生細胞顕微鏡による拡散時の細胞端突出ダイナミクスの測定
November 1st, 2021
このプロトコルは、広がる細胞の端にある突起の動的パラメータ(突起、収縮、フリル)を測定することを目的としています。
細胞端突起アッセイは、細胞遊走と直接相関することが示されている。したがって、細胞運動性に関与する重要なタンパク質およびシグナル伝達機構を同定するための予備的方法として使用することができる。この方法は、高速、単純、費用対効果が高く、蛍光標識や高価な蛍光顕微鏡の使用を必要としません。
手順を実演するのは、私の研究室の学生であるMichal Gendlerです。2ミリリットルの通常の塩酸溶液をガラス底皿の中央に追加し、室温で20分間インキュベートする。2ミリリットルのPBSで皿を3回洗う。
フィブロネクチンをPBS中の1ミリリットル当たり10マイクログラムの濃度で希釈し、希釈溶液200マイクロリットルをガラスセンター皿に加える。摂氏37度で1時間インキュベートする。1%BSA溶液とPBSを調製し、0.2マイクロメートルのフィルターに通します。
予め加温した水浴中で摂氏70度で30分間インキュベートすることによって溶液を変性させる。コーティングされたガラス底皿を2ミリリットルのPBSで3回洗う。変性BSA溶液2ミリリットルを加え、皿を摂氏37度で1時間インキュベートする。
ガラス皿を2ミリリットルのPBSで3回洗う。組織培養プレートの直径10センチメートル当たり70万個の細胞で16〜18時間の実験前に、70〜80%のコンフルエントを達成した。翌日、2ミリリットルのトリプシン溶液を組織培養プレートに加え、細胞が剥離するまで2〜3分間インキュベートする。
5ミリリットルの培地を加えてトリプシンを不活性化する。血球計を用いて、底部ディッシュ中の2ミリリットルの完全培地中の細胞およびプレート20,000細胞を計数する。次いで、播種した細胞と共にディッシュをインキュベーター内で15分間インキュベートする。
加熱ユニットの電源を入れ、撮影の1時間前に37°Cに設定してください。また、二酸化炭素ユニットの電源を入れ、撮影の10分前に5%に設定してください。顕微鏡とカメラの電源を入れます。
コンピュータの電源を入れ、顕微鏡取得ソフトウェアを開きます。40倍のドライレンズ位相コントラストで倍率を設定します。ムービーの合計再生時間を 10 分に、時間間隔を 5 秒に設定します。
15分間のインキュベーションの後、細胞が接着したガラス底皿をアダプターに入れて固定する。ディッシュの入ったアダプターを顕微鏡ステージのスロットに挿入します。皿カバーを外し、二酸化炭素の蓋を置き、二酸化炭素バルブを開きます。
イメージングに適したセルを見つけます。セルに焦点を合わせた後、動画の取得を開始します。画像解析を行うには、画像解析ソフトで直線ツールを選択し、ラメラやセルエッジなど、45度ごとに半径方向の配置で凸部に垂直な20単位の8本の線を作ります。
メインツールバーで、画像に移動し、[スタック]を選択し、[再スライス]をクリックして、細胞膜内の単一点の動きを説明するキモグラフ画像を生成します。キモグラフ画像を使用して、グリッド線でマークされたセル内の8つの領域のそれぞれにおける突起、後退、およびフリルの数を抽出し、手動でカウントします。これらの数字は、10分あたりの突起、収縮、フリルの頻度を表します。
キモグラフィ解析により突起の持続性、距離、速度を決定します。突起距離を求めるには、突起の基部から突起の最高峰まで垂線を引きます。M キーを押して線の長さをピクセル単位で測定し、ピクセル対マイクロメートルの比率が長さをマイクロメートル単位で変換することがわかっていることを確認します。
突起、反応、およびフリルの定量は、10分ごとに手動で行われ、突起および引っ込みについて得られた平均頻度は、フリルについて5.1および2.1であった。代表的なキモグラフは、突出距離が約4.8マイクロメートル、突起時間が約0.6分であった。分析から除外する必要があるセルの例が表されます。
キモグラフィ解析により、細胞はその拡散期に存在せず、明確な膜突起を示さなかったことが明らかになった。最も重要なことは、イメージングのために正しい細胞を選択することです。適切な細胞は、その拡散段階にあるべきであり、細胞間の通信およびシグナル伝達を避けるために他の細胞に触れてはならない。
この方法は、細胞移動アッセイの要求の厳しいより多くの結果を実行することを決定する前に、細胞運動性を含む細胞骨格ダイナミクスを試験するための予備ツールとして使用することができる。
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概要
この研究では、突起、縮小、そしてラッフルを含む広がる細胞の動的パラメータを調査するための細胞端突起アッセイを提示します。この方法は、細胞の移動と相関関係があるため、細胞の移動性に関与する重要なタンパク質とシグナリングメカニズムの特定に役立ち、特に重要です。
主要な研究構成要素
研究領域
- 細胞の移動
- 細胞の運動性
- 細胞骨格のダイナミクス
背景
- 細胞端の突起と細胞の移動の間に相関関係が存在します。
- アッセイは簡単で、コスト効率が高く、蛍光標識を必要としません。
- 突起を理解することで、細胞の挙動と移動を駆動するメカニズムについての洞察が得られます。
使用した方法
- 細胞端突起アッセイ
- ガラス底皿に付着した細胞
- 突起を評価するためのキモグラフィー分析
主な結果
- 突起の平均頻度は10分間につき5.1回で、ラッフルは2.1でした。
- キモグラフィー分析により、突起の距離は約4.8マイクロメートルであることが明らかになりました。
- 正確な結果を得るために広がる段階で適切な細胞を選ぶことの重要性を特定しました。
結論
- この研究は、細胞の運動性のダイナミクスを評価するためのアクセスしやすいアッセイを導入します。
- この方法は、より複雑な移動アッセイが行われる前の予備評価ツールとして機能します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Cell-edge protrusion dynamics serve as an early, predictive readout of cell motility, enabling rapid assessment of cytoskeletal regulators before committing to resource-intensive migration assays. This method supports target validation by linking molecular perturbations to functional membrane dynamics, providing mechanistic de-risking in discovery workflows. Its label-free, cost-effective design facilitates high-throughput screening of signaling pathways relevant to wound healing, immune response, and cancer metastasis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures protrusion frequency, persistence, distance, and velocity to interrogate therapeutic hypotheses on actin regulators and motility pathways.
- Operational Value: Enables rapid, label-free screening of protein knockdowns or inhibitors affecting cytoskeletal dynamics.
- Predictive Value: Correlates protrusion dynamics with cell migration, supporting go/no-go decisions based on early phenotypic readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative kymograph-derived metrics (protrusion count, distance, velocity) for standardized comparison across experimental conditions.
- Operational Value: Uses phase-contrast microscopy and accessible image analysis tools, reducing dependency on specialized equipment or fluorescent probes.
- Scalability: Supports multi-condition testing via radial sampling of eight membrane regions per cell, enhancing data robustness.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges molecular target modulation to functional cellular behavior in disease-relevant systems like fibroblasts or immune cells.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypic effects stem from altered protrusion dynamics rather than secondary cytotoxicity or adhesion defects.
- Biomarker Alignment: Protrusion parameters can serve as translational biomarkers when linked to in vivo motility or invasion phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target engagement to phenotypic validation, acting as a bridge between biochemical screening and functional cell-based assays.
- Discovery Biology: Tests how genetic or pharmacological manipulations of actin regulators (e.g., Arp2/3, cofilin, Rho GTPases) impact protrusion dynamics as a proxy for motility.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs (e.g., protrusions per 10 minutes, protrusion velocity) that enable comparison across compound libraries or genetic screens.
- Analytics: Kymography provides temporal and spatial resolution of membrane dynamics, allowing extraction of kinetic parameters critical for mechanistic modeling.
- Translational Research: Supports continuity to preclinical models by validating that target hits produce consistent protrusion phenotypes in primary or disease-relevant cell lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, low-cost platform for repeated use across projects investigating cell motility in development, inflammation, or oncology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly linking molecular perturbations to quantifiable membrane dynamics.
- Operational Value: Eliminates need for fluorescent labeling and expensive imaging hardware, lowering assay barrier and increasing accessibility.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by filtering targets early using a predictive, phenotypic anchor to cell migration.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on concordance between protrusion dynamics and migratory potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging, kymograph generation, and manual or semi-automated protrusion analysis.
- Depends on phase-contrast microscopy and image analysis software capable of reslice and kymograph generation.
- Necessitates standardization of cell seeding density, substrate coating (fibronectin/BSA), and environmental controls (37°C, 5% CO2) for reproducibility.
- Requires training to identify appropriate spreading-phase cells and avoid confluent or contacting cells that confound protrusion measurements.
- Limited to 2D substrate-associated spreading; may not fully capture 3D invasion or confined migration phenotypes.
