Name: 核磁気共鳴分光法によるアルギニンメチロームの探索 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 学ぶ アルギニンメチロームの定量法。核磁気共鳴分光法を用いて細胞や組織、バイオ流体など多様な生物学的試料中のアルギニン修飾レベルを測定し、がんなどの疾患バイオマーカーとしての可能性を評価する。

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この研究は、オーストリア科学基金(FWF)の助成金P28854、I3792、doc.funds BioMolStruct DOC 130、DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz(フラッグシッププロジェクトDYNIMO)、オーストリア研究振興庁(FFG)の助成金864690、および870454の統合代謝研究センターGrazによってサポートされました。オーストリアインフラプログラム2016/2017、シュタイアーマルク州政府(Zukunftsfonds)、福建医科大学の高レベルの才能のためのスタートアップ基金(XRCZX2021020)。細胞培養施設へのアクセスを提供してくれた医学研究センターに感謝します。F.Z.は、グラーツ医科大学の博士課程分子医学の枠内で訓練を受けました。Q.Z.は、グラーツ医科大学の博士課程の代謝および心血管疾患の枠組みの中で訓練を受けました。

酵母タンパク質加水分解物は、この研究の代表的な結果のサンプルとして使用されました。プロトコル全体を 図 1 にまとめます。
1.材料と試薬の準備
<ol><li>メタノール/水:99%メタノール(MeOH)2部とH 2 O1部の混合物を調製し、MeOH/H 2 Oと命名します。 純粋なMeOHとMeOH/H2Oを-20°Cで保存して、アルコールの蒸発を最小限に抑え、サンプルの安定性を高めます。</li>
	<li>塩酸(HCl):濃塩酸(12.0モル/ Lまたは37%)から9モル/ Lを希釈し、HClを0.1モル/ Lします。高濃度(9 mol/L)溶液はタンパク質の加水分解に使用され、低濃度(0.1 mol/L)溶液は固相抽出に使用されます。 注意: ドラフト内で作業してください。</li>
	<li>10%の飽和アンモニア溶液(ストック:30%w / wアンモニア)、50%のメタノール、および40%の水(v / v)を含むSPEの交換溶液を準備します。</li>
	<li>NMRバッファー:5.56 gのリン酸水素二ナトリウム(Na2HPO 4、0.08 mol/L)、0.4 gの3-(トリメチルシリル)プロピオン酸-2,2,3,3-d4ナトリウム塩(TSP、5 mmol / L)、0.04 %(w / v)のアジ化ナトリウム(NaN3)を500 mLの二酸化重水素(D2O)に溶解し、pH7.4に調整します(HClまたはNaOHを使用して、 それぞれ)(材料表を参照)。NMR分光法により、新しい各バッファーバッチの純度を確認します。 注意: 汚染物質(エタノールなど)の量はできるだけ少なくする必要があります。</li>
	<li>パルプ化チューブに酸化ジルコニウムビーズを充填します(2 mLチューブと1.4 mmビーズがほとんどの用途に適していますが、さまざまなバリエーションがあります)( 材料の表を参照)。手で約10〜20個のビーズを充填するか、事前に充填されたチューブを購入します。</li>
	<li>ピペットとそれぞれのチップを10〜1,000μLの範囲で準備してください。 注:作業全体を通して、≥18.2MΩ・cm-1の高抵抗で定義されたH2Oと呼ばれる高純度の水を使用しました。二重蒸留水に相当します。</li>
</ol>2.サンプルの収集と保管
<ol><li>液体サンプル(血清/血漿、細胞培養上清など)を液体窒素で急速凍結し、使用するまで-80°Cで保存します。</li>
	<li>下記のように固体材料を準備します。<ol><li>接着細胞を収集するか、冷たいリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、掻き取りおよび遠心分離するか、懸濁液で増殖させた細胞を直接遠心分離することにより、細胞培養物(3〜500万細胞)から細胞を収集します。</li>
		<li>細胞上清を除去し(連続直接測定(ステップ6を参照)、または可溶性タンパク質の沈殿後、ステップ3.1を参照)、ペレットを液体窒素で瞬間凍結し、-80°Cで保存します。 さらなる処理については、ステップ 3.2 を参照してください。</li>
		<li>研究の目的に従って組織を保管および収集します。肝臓や筋肉などの非常に均質な組織については、その任意の部分を分析します。例えば、マウス脳の場合、脳全体または脳切片の全体的なアルギニンメチル化を決定する。 注:処理する組織の理想的な重量は30〜60 mgです。脳全体を凍結して粉砕し、そのアリコートを使用することをお勧めします。あるいは、特定の脳部分(例えば、前頭、小脳、後頭部、または1つの半球、体重~250mg)が使用されてもよい。</li>
	</ol></li>
</ol>3. サンプルの予備調製
注意: MeOHを冷たく保ちながら、氷上で作業を行います。また、タンパク質の分解を避けるために、サンプルを氷上に保管する必要があります。
<ol><li>液体サンプルの場合は、200 μLのサンプルに400 μLの氷冷メタノールを加えます。ステップ 3.3 に進みます。 注意: 利用可能なサンプルが少ない場合は、それに応じて音量を調整してください。NMR感度は通常、少量のサンプルには十分に高くなりますが、個別にテストする必要があります。</li>
	<li>固体材料の場合は、ライセート用に十分な1.5 mLチューブを準備します(ホモジナイズ後の遠心分離に使用)。<ol><li>慎重に、しかし徹底的に、細胞ペレットを600 μLのMeOH/H2Oに再懸濁し、液相全体をパルプ化チューブに移します。</li>
		<li>組織をパルプ化チューブに入れ(チューブに直接計量できます)、600 μLのMeOH / H2Oを追加します(30〜60 mgの場合、重量が大幅に異なる場合は調整します)。</li>
		<li>チューブを組織ホモジナイザー( 材料表を参照)に入れ、激しい振とうで20秒間1回ホモジナイズするか(細胞ペレット、軟部組織の場合)、または5分の間隔でそれぞれ20秒間(または必要に応じてそれ以上)ホモジナイズします(硬い組織の場合)。</li>
		<li>ホモジナイズ後、すぐにサンプルを再び氷の上に置き、ライセート全体を新しい1.5 mLチューブに移します。</li>
	</ol></li>
	<li>さらに処理する前に、サンプルを-20°Cで少なくとも30分間(最大数日間)保存してください。</li>
	<li>10,000 x g で4°Cで30分間遠心分離します。 それまでの間、上清を集めるのに十分な1.5mLチューブを準備します。 注:この上清(図1の「( 1)」と指定)は、廃棄、凍結乾燥、NMRのために直接処理するか(ステップ6)、それ以外の場合は分析することができます。</li>
	<li>このプロトコルでは、MeOH沈殿物(=それぞれステップ3.1または3.2.2の後に得られたペレット)は、とりわけ、核酸および脂質、アルギニンメチル化タンパク質などの成分を含むさらなる分析に使用される。タンパク質加水分解を続けるか、ペレットを-20°Cで数日間保存します。</li>
</ol>4.タンパク質加水分解
<ol><li>各サンプルに500 μLの9 mol/LのHClを加えます。次に、各チューブのキャップをハサミで切り取り、ガラス培養チューブに入れます(図2A)。慎重に、しかししっかりと、赤いキャップを閉じます(それによってシーリングを確認します)。 注意: 使用する前に、必ず各シーリング(赤いスクリューキャップの内側の灰色のPTFEホイル)が適切に締められていることを確認し、定期的に水で清掃してください。</li>
	<li>終了したら、チューブを部分的に砂で満たされたビーカーに入れ(熱伝達を改善するため)、乾燥チャンバーで110°Cで約16時間サンプルを加水分解します。</li>
	<li>加水分解後、サンプルを冷却します(~1時間)。</li>
	<li>その後、高真空(100Pa以下)の遠心分離機を用いて一晩凍結乾燥する。</li>
	<li>ペレットを0.1 mol/L HClの1 mLに溶解し(乾燥していない場合は凍結乾燥を継続)、各チューブに50 μLのクロロホルム(CHCl3)を加えます。ペレットを1,000 μLピペットで完全に溶解し、液体を混合してから、全容量を新しいチューブに移します。 注意: 広範囲の蒸発を最小限に抑えるために、常に少量で作業してください</li>
	<li>その後、8,000 x g で室温で10分間遠心分離します。</li>
	<li>水溶性画分を含む二相性液体の上相(図2B、密度の低い画分)をピペットで慎重に収集し、新しいチューブに充填します。手動SPE(セクション5.2)には1.5 mLチューブを使用し、ロボットSPEにはガラスバイアル(セクション5.3および 図2D)を使用します。CHCl3 とその内容物にこぼれないようにしてください(図2C)。</li>
</ol>5.固相抽出(SPE)
<ol><li>最初に使用する前に、SPEカートリッジを1 mLの交換溶液で2回洗浄し(ステップ1.3)、その後、800 x g で室温で1分間遠心分離します(15 mLチューブに入れます)。それらはそれぞれ10-20回使用することができます。</li>
	<li>マニュアルSPE<ol><li>1 mLの純メタノールと2 x 1 mLのPBSで毎回カートリッジ( 材料の表を参照)を事前調整し、毎回室温で800 x g で1分間遠心分離します(15 mLチューブに入れます)。</li>
		<li>その後、サンプル(ステップ4.7から)をSPEカートリッジにロードし、室温で600 x g で2分間遠心分離します。</li>
		<li>次に、以下のように洗浄サイクルを適用します。<ol><li>1mLのH2Oを3回添加する(それぞれ室温で800 x g で1分間遠心分離する)。</li>
			<li>0.1 mol/L HCl を 1 mL に 5 回加えます (それぞれ室温で 800 x g で 1 分間遠心分離します)。</li>
			<li>1 mLのMeOHを2回加えます(それぞれ室温で800 x g で1分間遠心分離します)。</li>
		</ol></li>
		<li>次に、アルギニンとその誘導体を3 x 1 mLの置換溶液で溶出し(その後、室温で800 x g で1分間遠心分離)、単一の15 mLチューブに入れます。 注意: 置換溶液は、アルギニンおよび誘導体の溶離液として機能し、カートリッジの洗浄にも使用されます(すべての物質は、溶出前に、または置換溶液の基本pH値で洗い流されます)。それでも、時間の経過とともに汚染を避けるために、再利用を制限する必要があります(ステップ5.1を参照)。</li>
	</ol></li>
	<li>ロボットSPE 注:ここでは、ピペッティングロボット(ピペッティングニードル、ニードルの洗浄ステーション、試薬供給、サンプルと溶出物の位置で構成される主要部分、 材料表を参照)にSPEカラム用のカートリッジホルダーが付属しています。その他の楽器については、記載されているすべてのものが完全装備されていることを確認してください。<ol><li>上清(ステップ4.7から)をPTFEシーリングでガラスバイアルに直接充填し(図2D)、十分な試薬(それぞれ100 mL、すなわち、交換液、99%のMeOH、PBS、H 2 O、および0.1 mol/LHCl)、溶出用の5 mLチューブ、およびロボットの針用の洗浄溶液(通常はH2O)を準備します。</li>
		<li>手動SPEで説明されている手順(手順5.2)に正確に基づいて、ロボットのソフトウェアでアプリケーションまたは方法を使用します。 注意: 詳細は機器のサプライヤーによって大きく異なる場合があるため、プログラミングについては、それぞれのロボットのソフトウェアマニュアルを参照してください。ピペッティングロボットは通常、遠心分離の代わりにカートリッジに空気圧を加えることによって動作しますが、これが主な違いです。プロトコルを確立して初めて実行する場合は、最適なワークフローを検証するためにコントロール(既知の濃度のL-アルギニンなど)を含めます。</li>
	</ol></li>
</ol>6. NMRの最終準備
<ol><li>サンプルを一晩凍結乾燥して完全に乾かし、アンモニアとH2Oを取り除きます。</li>
	<li>各サンプルを500 μLのNMRバッファーに溶解し(ステップ1.4)、NMRチューブに移します。重要なのは、容量はすべてのチューブで同じでなければならず、サンプルは均質でなければなりません(凝集する傾向がある残留物や脂質がない)。 注:NMR分光法の詳細は、この方法のレビューを超えて、他の場所でより詳細に説明されています27。ここでは、主な要件と手順のみを説明します。アルギニンとその代謝産物の定量は、600 MHz NMR分光計で行われます( 材料表を参照)。原則として、アルギニンとメチル化アルギニンのNMRシグナルが十分な感度で、シグナルの重複なしに検出できれば、他のNMR分光計/NMR電界強度を使用できます。パルスシーケンスが適切に設定されていれば、 1Hスペクトルを記録できるz軸勾配を持つプローブヘッドを使用できます。</li>
	<li>CPMG(Carr-Purcell-Meiboom-Gill)パルスシーケンス33,34(cpmgpr1d、512スキャン、fid 73728のサイズ、600 MHz NMRでの11904.76 Hzスペクトル幅、リサイクル遅延4秒)を使用して、プリサチュレーションを使用した水信号抑制を使用して1Dスペクトルを記録します。</li>
	<li>これらの実験では、仮想デカップリングによって1Hスカラーカップリングを除去し、信号のオーバーラップを減らします。特定の質問および/または複雑なサンプルまたはマトリックス、例えば1H-13Cヘテロ核単一量子コヒーレンス(HSQC)スペクトル27について追加記録する。 注:メチル化アルギニンの1HNMRシグナルが他の代謝物(リジンなど)の1H NMRシグナルと部分的に重複する可能性のあるより複雑なマトリックスの場合、1Hホモ核J分解スペクトル(JRES)35が必要です。</li>
	<li>既知の濃度の標準物質(100 μmol/アルギニンなど)のそれぞれのピーク強度を積分することにより、絶対定量を実行します。 注:通常、ADMA、SDMA、およびMMA( 材料の表を参照)は、アルギニンに対する比率として報告されます。これは、個別の正規化(例えば、細胞数、組織質量、タンパク質濃度)を実行する必要がないという重要な利点を有する。その場合、アルギニンは内部標準として機能し、生物学的に関連する情報を得るには相対定量で十分です。</li>
	<li>SDMAおよびMMAの鑑別のために、サンプルを再度凍結乾燥してD2Oを除去し(以前にNMRバッファーに再懸濁されている場合)、次いでこれを重水素化ジメチルスルホキシド(d6−DMSO)で置換し、メチル共鳴27の分離を可能にする。したがって、NMRチューブからパスツールピペットでサンプルを吸引し、凍結乾燥して、500 μLのd 6-DMSOに溶解します。</li>
</ol>

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</ol>

著者は競合する利益を宣言しません。

次のセクションでは、主な焦点はメソッド自体にあります。アルギニンメチル化の生物学的影響は、はじめにのセクションで説明されています。
まず、硬さの異なる組織はサンプル溶解の調整が必要な場合があります:細胞培養からの細胞(細菌、酵母などを含む)および脳、若い肝臓、平滑筋などの組織は迅速に均質化することができます。高剛性の組織(高齢者の肝臓、動脈、骨などを含む)の場合、均質化を2回行う必要があります(ステップ3.2.3を参照)。それにもかかわらず、たとえいくらかの不溶性の残骸が残っていても、このプロセスはより頻繁に続けられるべきではありません。代わりに、サンプルを10,000 x g で10分間遠心分離し、上清を収集してさらなる分析を行う必要があります(サンプルの劣化を最小限に抑えるため)。
サンプルが凍結される各ステップ(最初に、MeOHを添加した後、それぞれステップ3.3、3.4、または3.5)または凍結乾燥後(ステップ4.4および6.1)で、サンプルをさらに処理する前に数日間保存できます。さらに、ステップ3....

過去20年間、アルギニン残基のメチル化は、タンパク質の必須の翻訳後修飾として認識されてきました。それは、転写の調節、シグナル伝達などの基本的な生物学的プロセスに影響を与えます1。アルギニンメチル化の制御に関与する主なタンパク質は、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ(PRMT)2です。アルギニンの主な誘導体は、ω-(N G,N G)-不斉ジメチルアルギニン(ADMA)、ω-(N G,N'G)-対称ジメチルアルギニン(SDMA)、およびω-N G-モノメチルアルギニン(MMA)2です。
PRMTは、S-アデノシル-l-メチオニンを使用して、メチル基をタンパク質結合アルギニン1の末端グアニジノ基(2つの等価アミノ基を持つ)に転移します。2つの主要な酵素を区別することができます:タイプIとタイプIIの両方の酵素は、MMAを形成するための最初のメチル化ステップを触媒します(これにより、その対称性を失います)。このステップに続いて、I型酵素(例えば、PRMT1、2、3、4、6、8)はADMAを形成するための基質としてMMAを使用するが、II型酵素(主にPRMT5およびPRMT9)はSDMAを産生する。PRMT1は、哺乳類細胞から単離された最初のタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼでした3。それでも、PRMTは、非哺乳類の脊椎動物、無脊椎動物の脊索動物、棘皮動物、節足動物、線虫などの他の動物では進化的に保存されています4 刺胞動物5、植物6、および酵母7のような真菌を含む原生動物。多くの場合、PRMTの1つをノックアウトすると生存能力が失われ、転写、翻訳、シグナル伝達、アポトーシス、液液相分離(核小体などの膜のない細胞小器官の形成を意味する)などの基本的な細胞プロセスに関与するメチル化アルギニン種の本質的な役割が明らかになります。.次に、これは、癌11、12、13、多発性骨髄腫14、心血管疾患15、ウイルス病因、脊髄性筋萎縮症16、糖尿病17、および老化1を含む生理学および病状に影響を与えます。タンパク質分解による肺18に由来する血流中のADMAレベルの上昇は、内皮機能障害、慢性肺疾患19、および他の心血管疾患症候群20と関連していると考えられている。PRMTの過剰発現は腫瘍形成を促進することが見出されており、予後不良と関連している21,22。さらに、PRMT6とPRMT7のアブレーションは、細胞老化表現型23を引き起こします。有意な減少したADMAおよびPRMT1は、WI−38線維芽細胞の老化の間に見出されている24。
課題は、メチル化が(病理学的)生理学的プロセスでどのように作用するかを理解することであり、タンパク質のアルギニンメチル化を特定および定量することです。現在のアプローチのほとんどは、メチル化アルギニンを検出するために抗体を使用しています。しかしながら、これらの抗体は依然として状況特異的であり、アルギニンメチル化タンパク質の異なるモチーフを認識できない可能性がある25,26。記載されたプロトコールにおいて、前述のアルギニン誘導体の全ては、核磁気共鳴(NMR)分光法によって、すなわち、単独で、組み合わせて、または、ほとんどの場合と同様に、真核細胞(例えば、酵母、マウス、またはヒト起源)および組織27、ならびに血清28のような複雑な生物学的マトリックス内で確実に定量することができる。タンパク質およびそれらの複雑なマトリックスの場合、タンパク質加水分解29は、アルギニン、MMA、SDMA、およびADMAなどの遊離(修飾)アミノ酸を生成するための前提条件である。固相抽出(SPE)30により、目的の化合物を濃縮できます。最後に、1H-NMR分光法により、アルギニンとアルギニンのすべての主要なメチル誘導体を並行して検出できます。NMR分光法には、真に定量的で再現性が高く、堅牢な技術であるという利点があります31,32。最終的なNMR測定は、多くのサンプルが収集および準備された後で行うことができます。最後に、このプロトコルは、独自のNMR分光計を必要としないため、主にサンプル調製に焦点を当てています。それはほとんどの生化学実験室で行うことができます。それでも、NMR分光測定を行うべきいくつかのヒントがこの研究で提供されています。

<table><tbody><tr><td>15 mLチューブ</td><td>Greiner Bio One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>3-(トリメチルシリル)プロピオン酸-2,2,3,3-d4ナトリウム塩(TSP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A1448</td><td></td></tr><tr><td>5 mLチューブ、丸底</td><td>Greiner Bio One</td><td>115101</td><td></td></tr><tr><td>アンモニア溶液32%</td><td>Roth</td><td>A990.1</td><td></td></tr><tr><td>Bruker 600 MHz NMR分光計、TXIプローブヘッドBruker</td><td></td><td>-を装備</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵遠心分離機、例えば5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000010</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform &ge;年率99%</td><td>Roth</td><td>3313.1</td><td></td></tr><tr><td>Cryocool</td><td>Thermo Scientific</td><td>SCC1</td><td>SpeedVac システム用熱伝達流体</td></tr><tr><td>酸化重水素 (D2O)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-10-PK</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド-d6 (d6-DMSO)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-6-1000</td><td></td></tr><tr><td>乾燥チャンバー</td><td>バインダー</td><td>9090-0018</td><td></td></tr><tr><td>DURAN培養チューブ、13 x 100mm、GL 14、9 mL</td><td>VWR International</td><td>212-0375</td><td></td></tr><tr><td>Edwards Deep vacuum oil pump RV5</td><td>Thermo Scientific</td><td>16234611</td><td>SpeedVac System の一部</td></tr><tr><td>Eppendorf 1.5 mL チューブ</td><td>Greiner Bio One</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>Gilson ピペッティングロボット GX-241 Aspec</td><td>Gilson Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>26150008 L-アルギニン</td><td>AppliChem</td><td>A3675</td><td></td></tr><tr><td>メタノール &ge;99%</td><td>Roth</td><td>8388.4</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q ウォーター アパラタス</td><td>ミリポア</td><td>ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>オアシス MCX 1cc/30 mg、1 mL カートリッジ</td><td>ウォーターズ</td><td>イ 186000252</td><td>https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/</td></tr> <tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>ロンザ</td><td>LONBE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>プレセル 24 組織ホモジナイザー</td><td>ベルタン機器</td><td>P000669-PR240-A</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/ Precellys tubes (pulping tubes)</td><td>VWR International</td><td>432-0351</td><td></td></tr><tr><td>Precellyse 1.4 mm 酸化ジルコニウムビーズ</td><td>VWR International</td><td>432-0356</td><td></td></tr><tr><td>Reacti-Therm/ReactiVap 加熱、攪拌、蒸発モジュール</td><td>ThermoScientific</td><td>TS-18820</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mLチューブ用 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820 ローター、FA-45-30-11</td><td>Eppendorf</td><td>5427753001</td><td></td></tr><tr><td>Savant Refrigerated Cooling Trap</td><td>Thermo Scientific</td><td></td> System <td>15996161 Savant</td></tr><tr><td>SpeedVac システムの一部 Savant SpeedVac 真空濃縮器 SPD210</td><td>Thermo Scientific</td><td>15906181</td><td>SpeedVac システムの一部、装備1.5 mlチューブ用ローター付き</td></tr><tr><td>PTFEシーリング付きグラスバイアル用スクリューキャップ、DN9</td><td>Dr. R. Forche Chromatographie</td><td>CT11B3011</td><td></td></tr><tr><td>Seasand</td><td>Roth</td><td>8441.3</td><td></td></tr><tr><td>ショートスレッドグラスバイアル1.5 mL、ND9</td><td>Dr. R. Forche クロマトグラフィー</td><td>VT1100309</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム (NaN3)</td><td>Roth</td><td>K305.1</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム (NaOH)</td><td>VWR</td><td>BDH7363-4</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>二塩基性ナトリウム(Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>80731-078</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 4.0 (Software)</td><td>Bruker-https://www.bruker.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&-NG-asymmetric dimethylarginine (ADMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-208093</td><td></td></tr><tr><td>&-NG-monomethylarginine (MMA)</td><td>サンタクルス</td><td>バイオテクノロジーsc-200739A</td><td></td></tr><tr><td>&-NG-NG'-対称ジメチルアルギニン(SDMA)</td><td>サンタクルーズ</td><td>バイオテクノロジーsc-202235A</td><td></td></tr></tbody></table>

核磁気共鳴分光法によるアルギニンメチロームの探索

Exploring the Arginine Methylome by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

タンパク質結合アルギニンは、多くのタンパク質で一般的にメチル化されており、物理化学的特性、他のタンパク質または核酸を含む他の分子との相互作用を変化させることによってそれらの機能を調節します。この研究は、不斉および対称ジメチルアルギニン(それぞれADMAおよびSDMA)およびモノメチルアルギニン(MMA)を含むアルギニンおよびその誘導体を定量するための容易に実装可能なプロトコルを提示する。生体の体液、組織、または細胞溶解物からのタンパク質単離に続いて、ホモジナイズ、タンパク質の沈殿、およびタンパク質加水分解の簡単な方法について説明します。加水分解物には、他のアミノ酸、脂質、核酸など、他の多くの成分が含まれているため、固相抽出(SPE)を使用した精製工程が不可欠です。SPEは、遠心分離機またはピペッティングロボットを使用して手動で実行できます。現在のプロトコルを使用したADMAの感度は約100 nmol / Lです。アルギニンの検出上限は、SPE飽和により3 mmol / Lです。要約すると、このプロトコルは、生物学的サンプル調製からNMRベースの検出に至るまでの堅牢な方法を説明しており、アルギニンメチロームを研究する際の研究を成功させるための貴重なヒントと落とし穴を提供します。

日常的に、2D J分解(JRES)の1H 1D投影は、事実上分離されたNMRスペクトルが、私たちの研究室36でのピーク割り当てと定量に使用されます。図3は、本SPEプロトコールを用いて精製された酵母タンパク質加水分解物の代表的なJRESスペクトルを示す。非常に異なる濃度ではありますが、両方の物質を細胞マトリックス中で分離および定量することができます。それぞれの化学シフトにおける特定のメチル基(-CH3)またはメチレン(-CH2-)基のプロトン数に基づいて、1H-NMR分光法は正確な定量を可能にします。プロトコル(ステップ0)で指摘されているように、アルギニンと比較したメチルアルギニン誘導体の相対定量は、主に生物学的プロセス、例えば、遺伝子のノックダウン/過剰発現、栄養素の変化、または阻害剤による治療などの調節に対する応答としてのアルギニンメチル化の変化を観察するのに十分である。
前述の<s...

本プロトコルは、1H-NMR分光法による遊離およびタンパク質結合アルギニンおよびメチルアルギニンの調製および定量的測定を記載している。

Protein-bound arginine is commonly methylated in many proteins and regulates their function by altering the physicochemical properties, their interaction ...

このプロトコルは、アルギニンメチル化のレベルおよび動態を定量化することを可能にする。この修飾は重要な調節的役割を果たし、疾患のバイオマーカーとして役立つ可能性がある。この方法の利点は、細胞、培地から組織、生体液に至るまで、ほぼ無制限の数のマトリックスに対してシンプルなワークフローを提供することです。アルギニンメチル化は多くのヒト癌で上昇しており、アルギニン法トランスフェラーゼの最初の阻害剤は臨床試験でテストされています。この方法は、患者の層別化とリスク評価に役立つ可能性があります。手順を実演するのは、私の研究室の研究技術者であるハンスヨルグ・ハビッシュです。液体サンプルの場合は、200マイクロリットルのサンプルに400マイクロリットルの氷冷メタノールを加え、摂氏マイナス20度で30分間インキュベートします。このサンプルを10, 000 Gで摂氏4度で30分間遠心分離します。上清を移動し、ペレットを1.5ミリリットルのチューブに集めます。固体材料の場合は、600〜30ミリグラムの組織または細胞ペレットを含むパルプ化チューブに66%メタノール水を加えます。軟組織を20秒間1回、硬組織を20秒間2回、間に5分間隔で均質化します。直ちにサンプルを氷の上に置き、すべてのライセートを新しい1.5ミリリットルのチューブに移し、続いてインキュベートします。次に、サンプルを10, 000 Gで30分間遠心分離します。摂氏4度で、1.5ミリリットルのチューブで上清を選択し、この上清を使用してタンパク質加水分解を進めます。各チューブのキャップを切り捨てます。次に、各サンプルに500マイクロリットルの9モルの塩酸を加えます。最後に、チューブをガラス管に入れます。キャップでしっかりと閉じて、適切な密閉を確保し、これらのチューブを部分的に砂で満たされたガラスビーカーに入れます。乾燥室で摂氏110度で16時間サンプルを加水分解します。サンプルを冷却し、高真空遠心分離機を使用して一晩凍結乾燥します。翌日、完全に乾燥したペレットを1ミリリットルの0.1モル塩酸に溶かします。各チューブに50マイクロリットルのクロロホルムを加え、1, 000マイクロリットルのピペットを使用してペレットを完全に溶解します。全容量を新しいチューブに移し、サンプルを10分間遠心分離します。二相性液体の上相を新しいチューブに慎重に集めます。手動にはプラスチックチューブを使用し、ロボット固相抽出にはガラスチューブを使用してください。手動固相抽出の場合は、すべての実行でカートリッジを事前に調整した後、1分間遠心分離します。その後、サンプルをSPEカートリッジにロードし、室温で600 Gで2分間遠心分離します。カートリッジを1ミリリットルの水で3回洗浄し、各洗浄に続いて1分間遠心分離します。その後、1ミリリットルの0.1モル

exploring-arginine-methylome-nuclear-magnetic-resonance

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

還元的に13C-メチル化N末端リジンのα-およびε-ジメチルアミン核磁気共鳴信号を割り当てるための2つの方法が説明されています。1つの方法は、還元的メチル化反応のpH誘導選択性を利用し、もう1つの方法はアミノペプチダーゼを使用してN末端リジンを選択的に除去します。...

還元的にメチル化されたタンパク質上の13C-ジメチルN末端アミンのNMR共鳴を同定する方法

タンパク質アルギニンメチル化酵素、すなわちクラスによって触媒。、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（PRMTs）は、タンパク質内のアルギニンのメチル基の酵素添加の過程である。 インビトロメチル化アッセイは、既知または新規のPRMT基質のメチル化状態を評価するための最も信頼できるツールである。...

タンパク質アルギニンメチル化を研究するためのin vitroでメチル化アッセイで

SPOT法で合成されたPeptideアレイは、Protein lysine...

SPOTペプチド配列を用いてタンパク質リジンメチルトランスフェラーゼの特異性の解析

DNAメチル化は、遺伝子発現の安定したレベルを維持するだけでなく、さまざまな刺激に応答して遺伝子発現の動的な変化を可能にすることができます。DNAメチル化における遺伝子特異的な変化と、これらの変化が遺伝子発現に及ぼす影響を研究することを可能にする技術について詳しく説明します。...

アストロサイトの発現および転写活性を有する遺伝子特異的DNAメチル化の変化の相関<em&gt; KCNJ10</em&gt;（Kir4.1）

このプロトコルは、示差的に同位体標識姉妹ヒストンを含むヌクレオソームの再構成を説明します。これと同時に、非対称的に翻訳後修飾ヌクレオソームはpremodifiedヒストンのコピーを使用した後に発生することができます。これらの製剤は、容易に高分解能NMR分光法を用いて、同時に両方の姉妹ヒストンに、修正クロストークのメカニズムを研究するために使用することができます。...

示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成

タンパク質アルギニン(R)-メチル化は、複数の生物学的経路を調節する広範な翻訳後修飾です。質量分析は、修飾ペプチド濃縮のための生化学的アプローチと組み合わせると、R-メチルプロテオームをグローバルにプロファイリングするための最良の技術です。ここでは、ヒト細胞における全体的なR-メチル化を高信頼で同定するために設計されたワークフローについて説明します。...

質量分析に基づくプロテオミクスアプローチによるグローバルで信頼性の高いタンパク質R-メチル化分析

これらのプロトコルは、細胞内のタンパク質アルギニンメチルトランスファーゼ(PRMT)ファミリーの個々のメンバーの酵素活性を評価するために使用される方法論を提供する。内因性および外因性バイオマーカー、メチルアルギニン認識抗体、および阻害剤ツール化合物を用いたPRMT活性評価に関する詳細なガイドラインが記載されている。...

タンパク質アルギニンメチルトランスレシーゼ1-9細胞内活性を研究する定量的方法

ここでは、溶液中のタンパク質-糖鎖相互作用の特性評価を目的とした一連のNMR実験の取得、処理、および分析を詳述したプロトコールを紹介します。最も一般的なリガンドベースおよびタンパク質ベースの方法論が概説されており、構造糖鎖生物学および分子認識研究の分野に貢献していることは間違いありません。...

糖鎖-タンパク質相互作用の解きほぐし:核磁気共鳴(NMR)による解決

ここでは、ドットブロットを用いて全体のm⁶Aレベルを半定量的に評価するプロトコルを提示します。全RNAは抽出され、変性され、ナイロン膜に斑点を検出し、抗m⁶A抗体でプローブされ、化学発光によって可視化されます。ImageJグレースケール解析で定量化された信号強度は相対的なメチル化存在比を反映し、研究のための再現性のあるワークフローを提供します。...

グローバルN6-メチルアデノシンRNA修飾レベル検出のためのドットブロットアッセイ

動的な核分極とその後のサンプル溶解により、生体システムにおける代謝のリアルタイム研究が可能になりました。過分極[1-13C]ピルビン酸は、in...

過分極 13 C代謝磁気共鳴分光法とイメージング

学ぶ アルギニンメチロームの定量法。核磁気共鳴分光法を用いて細胞や組織、バイオ流体など多様な生物学的試料中のアルギニン修飾レベルを測定し、がんなどの疾患バイオマーカーとしての可能性を評価する。

核磁気共鳴分光法によるアルギニンメチロームの探索

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