核磁気共鳴分光法によるアルギニンメチロームの探索
2021年12月16日
本プロトコルは、1H-NMR分光法による遊離およびタンパク質結合アルギニンおよびメチルアルギニンの調製および定量的測定を記載している。
このプロトコルは、アルギニンメチル化のレベルおよび動態を定量化することを可能にする。この修飾は重要な調節的役割を果たし、疾患のバイオマーカーとして役立つ可能性がある。この方法の利点は、細胞、培地から組織、生体液に至るまで、ほぼ無制限の数のマトリックスに対してシンプルなワークフローを提供することです。
アルギニンメチル化は多くのヒト癌で上昇しており、アルギニン法トランスフェラーゼの最初の阻害剤は臨床試験でテストされています。この方法は、患者の層別化とリスク評価に役立つ可能性があります。手順を実演するのは、私の研究室の研究技術者であるハンスヨルグ・ハビッシュです。
液体サンプルの場合は、200マイクロリットルのサンプルに400マイクロリットルの氷冷メタノールを加え、摂氏マイナス20度で30分間インキュベートします。このサンプルを10, 000 Gで摂氏4度で30分間遠心分離します。上清を移動し、ペレットを1.5ミリリットルのチューブに集めます。
固体材料の場合は、600〜30ミリグラムの組織または細胞ペレットを含むパルプ化チューブに66%メタノール水を加えます。軟組織を20秒間1回、硬組織を20秒間2回、間に5分間隔で均質化します。直ちにサンプルを氷の上に置き、すべてのライセートを新しい1.5ミリリットルのチューブに移し、続いてインキュベートします。
次に、サンプルを10, 000 Gで30分間遠心分離します。摂氏4度で、1.5ミリリットルのチューブで上清を選択し、この上清を使用してタンパク質加水分解を進めます。各チューブのキャップを切り捨てます。
次に、各サンプルに500マイクロリットルの9モルの塩酸を加えます。最後に、チューブをガラス管に入れます。キャップでしっかりと閉じて、適切な密閉を確保し、これらのチューブを部分的に砂で満たされたガラスビーカーに入れます。
乾燥室で摂氏110度で16時間サンプルを加水分解します。サンプルを冷却し、高真空遠心分離機を使用して一晩凍結乾燥します。翌日、完全に乾燥したペレットを1ミリリットルの0.1モル塩酸に溶かします。
各チューブに50マイクロリットルのクロロホルムを加え、1, 000マイクロリットルのピペットを使用してペレットを完全に溶解します。全容量を新しいチューブに移し、サンプルを10分間遠心分離します。二相性液体の上相を新しいチューブに慎重に集めます。
手動にはプラスチックチューブを使用し、ロボット固相抽出にはガラスチューブを使用してください。手動固相抽出の場合は、すべての実行でカートリッジを事前に調整した後、1分間遠心分離します。その後、サンプルをSPEカートリッジにロードし、室温で600 Gで2分間遠心分離します。
カートリッジを1ミリリットルの水で3回洗浄し、各洗浄に続いて1分間遠心分離します。その後、1ミリリットルの0.1モル塩酸で5回洗浄し、続いて室温で800Gで1分間遠心分離した。カートリッジを1ミリリットルのメタノールで2回洗浄した後、1分間遠心分離します。
アルギニンとその誘導体を1ミリリットルの3つのX置換溶液を加えて15ミリリットルのチューブに溶出し、1分間2回遠心分離します。ロボット固相抽出の場合、溶出液を採取するためのチューブと二相性液体の上相を含むガラスチューブをロボットのそれぞれの位置に配置します。手動 SPE で説明されているステップに基づいて、ソフトウェアでアプリケーションまたはメソッドを使用します。
サンプルを一晩凍結乾燥して完全に乾燥させ、アンモニアと水を取り除きます。各サンプルを500マイクロリットルのNMRバッファーに均一になるまで溶解します。次に、等量の均質なサンプルを各NMRチューブに移します。
SPEプロトコルを用いて精製した酵母タンパク質加水分解物のJ-RESスペクトルをここに示す。異なる特徴的な化学シフトは、L-アルギニンとADMAを3.25および3.02ppmで識別することができます。両方の物質は、細胞マトリックス中で分離および定量することができます。
それぞれの化学シフトにおける特定のメチル基またはメチレン基のプロトン数に基づいて、1つのH核磁気共鳴分光法は正確な定量を可能にする。このアプローチを用いると、SDMAとMMAの1H核磁気共鳴化学シフトを、SDMA2.76ppmとMMA2.74ppmの特徴的な化学シフトによって分離し定量することができます。このプロトコルを実行するときは、水溶性画分を含む二相性液体の上相をピペットで注意深く集め、それを新しいチューブに移します。
手動SPEには1.5ミリリットルのチューブを使用し、ロボットSPEにはクラスガラスを使用してください。クロロホルムとその内容物をこぼさないでください。アルギニンおよびメチル化アルギニン種を含む溶出液は、NMR分光法を用いて分析される。
これにより、これらの種の絶対量が得られます。現在、アルギニンメチル化の病態生理学的役割の解明を目指す多くの基礎研究プロジェクトで使用されています。さらに、タンパク質アルギニンメチル化をいくつかのヒト疾患におけるバイオマーカー候補として評価しています。
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概要
本プロトコルでは、さまざまな調節プロセスにおいて重要であり、疾患のバイオマーカーとしても活用され得るアルギニンメチル化レベルの定量化を可能にします。この手法は汎用性が高く、細胞、培地、組織、生体試料などの幅広い生物学的マトリックスに適用可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生化学
- 臨床研究
背景
- アルギニンメチル化は、細胞プロセスにおいて重要な調節的役割を果たしています。
- この修飾は、多くのヒト癌において上昇しています。
- アルギニンメチルトランスフェラーゼ阻害剤が、現在臨床試験で検証されています。
- アルギニンメチル化を定量化することで、患者の層別化およびリスク評価に寄与することが期待されます。
研究目的
- 遊離およびタンパク質結合型のアルギニンおよびメチルアルギニンを測定するための信頼性の高い手法を提供すること。
- さまざまな生物学的文脈におけるアルギニンメチル化のダイナミクスを探索すること。
- 疾患のバイオマーカーとしてのアルギニンメチル化の可能性を評価すること。
使用方法
- 生物学的試料の調製
- 1H-NMR分光法を用いた定量測定。
- 細胞や生体試料を含む、異なるマトリックスへの適用。
- 研究技術員による手順のデモンストレーション。
主要な結果
- 本プロトコルにより、アルギニンメチル化レベルを正確に定量化できる。
- 多様な生物学的試料への適用可能性が実証されている。
- がん研究および患者評価への応用の可能性がある。
- シンプルなワークフローにより、研究者の利便性が向上している。
結論
- この手法は、アルギニンメチル化を研究するための簡便なアプローチを提供します。
- がんやその他の疾患の研究を前進させる可能性を秘めています。
- 今後の応用により、より適切な患者層別化を通じて臨床転帰が改善されることが期待されます。
よくある質問
産業界における重要性
アルギニンメチル化ダイナミクスの定量化は、腫瘍学におけるターゲットバリデーションおよびバイオマーカー探索プログラムを支援します。このNMRベースの手法により、多様な生物学的マトリックスにおけるADMA、SDMA、MMA、およびアルギニンの精密な測定が可能となり、治療仮説検証のためのメカニズム的なリスク低減が提供されます。このワークフローは、翻訳後修飾レベルを疾患状態や薬物反応に結びつけることで、初期探索における予測の信頼性を向上させます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的活用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：タンパク質機能およびシグナル伝達経路における調節メカニズムとして、アルギニンメチル化の解析を可能にする。
- 運用上の価値：複雑な生物学的サンプル中のメチルアルギニン種の定量化のための、堅牢なワークフローを提供する。
- 科学的価値：メチル化レベルをがんの表現型および治療反応性と相関させることで、生物学的なリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： アルギニンおよびその誘導体の定量的なNMR読み取り値を生成し、アッセイの標準化を可能にする。
- 運用の価値： 妨害物質を除去するためのSPE精製ステップを含んでおり、細胞マトリックスにおける再現性のある検出を保証する。
- 運用の価値： 手動およびロボットSPEプラットフォームの両方に対応しており、スケーラブルなサンプル処理が可能である。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値： 疾患に関連するシステムにおけるアルギニンメチル化のダイナミクスを測定することで、バイオマーカーの評価を促進します。
- 運用的価値： 前臨床モデルおよび患者サンプルにおけるメチル化変化の経時的なモニタリングを可能にします。
- 戦略的価値： 患者層別化のためのバイオマーカーデータを提供し、リスク調整後の開発推進に関する意思決定を支援します。
パイプラインおよびワークフローへの統合
この手法は、ターゲットバリデーションからバイオマーカーの適格性確認に至るディスカバリー・コンティニュアムに適合しており、各段階におけるデータに基づいた意思決定を可能にします。
- 探索生物学：遺伝学的または薬理学的な摂動に応答したアルギニンメチル化を定量化することにより、仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：SPE精製およびNMR分析後、メチルアルギニン種の定量的なアッセイ可能データを提供します。
- 分析：1H-NMR化学シフト積分による絶対定量を行い、条件間の比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：疾患モデルにおけるバイオマーカー測定を通じて、探索的な知見を前臨床での継続性に結びつけます。
- エンタープライズ再利用：複数のプロジェクトや治療領域にわたるアルギニンメチローム分析のための、再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：翻訳後修飾状態の直接測定による、ターゲット検証における予測信頼性の向上。
- 運用的価値：SPEクリーンアップおよびNMRベースの検出による、標準化と再現性の確保。
- 戦略的価値：アルギニンメチル化レベルを疾患メカニズムおよび薬剤感受性と結びつけることによる、go/no-go判断の改善。
- ポートフォリオへの影響：メチル化プロファイリングによるバイオマーカー根拠に基づいた、リスク調整後のターゲット優先順位付け。
実施上の検討事項
- タンパク質の加水分解、SPE（固相抽出）技術、およびNMR分光法の操作に関する専門知識が必要です。
- 高磁場NMR分光計およびSPE装置（手動またはロボット式）へのアクセスが必須となります。
- 試料調製およびデータ解析プロトコルのチーム間での標準化が求められます。
- 加水分解および抽出において、異なる試料タイプ（細胞、組織、生物学的流体）に応じた適応上の検討事項が含まれます。
- 高濃度のアルギニン（3 mmol/L）におけるSPEの飽和や、感度閾値（ADMAの場合、約100 nmol/L）などの実用的な制限事項があります。
