ブレフェルジンA注射による腎臓内の分泌タンパク質源の同定

私たちの技術により、損傷した腎臓におけるサイトカイン産生細胞の発生源と相対的な寄与を特定することができます。ブレフェルジンAを使用してタンパク質の分泌を防ぐことで、細胞の種類やこれらの細胞の状態など、固体臓器でサイトカインを産生する細胞に関するより多くの情報を収集できます。

私たちのプロトコルは、多くの臓器系に簡単に適応できる必要があります。ブレフェルジンAは細胞透過性の小分子であるため、ほとんどの細胞型で分泌を阻害し、サイトカインやその他の分泌タンパク質の検出を可能にするはずです。

尾骨注射は、マウスの尾骨が非常に小さいため、技術的に最も困難なステップです。実験動物でプロトコルを実行する前に、このステップを実践することをお勧めします。

[講師]まず、ケージを加熱パッドに半分、半分ずつ置いて 10 分間置き、マウスが温まるようにします。マウスを拘束装置に入れた後、ポビドンヨードとアルコール綿棒を使用して尾を3回消毒します。尾を水平に持ち、尾の外側静脈を視覚化します。次に、針と注射器を頭の方向に向かって静脈と平行に保ちながら、28ゲージの針を挿入します。1.25ミリリットルあたり1.25ミリグラムのBFA溶液を200マイクロリットル注入します。血液が注射液に置き換えられると、静脈が透明になるはずです。次に、針を抜き、出血が止まるまで尾を軽く押します。マウスをケージに戻し、追加の出血や苦痛の兆候がないか監視します。20ミリリットルの注射器を使用し、灌流液が透明になるまで、10〜20ミリリットルのPBSを左心室に毎分2〜4ミリリットルの流量でマウスを灌流します。腎動脈と静脈を乳頭の近くに持ち、腎臓から離れた側の血管を切断して腎臓を切除します。次に、腎臓カプセルを手または細かい滅菌鉗子で剥がして、そっと取り除きます。疎水性バリアマーカーペンを使用して、組織から疎水性バリアの輪郭まで少なくとも5ミリメートルの距離を維持しながら、組織切片の輪郭を描きます。次に、3%ロバ血清と0.1%トリトンを含む50マイクロリットルのブロッキングバッファーを1%ウシ血清アルブミンTBSにセクションの上に加えます。加湿チャンバー内で室温で1時間インキュベートします。一次抗体を適切な濃度のPBSで希釈します。サイトカインを検出するには、TGFベータ1、PDGF-D、またはCTGFに対する抗体を50マイクロリットルのPBSで希釈します。Cy3と結合した抗アルファSMA一次抗体を一次抗体溶液に1:200希釈で添加し、筋線維芽細胞を標識します。ブロッキングバッファーを取り除き、一次抗体を切片に追加し、円形の疎水性アウトラインから漏れないようにします。加湿されたチャンバーで摂氏4度で一晩インキュベートします。加湿チャンバーをインキュベーターから取り出し、スライドをPBSで3回5分間洗浄します。次に、適切な二次抗体をPBSで1〜200に希釈します。サンプルを50マイクロリットルの二次抗体溶液とともに、加湿チャンバー内で室温で1時間インキュベートします。加湿チャンバーからスライドを取り出し、PBSで5分間洗浄します。PBS中のフルオレセインと結合したハステトラゴノロブスレクチンをカルシウムとマグネシウムで10マイクログラム/ミリリットルの濃度で希釈します。次に、組織を50マイクロリットルのLTL溶液とともに、加湿チャンバー内で室温で30分間インキュベートします。加湿チャンバーからスライドを取り出し、カルシウムとマグネシウムを含むPBSで5分間洗浄します。組織を50マイクロリットルのDAPIでインキュベートし、室温で5分間DNA核を染色します。PBSで1回洗浄します。20マイクロリットルの退色防止埋入試薬を組織に加えてカバースリップを取り付け、カバースリップをゆっくりと配置します。イメージングする前に、退色防止試薬が固まるまで 24 時間待ちます。自動XYステージを備えた倒立顕微鏡の電源を入れ、20倍対物レンズを選択します。スライドを顕微鏡ステージに置き、組織切片を見つけます。次に、画像取得ソフトウェアを開き、ライブをクリックしてライブビューウィンドウを開きます。焦点が合っていることを確認する組織セクションを見つけます。取得メニューをクリックし、[大きな画像をスキャン]を選択します。ジョイスティックを使用してステージを組織セクションの左端に移動し、左矢印をクリックして、スキャンする領域を設定します。これを最上部、最右、および下部の組織セグメントに対して繰り返します。取得メニューをクリックし、マルチチャネルキャプチャのチェックボックスがオンになっていることを確認します。 マルチチャンネル画像をキャプチャするには、ラムダタブをクリックし、各チャンネルをクリックして、画像のどの部分も飽和させずに染色が明らかになるレベルに露光時間を設定します。収集するチャネルごとにこれを繰り返します。次に、「スキャン」をクリックします。画像取得ソフトウェアを開き、「ファイル」をクリックします。次に、「開く」をクリックして画像を選択します。画像ウィンドウを右クリックし、[多角形 ROI] を選択します。フリーハンドツールでROIの概要を描きます。次に、LTL陽性尿細管細胞またはアルファSMA陽性間質細胞の輪郭を描きます。測定タブをクリックし、しきい値をクリックします。スライダーを正の信号領域の両側に調整して、しきい値の上限と下限を設定します。次に、「ROI」タブをクリックします。最後に、エクスポート アイコンをクリックして値を保存します。スプレッドシート ソフトウェアを使用して、ROI 領域ごとに正の信号領域の割合を計算します。

[プレゼンター]シスプラチンまたは生理食塩水投与後 3 日目の TGF ベータ陽性小胞が代表的な画像に示されています。TGF ベータ陽性小胞は、BFA の存在下でシスプラチン処理された腎臓の LTL で標識された PTC で観察されます。しかし、これらの小胞は、損傷していない腎臓または BFA 未治療の腎臓では観察されませんでした。

[講師]修正により、シスプラチン誘発性急性腎障害における BFA 治療による TGF ベータ陽性領域の増加が明らかになりました。TGF ベータと同様に、PTGF-D 陽性または CTGF 陽性の小胞もシスプラチン誘発 AKI の BFA 治療で蓄積しました。定量化により、PDGF-D 陽性領域と CTGF 陽性領域も BFA で有意に増加することが示されました。LTL 陽性の近位尿細管細胞では、BFA 注射はシスプラチン注射後 3 日目の血漿 BUN レベルを有意に増加させませんでした。TGF ベータ陽性小胞は、BFA 処理を受けたシスプラチン AKI のアルファ SMA 標識間質細胞で観察されました。修正により、シスプラチン AKI の BFA 治療により、アルファ SMA 陽性領域の TGF ベータ陽性領域が大幅に増加することが明らかになりました。TGF ベータ陽性小胞と同様に、CTGF 陽性小胞も BFA 治療で増加しました。定量分析により、BFA 治療により、シスプラチン誘発 AKI における CTGF 陽性領域とアルファ SMA 陽性領域の比率が向上することが実証されました。シスプラチン誘発性損傷と比較して、PTCのTGF-ベータ陽性小胞はAAの慢性期ではるかに小さかった。LTL陽性PTCでは陽性染色は最小限でした。しかし、腎損傷分子 1 陽性 PTC における TGF ベータのシグナル強度は、BFA 治療により増加しました。TGF ベータの平均強度レベルは、BFA 注射の方が BFA 注射の方が 3 倍高かった。

最も重要なステップは、尾静脈注射が確実に成功することです。注射に失敗すると結果が台無しになります。ですから、注射で静脈が透明になるなどの成功の兆候を探し、尻尾の腫れなどの失敗の兆候を探してください。

ブレフェルジンA注射は、ウェスタンブロットやフローサイトメトリーなどの多くのアッセイと組み合わせて、臓器または単一細胞スケールでサイトカイン産生を評価することができます。

この技術を用いて、これまで他の細胞型に由来すると考えられていた腎上皮細胞から分泌される新規サイトカインを同定することができました。これは、特定の細胞型が損傷に寄与するという長年の議論を解決するために使用できます。