは、ガラス底ディッシュを平らな表面上で4°Cで一晩インキュベートすることもできます。</li>
	<li>ガラス底の皿をそれぞれ2mLの1x PBSで3回洗う。 注:ガラス底ディッシュとフィブロネクチンのインキュベーションは、表面を適切にコーティングするために37°Cで少なくとも1時間行う必要があります。より短いインキュベーション時間は、適切なコーティングを生じない可能性があり、その結果、細胞表現型はインテグリン活性化に関連しない可能性がある。BSA層は不活性であり、突起ダイナミクスに影響を及ぼさず、インテグリン非依存性細胞接着のための遊離電位部位をブロックすることを意味する。BSAは、細胞エッジダイナミクスに影響を与える可能性のある細胞アポトーシスを誘導するのを防ぐために、コーティング前に変性させる必要があります。</li>
</ol>3. イメージング用細胞の作製
<ol><li>実験の16〜18時間前に、翌日に70%〜80%コンフルエントに達するように細胞をプレート化する。MEFsについては、実験を行う前日に直径10cmの組織培養プレートあたり0.7 x 106 個のプレートを作製した。 注:突起実験を成功させるためには、細胞が対数増殖期に使用されることが重要です。これを達成するために、細胞は実験の日に70%〜80%の合流点に達するべきである。細胞の密度が高いほど、実験中の拡散時間が長くなり、および/または付着の障害が生じる。</li>
	<li>実験当日、組織培養プレートに直径10cmあたり2mLのトリプシン溶液(材料表)を加え、細胞が剥離するまで組織培養インキュベーター内で2~3分間インキュベートした。5mLの完全培地を加えることによってトリプシンを不活性化する。</li>
	<li>血球計数器を用いて細胞を計数し、上記のようにコーティングしたガラス底ディッシュ上に2mLの完全培地中の20,000個の細胞をプレートする(セクション2)。 注: プレーティング用のセル数は、セルのサイズとタイプによって異なります。より大きく、またはより広がった細胞の場合、イメージングに十分な細胞を持つように10,000個の細胞のみをプレートします。細胞同士の接触は細胞固有の拡散挙動を変える可能性があるため、接触しない単一の細胞を選ぶことが重要です。</li>
	<li>播種した細胞を含むガラス底ディッシュを組織培養インキュベーター内で15分間インキュベートする。 注:この段階では、細胞はフィブロネクチン基質に接着し、その上に広がる。細胞拡散中の突起を測定する場合、細胞はプレーティング後およびイメージング前に15分間拡散させるべきである。イメージングは、めっき後15分~1時間の間の時間枠内、およびいずれの場合も、細胞が遊走を開始する前に行うことができる。</li>
</ol>4. 顕微鏡のセットアップとイメージング
メモ: さまざまな生細胞顕微鏡システムが利用可能です。ここで使用されるシステムは、CO2 と加熱ユニットを備えたLeica AF6000倒立顕微鏡で、ORCA-Flash 4.0 V2デジタルCMOSカメラに取り付けられています。
<ol><li>撮影の1時間前までに加熱ユニットの電源を入れ、37°Cに設定してください。</li>
	<li>イメージングの 10 分前までに CO2 ユニットの電源を入れ、CO2 を 5% に設定してください。</li>
	<li>顕微鏡、カメラ、およびコンピュータの電源を入れます。</li>
	<li>顕微鏡取得ソフトウェアを開きます( 材料表を参照)。キャプチャした画像を保存するフォルダを選択し、ファイル名を入力します。すべてのムービーを新しいファイルとして保存します。</li>
	<li>40倍のドライレンズ、位相コントラストで倍率を設定します。時間間隔を5秒に設定し、合計ムービー時間10分に設定します。</li>
	<li>播種した細胞を15分間インキュベートした後、細胞が接着したガラス底ディッシュをアダプターに入れて固定する。皿の入ったアダプターを顕微鏡ステージのスロットに挿入します。</li>
	<li>食器カバーを外し、代わりにCO2蓋を置きます。CO2バルブを開きます。 メモ:CO2カバーをガラス底の皿の上に置く前に、CO2カバーが清潔であることを確認してください。カバーが汚れていると、映画の品質が低下します。CO2蓋の下側を70%エタノールで浸した糸くずの出ない拭き取りで拭き取り、ほこりや汚れを取り除きます。糸くずの出ない乾いたワイプで2回目に拭きます。</li>
	<li>細胞を表示し、イメージングに適した細胞を見つけます。セルにピントが合っていることを確認し、ムービーの取得を開始します。</li>
</ol>5. 画像解析
メモ: 画像解析は、次のように ImageJ (材料表) を使用して実行されます。
<ol><li>取得したムービーを ImageJ で開きます。</li>
	<li>メインツールバーの 直線 ツールを使用して、 図 2A に示すように、ラメラとセルのエッジを含む突起に対して垂直な 20 個の任意の単位の 8 本の線を 45 度ごとに放射状の配置で作成します。</li>
	<li>メインツールバーで、[ 画像>スタック] > [再スライス] に移動します。これにより、細胞膜内の単一点の動きを記述するカイモグラフ画像が得られます(図2B)。このアクションは、8 行のうちすべての行に対して個別に実行する必要があります。</li>
	<li>それぞれのキモグラフ画像から、グリッド線でマークされたセル内の8つの領域のそれぞれにおける突起、後退、およびフリルの数を抽出し、手動でカウントする。これらの数値は、10分あたりの突起、収縮、およびフリルの頻度を表す(図2C、D)。 注:フリルは、位相差顕微鏡における暗い外観と、細胞の端から始まり、細胞体の境界で終わる求心運動に基づいて他の構造と区別することができ、これは取得したフィルムで観察することができる。注目すべきは、突起、後退、およびフリルの頻度を定量化する場合、定量化のためのコントロールとして、特にフリルを定義するための制御としてムービーを観察する必要があることです。</li>
	<li>突起の持続性、距離、速度をキモグラフィ解析によって決定します。生成された各キモグラフについて、X 軸は距離を表し、Y 軸は時間を表します。</li>
	<li>突起距離を測定するには、手順 5.6.1 ~ 5.6.2 に従います。<ol>
<li>突起の基部から突起の最高峰まで垂線を引きます。ImageJ で M キーを押すと、線の長さがピクセル単位で測定されます。</li>
		<li>長さをピクセルから μm に変換するには、ピクセルと μm の比率がわかっていることを確認します。 注:μm対ピクセル比は、CCDカメラ上のピクセルの物理的な長さ/全倍率です。ピクセルサイズは、カメラの種類ごとに特徴的です。たとえば、この研究で使用したカメラの場合、ピクセルサイズは6.5μm x 6.5μm、物理的な長さは6.5μm、使用した倍率は40xです。したがって、当社のカメラのμm対ピクセル比は0.1625μm/ピクセルです。解析では、長さが30ピクセルの線の場合、突起距離は30ピクセル x 0.1625 μm/ピクセル = 4.875 μmになります(図3)。</li>
	</ol></li>
	<li>突起時間(持続性、突起が引っ込むまでに充てられる時間)を測定するには、手順5.7.1~5.7.2に従います。<ol>
<li>突起の始点(左から右)から最高峰の領域までの水平線を描きます。ImageJ で M キーを押すと、線の長さがピクセル単位で測定されます。</li>
		<li>長さをピクセルから分に変換するには、ピクセル対最小の比率を計算します。この値は、イメージ間の間隔によって異なります。 メモ: この例では、画像間の間隔は 5 秒、分/ピクセル比は 0.0833、水平線の長さは 8 ピクセルです。したがって、突起時間は 8 ピクセル x 0.0833 分/ピクセル = 0.6664 分になります。</li>
	</ol></li>
	<li>突起のピークが右側の基部にあるところから突起の基部まで水平に引かれた線( 図3の線X2)の突起時間と同様に、引き込み時間を測定して計算します。</li>
	<li>突出距離を突起時間で割って突出速度を算出する。突起距離を後退時間で割って後退速度を計算します。この例では、突起速度は 4.875 μm/0.6664 分 = 7.315 μm/minと計算され、時間を表す線が同じ長さであるため、後退速度は同じです。 注:異なる細胞型、すなわち、同じタンパク質の野生型および変異構築物を発現する細胞を比較する場合、盲検分析を行うことが不可欠であり、したがってバイアスが導入されない。</li>
</ol>

<ol><li>Kurosaka, S., Kashina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+embryonic+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C+-+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cell biology of embryonic migration.</a> Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).</li>
<li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+motility+driven+by+assembly+and+disassembly+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li>
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<li>Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Abl-related+gene+%28Arg%29+requires+its+F-actin-microtubule+cross-linking+activity+to+regulate+lamellipodial+dynamics+during+fibroblast+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion.</a> Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).</li>
<li>Bryce, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+promotes+cell+motility+by+enhancing+lamellipodial+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence.</a> Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).</li>
<li>Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arg+interacts+with+cortactin+to+promote+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion.</a> Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).</li>
<li>Miller, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+actin+polymerization+and+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion+by+the+Abl-related+gene+%28Arg%29+tyrosine+kinase+and+N-WASp%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp.</a> Biochemistry. 49 (10), 2227-2234 (2010).</li>
<li>Lukic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyk2+regulates+cell-edge+protrusion+dynamics+by+interacting+with+Crk%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2021).</li>
</ol>

著者らは、開示する利益相反はありません。

突起、収縮、およびフリルからなる細胞端突起ダイナミクスは、細胞運動性の前提条件であり、潜在的な律速事象でもある。ここでは、拡散中の細胞エッジ突起のダイナミクスを測定するための迅速かつ簡単な方法について説明します。この方法は、短時間のイメージングを可能にし、大量のデータを生成し、細胞の蛍光標識や高価な蛍光顕微鏡装置を必要とせず、よりリソースのかかる方法を実行する前に、細胞の運動性に関与する細胞骨格ダイナミクスを試験するための予備的な方法として使用することができる。さらに、このアッセイでは、ノックアウトまたはノックダウン細胞および/またはタンパク質変異体を、細胞骨格ダイナミクスに関与する重要なタンパク質および潜在的なシグナル伝達機構を同定するための迅速かつ簡単なツールとして使用することができる。
注目すべきは、突出部解析に正しい細胞を選択することが重要です。細胞は、拡散を可能にするために映画が取得される前に15分間インキュベートされる。(遊走中の突起を測定するのではなく)拡散中の突起を測定することにした場合、ムービー取得中に拡散段階にある細胞のみを画像化する必要があります。広がり始めな...

細胞移動は、すべての生物の発達と機能を制御する重要なプロセスです。細胞遊走は、胚発生、創傷治癒、免疫応答などの生理学的状態と、癌転移および自己免疫疾患などの病理学的状態の両方で起こる。異なる遊走事象に関与する細胞型の違いにもかかわらず、すべての細胞運動性事象は、原生動物から哺乳動物への進化において保存されてきた類似の分子機構を共有し、環境を感知し、シグナルに応答し、応答における細胞挙動を調節することができる共通の細胞骨格制御機構を含む1。
細胞遊走の初期段階は、細胞の前縁における非常に動的な突起の形成であり得る。ラメリポジウムの背後には、アクチンをミオシンII媒介性収縮性に結合し、下層の基質への接着を媒介するラメラがある。ラメリポジアは、成長因子、サイトカイン、細胞接着受容体などの細胞外刺激によって誘導され、原形質膜を前方に押し出す物理的な力を提供するアクチン重合によって駆動されます2,3。多くのシグナル伝達および構造タンパク質がこれに関与している。その中にはRho GTPaseがあり、これは他のシグナルと協調して作用し、Arp 2/3複合体、WASPファミリータンパク質、およびラメリポディアのホルミンファミリーおよびスパイアファミリーのメンバーなどのアクチン調節タンパク質を活性化する2,4,5。
アクチン重合に加えて、ミオシンII活性は、ラメリポジウムおよび前層に収縮力を発生させるために必要とされる。細胞縁収縮としても定義されるこれらの収縮は、細胞末梢における樹状アクチンの解重合からも生じ得、層状前縁を発達させ、突起が細胞外マトリックスおよび他の細胞の柔軟性を感知し、遊走の方向を決定することを可能にするために重要である6,7,8.基材に付着できない細胞縁突起は、末梢膜フリル、層状および層状突起の腹面に現れ、遊走方向に対して後方に移動するシート状構造を形成する。ラメリポジウムが基板に付着しないと、後部ラメリポジウムがその下に形成され、機械的に第1のラメリポジウムを上腹面に向かって押し出す。以前は基質に平行であったフリルのアクチンフィラメントは、現在、基質に対して垂直になり、フリルは前進するラメリポジウムの上に配置されるようになった。後方に移動するフリルは細胞質ゾルに逆戻りし、層状体アクチンをリサイクルするための細胞機構を表しています9,10。
ここで、細胞縁突起ダイナミクスの測定のためのアッセイについて説明する。突出アッセイは、タイムラプスビデオ顕微鏡を使用して、細胞の拡散期中に単一細胞エッジ突起ダイナミクスを10分間測定します。突起ダイナミクスは、これらの映画からキモグラフを生成することによって解析される。原理的には、キモグラフは、移動粒子の詳細な定量データを時空間プロットで付与し、細胞エッジダイナミクスの定性的理解をもたらす。移動する粒子の強度は、時間対空間プロットのすべての画像スタックに対してプロットされ、X軸とY軸はそれぞれ時間と距離を表します11。ImageJによる手動キモグラフ解析により詳細な定量データを取得し、低信号対雑音比や高特徴密度の場合に動画や画像から情報を取得したり、位相コントラスト光顕微鏡で取得した画像や画質の悪さを解析したりすることができます。
本明細書に記載される細胞縁突起ダイナミクスアッセイは、迅速、単純、かつ費用対効果の高い方法である。このように、そして細胞遊走と直接相関することが示されているので11、12、より資源の要求の厳しい方法を実行することを決定する前に、細胞運動性に関与する細胞骨格ダイナミクスを試験するための予備的方法として使用することができる。さらに、細胞骨格タンパク質の遺伝子操作(ノックアウト、ノックダウン、またはレスキューコンストラクト)が細胞骨格ダイナミクスにどのように影響するかを、簡単なプラットフォームを使用して定量的に測定することもできます。このアッセイは、細胞遊走の文脈における細胞骨格ダイナミクスを探索するための有益なモデルであり、細胞運動性の根底にあるメカニズムおよび分子の解明に使用することができる。

<table><tbody><tr><td>10 cm 細胞培養プレート</td><td>Greiner</td><td>P7612-360EA</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'S modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>01-055-1A</td><td>Medium Contains High glucose (4.5 g/L D-glucose)</td></tr><tr><td>Dulbecco'Biological</td> <td>Industries, Israel</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Biological Industries</td><td>, Israel</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底皿</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>35mmガラス底皿、皿サイズ35mm、井戸サイズ20mm、#1.5カバーガラス(0.16-0.19mm)。</td></tr><tr><td>ImageJソフトウェア</td><td>NIH</td><td></td><td>Feelyは、以下で入手可能です: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>LAS-AF Leica Application Suite 3.2</td><td></td><td></td><td>顕微鏡取得ソフトウェア ORCA-Flash 4.0 V2 デジタルCMOS</td></tr><tr><td>ライカ AF6000</td><td>ライカ</td><td></td><td>反転明視野顕微鏡 (40x, NA 1.3) 位相差光学系、インキュベーター、および CO2 ユニット LAS AF 取得ソフトウェアを装備ORCA-Flash 4.0 V2デジタルCMOSカメラ。</td></tr><tr><td>L-グルタミン溶液</td><td>生物産業</td><td>イスラエル 03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 V2 デジタルCMOSカメラ</td><td>浜松ホトニクス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液</td><td>生物産業 イスラエル</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA溶液 B (0.25%) EDTA (0.05%)</td> <td>生物産業 イスラエル</td><td>03-052-1A</td><td></td></tr></tbody></table>

生細胞顕微鏡による拡散時の細胞端突出ダイナミクスの測定

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

多細胞生物の発生と恒常性は、細胞移動の協調的な調節に依存している。細胞遊走は、組織の構築および再生において不可欠な事象であり、胚発生、免疫学的応答、および創傷治癒において重要である。細胞運動性の調節不全は、慢性炎症および癌転移などの病理学的障害に寄与する。細胞遊走、組織浸潤、軸索、および樹状突起伸長はすべて、アクチン重合媒介性細胞縁突起で開始される。ここでは、拡散中の細胞端突起ダイナミクスのイメージングおよび定量分析のための、シンプルで効率的で時間を節約する方法について説明する。この方法は、突起、収縮、フリルなどの細胞端膜ダイナミクスの離散的な特徴を測定し、主要なアクチン調節因子の操作が多様な文脈で細胞縁突起にどのように影響するかを評価するために使用することができる。

図2に記載の実験では、不死化MEFをフィブロネクチンでプレコートしたガラス底皿にメッキしてインテグリン媒介シグナル伝達を活性化し、変性BSAによってブロックし、インテグリン活性化に依存しない細胞接着の遊離電位部位を遮断した。実験当日に細胞の70%〜80%コンフルエントで対数増殖期に達するために、0.7 x 106 MEFsを実験の16時間前に直径10 cmの組織培養プレートに播種した。実験日には、細胞をトリプシン処理して計数し、フィブロネクチン/BSAコーティングされたガラス底ディッシュに20,000個の細胞を播種した。ディッシュを37°Cで15分間インキュベートし、イメージング前に細胞の付着および拡散を可能にした。インキュベーションに続いて、プレートを顕微鏡インキュベーターチャンバー(37°C、5%CO2)に入れ、単一細胞を位相光中で40倍のドライレンズを用いて画像化した。イメージングは、細胞が遊走し始める前に、プレーティング後15分から1時間の間に行った。画像は5秒ごとに10分間取得され、1セルあたり121枚の画像が得られた(<s...

このプロトコルは、広がる細胞の端にある突起の動的パラメータ(突起、収縮、フリル)を測定することを目的としています。

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

細胞端突起アッセイは、細胞遊走と直接相関することが示されている。したがって、細胞運動性に関与する重要なタンパク質およびシグナル伝達機構を同定するための予備的方法として使用することができる。この方法は、高速、単純、費用対効果が高く、蛍光標識や高価な蛍光顕微鏡の使用を必要としません。手順を実演するのは、私の研究室の学生であるMichal Gendlerです。2ミリリットルの通常の塩酸溶液をガラス底皿の中央に追加し、室温で20分間インキュベートする。2ミリリットルのPBSで皿を3回洗う。フィブロネクチンをPBS中の1ミリリットル当たり10マイクログラムの濃度で希釈し、希釈溶液200マイクロリットルをガラスセンター皿に加える。摂氏37度で1時間インキュベートする。1%BSA溶液とPBSを調製し、0.2マイクロメートルのフィルターに通します。予め加温した水浴中で摂氏70度で30分間インキュベートすることによって溶液を変性させる。コーティングされたガラス底皿を2ミリリットルのPBSで3回洗う。変性BSA溶液2ミリリットルを加え、皿を摂氏37度で1時間インキュベートする。ガラス皿を2ミリリットルのPBSで3回洗う。組織培養プレートの直径10センチメートル当たり70万個の細胞で16〜18時間の実験前に、70〜80%のコンフルエントを達成した。翌日、2ミリリットルのトリプシン溶液を組織培養プレートに加え、細胞が剥離するまで2〜3分間インキュベートする。5ミリリットルの培地を加えてトリプシンを不活性化する。血球計を用いて、底部ディッシュ中の2ミリリットルの完全培地中の細胞およびプレート20,000細胞を計数する。次いで、播種した細胞と共にディッシュをインキュベーター内で15分間インキュベートする。加熱ユニットの電源を入れ、撮影の1時間前に37°Cに設定してください。また、二酸化炭素ユニットの電源を入れ、撮影の10分前に5%に設定してください。顕微鏡とカメラの電源を入れます。コンピュータの電源を入れ、顕微鏡取得ソフトウェアを開きます。40倍のドライレンズ位相コントラストで倍率を設定します。ムービーの合計再生時間を 10 分に、時間間隔を 5 秒に設定します。15分間のインキュベーションの後、細胞が接着したガラス底皿をアダプターに入れて固定する。ディッシュの入ったアダプターを顕微鏡ステージのスロットに挿入します。皿カバーを外し、二酸化炭素の蓋を置き、二酸化炭素バルブを開きます。イメージングに適したセルを見つけます。セルに焦点を合わせた後、動画の取得を開始します。画像解析を行うには、画像解析ソフトで直線ツールを選択し、ラメラやセルエッジなど、45度ごとに半径方向の配置で凸部に垂直な20単位の8本の線を作ります。メインツールバーで、画像に移動し、[スタック]を選択し、[再スライス]をクリックして、細胞膜内の単一点の動きを説明するキモグラフ画像を生成します。キモグラフ画像を使用して、グリッド線でマークされたセル内の8つの領域のそれぞれにおける突起、後退、およびフリルの数を抽出し、手動でカウントします。これらの数字は、10分あたりの突起、収縮、フリルの頻度を表します。キモグラフィ解析により突起の持続性、距離、速度を決定します。突起距離を求めるには、突起の基部から突起の最高峰まで垂線を引きます。M キーを押して線の長さをピクセル単位で測定し、ピクセル対マイクロメートルの比率が長さをマイクロメートル単位で変換することがわかっていることを確認します。突起、反応、およびフリルの定量は、10分ごとに手動で行われ、突起および引っ込みについて得られた平均頻度は、フリルについて5.1および2.1であった。代表的なキモグラフは、突出距離が約4.8マイクロメートル、突起時間が約0.6分であった。分析から除外する必要があるセルの例が表されます。キモグラフィ解析により、細胞はその拡散期に存在せず、明確な膜突起を示さなかったことが明らかになった。最も重要なことは、イメージングのために正しい細胞を選択することです。適切な細胞は、その拡散段階にあるべきであり、細胞間の通信およびシグナル伝達を避けるために他の細胞に触れてはならない。この方法は、細胞移動アッセイの要求の厳しいより多くの結果を実行することを決定する前に、細胞運動性を含む細胞骨格ダイナミクスを試験するための予備ツールとして使用することができる。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

GFP -アクチンを発現するライブ内皮細胞におけるアクチン細胞骨格の研究

新しいイメージングプロトコルは、カスタムモーター駆動の機械式アクチュエータを使用して開発され、生細胞の機械的ひずみに対するリアルタイムの応答の測定を可能にしました。メカノバイオロジーに関連して、このシステムは最大20%のひずみを適用でき、共焦点顕微鏡または原子間力顕微鏡によるほぼリアルタイムのイメージングを可能にします。...

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微小パターン化細胞における細胞興奮性の時空間的パラメータの定量

本プロトコルでは、生細胞顕微鏡に基づく細胞拡散アッセイの実験手順を提示する。蛍光標識細胞の偏りのないセグメンテーションや細胞拡散時のラメリポディアダイナミクスの定量分析のためのオープンソース計算ツールを提供します。...

細胞拡散時の細胞エッジダイナミクスの定量的解析

本稿では、自動マルチチャンネルイメージングとメカノバイオロジカル解析を可能にし、Yes関連タンパク質(YAP)のメカノ感度を解明する統合多機能・ユーザープログラマブルシステムの活用方法に関する詳細な段階的プロトコルを提示する。...

多機能システムを用いたヒトがんおよび正常細胞における有形関連タンパク質の全光学機構調査

ここでは、空気圧で作動し、高解像度顕微鏡法と互換性のある汎用性の高い等二軸ストレッチデバイスを紹介します。...

高倍率生細胞共焦点蛍光顕微鏡用等二軸延伸装置

学ぶ細胞端突出アッセイを用いた細胞遊走ダイナミクスの測定法。生細胞顕微鏡とキモグラフィー解析で突出・後退・ラッフルの頻度と距離を定量化し、細胞運動性に関わるタンパク質とシグナル伝達機構の同定に有用です。

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