Name: トリパノソマチド感染を研究するための化学地図作成アプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 学ぶ トリパノソマチド感染時の代謝物分布を3Dモデル化する手法。組織サンプリング、LCMS抽出、SketchUpとMeshLabによる可視化を含み、5,500以上の代謝物特徴をマッピングし、病原体負荷との相関を解析する。

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Laura-Isobel McCall博士は、Burroughs Wellcome FundからInvestigators in the Pathogenesis of Infectious Disease Awardを受賞しています。著者らはさらに、NIH賞番号R21AI148886、NIH賞番号P20GM103648のオクラホマ呼吸器感染症センター(OCRID)からのパイロット助成金、およびオクラホマ大学からのスタートアップ資金(LIMへの支援)に感謝したいと考えている。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも資金提供者の公式見解を表すものではありません。著者はまた、このプロトコルで使用されるツールの開発者に感謝したいと思います。該当する場合は、関連するすべての出版物が引用されています。

報告する利益相反はありません。

トリパノソマチド感染症を理解することは、新規医薬品の開発および治療アプローチを導くために不可欠である。この化学地図作成法は、代謝とトリパノソマチド病因との関係に関する実用的な洞察を提供し、この翻訳ニーズに対処する独自の態勢を整えています。
バックグラウンド汚染を軽減するために、代謝産物抽出およびMS分析中にLC-MSグレードの溶媒のみが推奨されます。一般にパラフィンフィルムおよび/または他のプラスチックに由来するポリマー汚染3536、37、38は、可能な限り避けなければならない。特にパラフィルムは絶対に使用しないでください。LC-MSデータの品質は、サンプル調製および代謝産物抽出に使用される材料に依存するため、これらの側面は非常に重要です。データ品質は、'iliプロットを生成する前に保証する必要があります。さらに、これらの包括的な空間メタボロミクスマップを生成するには、これらのマップのギャップを避けるために、隣接するすべての組織サンプルの収集と、収集されたすべてのサンプルからの代謝産物抽出が必要です。したがって、収集手順、代謝産物抽出およびLC-MS分析のロジスティクス、およびコストを考慮し、それに応じて計画する必要があります。
このプロトコルは、複数の方法でユーザーのニーズを満たすように変更できます。例えば、代謝産物抽出時に使用される溶媒の極性と溶解度は、検出される代謝産物に影響します39。標的としない化学地図作成分析で検出された代謝産物の特徴の多様性を最大限に高めるには、複数の抽出ステップと溶媒を組み合わせることをお勧めします。例えば、ジクロロメタン、メタノール、水を抽出溶媒として利用するのは、非極性分子や極性分子の正確な検出が可能だからです20,40。しかし、これらの溶媒はすべてのMS実験に普遍的に適しているわけではなく、研究者はプロジェクトの目標に基づいて抽出溶媒を選択する必要があります。同様に、逆相クロマトグラフィーを順相クロマトグラフィーに置き換えるなど、異なる LC-MS/MS 条件を使用できます。代替カラムは、C8 クロマトグラフィーの代わりに逆相データ収集にも使用できますが、経験的には、C8 クロマトグラフィーは組織脂質に対してより堅牢であり、目詰まり頻度が低くなります。概念的には、これらのプロトコルは、ガスクロマトグラフィー−質量分析などの他の質量分析方法にも適用することができる。
別のアプローチは、質量分析イメージングである。実際、質量分析イメージングアプローチとは異なり、液体クロマトグラフィー-質量分析は本質的に空間情報を保存しません10。化学地図作成は、プロジェクトの概念化時、サンプルメタデータ、およびデータ処理ステップでサンプリング場所を含めることによって、このギャップを埋めます。この化学地図作成アプローチの強みは、質量分析イメージングとは異なり、アプリケーションの大部分が注釈のためだけに正確な質量に依存する質量分析イメージングとは異なり、信頼性の高い注釈(Metabolomics Standards Initiativeレベル1またはレベル2の注釈信頼度41)を提供できることです。質量分析イメージングは、時には単一細胞レベル(例えば、42,43)まで、きめ細かい空間マッピングを可能にする。対照的に、化学地図作成アプローチは、高度に専門化された全動物凍結切断スキルを必要とせずに、代謝産物分布の大規模な臓器間マッピングを可能にする。化学地図作成は、開発中の多くの空間トランスクリプトームアプローチ(例えば、44)に補完的な証拠を提供し、「表現型に最も近いオミクス層」に焦点を当てるという利点がある45。寄生虫負荷定量の代替方法には、試料採取時の生物発光の測定6が含まれる。微細なセグメントを収集して、共焦点または電子顕微鏡で局所的な寄生虫の負担と組織損傷を評価することもできます。このプロトコールおよび先行刊行物13でサイトカイン定量に使用される水ホモジネートは、組織損傷のタンパク質ベースのマーカーを定量するためにも使用することができる。
また、得られたLC-MSデータをプロットするのに適した3Dモデルを取得するには、複数の方法があります。ここで提案されている方法に加えて、モデルはさまざまなオンラインベンダーから事前に購入できます。利用規約が意図した使用法と一致していることを確認してください (特に公開に関する)。大型臓器のモデルは、スキャナの指示に従って3Dスキャナを使用してde novoを生成することができます。化学地図作成用の3Dモデルを生成および視覚化するためのMATLABなどの代替手段は存在しますが46、それらは主に'ili16の開発前に実装されていました。MATLABは、多くの分野にわたる多種多様なアプリケーションを提供するデータ分析およびプログラミングツールスイートです。ただし、MATLAB はフリーでもオープンソースでもなく、特に MATLAB が質量分析データを処理するために開発されていないことを考慮すると、MATLAB インターフェイスに精通している必要があります。この提案された方法の代替案、すなわち、SketchUp、Meshlab、および'iliは、自由にアクセスでき、ユーザーフレンドリーであり、化学地図作成の目的でMATLABと同様の機能を提供する。
この方法は、サンプル調製および代謝産物抽出に関して堅牢である。トラブルシューティングは、ほとんどの場合、LC-MSデータ集録ステップで必要です。これはこの記事の範囲外です。読者は、LC-MSデータ収集のトラブルシューティングに関する優れた出版物(20,47を含む)に導かれます。同様に、代謝産物アノテーションの複雑さは、3Dモデル生成に焦点を当てたこの方法の範囲を超えています。このトピックに関する有用な参考文献には、24,25,48,49が含まれます。
この方法は疾患の病因を効果的に探求するが、このアプローチには限界があり、その一部はあらゆるメタボロミクス実験に共通している。そのような制限の1つは、LC-MS機能50のアノテーション率が低いことであり、これは参照スペクトルライブラリの可用性と品質に左右されます。さらなる制限は、RNAlaterなどのRNA保存試薬とLC-MS/MS分析との不適合性のために、このプロトコルがmRNAを保存しないことです。しかし、タンパク質の品質は下流の分析には十分であり、したがってmRNAベースの分析を置き換えることができます。
感染の病因に対する化学地図作成アプローチは、細菌性、ウイルス性、または寄生虫性感染症が臓器系でどのように発症し、限局性疾患を引き起こすかを直接反映します。これらの地域サブサンプルを分析し、3Dモデルを生成することで、最終的に代謝産物が3次元空間にわたってどのように機能するかがわかり、分子生物学のこれまで認識されていなかったこれらの空間次元に光が当てられます。このプロトコールを用いて、例えば、代謝産物局在化を、トリパノソーマ・クルジ寄生虫負荷と比較した。その結果、病原体と宿主組織との関係が明らかになり、シャーガス病症状の進行の代謝ダイナミクスも実証されました6。化学地図作成法は、人間が構築した環境相互作用51,52,53、人間の皮膚や肺54などの臓器系の化学的構成44、植物の代謝と環境相互作用55など、さまざまなトピックにも適用されています。将来の応用には、局所的な疾患耐性および回復力、またはトリパノソマチド感染を超えたモデルにおける局所代謝産物レベル、病原体指向性、および疾患指向性の関係を評価することが含まれる可能性がある。このアプローチはまた、現在の薬物動態プロトコルを拡大し、局所組織薬物レベルと薬物代謝と全体的な代謝状況、組織損傷、および病原体クリアランスとの関係を評価するために、幅広い適用性を有するべきである。全体として、化学地図作成は、疾患の病因、ヒトの健康、ヒトと環境の相互作用、および微生物の動態を含むアプリケーションを使用して、様々なサンプルタイプにおける代謝産物分布のユニークな探査を可能にする。

トリパノソマチド寄生虫は、リーシュマニア種、アフリカトリパノソーマ(トリパノソーマブルーセイ)、およびアメリカのトリパノソーマ(トリパノソーマクルジ)からなる。リーシュマニア原生動物は、自己治癒と自己限定的な局所的な皮膚リーシュマニア症、口、鼻、喉の粘膜組織が損傷する皮膚粘膜リーシュマニア症、発熱や肝脾腫を引き起こす内臓器官への寄生虫指向性を伴う内臓リーシュマニア症1,2が含まれます。T. bruceiは、主にアフリカ諸国で報告されている睡眠病としても知られるヒトアフリカトリパノソーマ症(HAT)を引き起こします3。臨床徴候および症状には、肝脾腫、発熱、頭痛、筋骨格痛、リンパ節症、および寄生虫が血流およびリンパ管に局在する血液リンパ段階における貧血が含まれる。これに続いて髄膜脳炎期が続き、寄生虫は中枢神経系に局在し、睡眠障害、行動変化、そして最終的には致命的な昏睡を引き起こします4。T. cruziは、アメリカ大陸に固有のシャーガス病を引き起こします。感染した個体は、初期の急性期、通常は無症候性、広範な寄生虫指向性を経験する。感染者の約10%〜30%は、巨食道、巨結腸、および心血管合併症を特徴とする数十年の感染後に慢性期の症状を経験する5,6。
メタボロミクスは、一次または二次代謝由来の生物学的化合物および薬物または食品由来分子などの外部由来化合物を含む小分子種(50〜1,500Da)を研究する。宿主-病原体相互作用の文脈において、メタボロミクスは、宿主に対する病原体の影響にアクセスする上で極めて重要な宿主代謝産物環境に対する感染の影響を探求することができる。また、宿主の栄養学的および免疫学的環境への病原体の適応を評価することもできる7,8,9。質量分析(MS)および核磁気共鳴(NMR)分光法は、代謝産物の同定、定量、および特性評価に使用される一般的なメタボロミクスツールです。この「オミックス」アプローチは、バイオマーカーの発見や医薬品開発にも適用できます10,11。
トリパノソマチド寄生虫の特定の組織指向性を考えると、空間メタボロミクス分析は、それらが引き起こす疾患の病因に関する重要な洞察を可能にすることができる。代謝産物の空間分布をマッピングすると、マウス心臓組織における慢性トリパノソーマ・クルジ感染およびマウス胃腸管における急性および長期のトリパノソーマ・クルジ感染によって局所的に影響を受ける代謝産物が明らかになった6,12,13。 具体的には、3D化学地図作成は、慢性的にトリパノソーマクルジ感染マウスの心臓組織における寄生虫の持続性と代謝変化との間の切断を実証した。代謝は心臓の下部および頂端セグメントで最も乱れ、シャーガス病症状(心臓頂端動脈瘤)の部位と一致した。特定の心臓部位での感染によって摂動され、疾患の重症度に相関する代謝産物ファミリーには、アシルカルニチンおよびグリセロホスホコリンが含まれる12,13,14。胃腸管では、持続的な代謝変化がシャーガス病症状の部位(食道および結腸)と一致した。対照的に、代謝は、小腸などのシャーガス病症状に関連しない部位で再正規化される。胃腸管における感染によって局所的に摂動される代謝産物には、アシルカルニチン、グリセロホスホコリン、キヌレニン、トリプトファン、およびコール酸が含まれる。さらに、これらの解析により、シャーガス病に対する耐性の新しい代謝機構の同定が可能になりました6。これらの方法を皮膚リーシュマニア症の研究に適用すると、病変部位における有意な代謝摂動が明らかになったが、病変に隣接する巨視的に健康な組織における特異的代謝変化も明らかになった。例えば、グルタミンは病変部位で枯渇したが、m/z(質量電荷比)200-299、400-499、500-599、および600-699のグリセロホスホコリンは病変部位で有意に増加した。PC(O-34:1)は病変隣接部位でのみ増加した15。
この原稿の目的は、トリパノソマチド寄生虫感染モデル(図1)に適用される代謝産物分布の3Dモデル(「化学地図作成」)を生成するために必要なステップを実証することです。このアプローチは、メタボロミクスとメタボロミクスのデータ処理、特にメタボロミクスデータを3Dモデルに簡単にプロットするための「iliソフトウェア」の開発におけるいくつかの重要な進歩に基づいています16。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Eppendorf チューブ</td><td>NA</td><td></td><td>NA 任意のブランド、利用可能な</td></tr><tr><td>1 L ボトル、pyrex</td><td>NA</td><td></td><td>任意のブランド、利用可能な</td></tr><tr><td>1 L メスシリンダー、pyrex</td><td>NA</td><td></td><td>任意のブランド、利用可能な</td></tr><tr><td>2 mL SafeLock Eppendorf チューブ</td><td>VWR</td><td>20901-540</td><td>利用可能な組織ホモジナイザー</td></tr><tr><td>に適したチューブモデルを使用します3Dモデル(プロトコルの手順に従って生成した、または購入した)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>調査中のシステムに応じて</td></tr>5 <tr><td>mmステンレス鋼ビーズ</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>フィッシャー</td><td>3252449</td><td></td></tr><tr><td>AATTCCTCCAAGCAGCGGATAプライマーNA</td><td></td><td></td> <td>NA利用可能な任意のブランド。Piron、M.他に掲載されました。血液サンプル中の Trypanosoma cruzi 検出のためのリアルタイムPCRアッセイの開発。アクタトロピカ。103 (3), 195&ndash;200(2007年)。</td></tr><tr><td>分析天びん</td><td></td><td></td>NA <td>NA 任意のブランド、利用可能な</td>ASTCGGCTGATCGTTTTCGA</tr><tr><td>プライマーNA</td><td></td><td></td><td>NA任意のブランド、利用可能なものとして; Piron, M. et al. 血液サンプル中の Trypanosoma cruzi 検出のためのリアルタイムPCRアッセイの開発。アクタトロピカ。103 (3), 195&ndash;200(2007年)。</td></tr><tr><td>卓上型遠心分離機、マイクロ遠心分離機、ファルコンチューブ、96ウェルプレート容量</td><td>NA</td><td>NA</td>任意の<td>ブランド、利用可能な</td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット</td><td>NA</td><td>NA</td><td>クラスII、タイプA2;任意のブランド、利用可能な</td></tr><tr><td>CAGCAAGCATCTATGCACTTAG<br/BR/> ACCCCプライマーNA</td><td></td><td>NA</td>任意の<td>ブランド、利用可能なものとして;Cummings、K.L.、Tarleton、RLで公開されました。Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue byリアルタイムPCR。分子および生化学的寄生虫学。129 (1), 53&ndash;59 (2003).</td></tr><tr><td>カメラ</td><td>NA</td><td>NA</td><td>利用可能な任意のブランド。携帯電話のカメラは、このプロトコルの</td></tr><tr><td>化学発光対応イメージングシステム</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意のシステム、利用可能な</td></tr><tr><td>綿球</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意のブランドとして、利用可能な</td></tr><tr><td>凍結手袋</td><td>VWR</td><td>97008-208</td>として<td>任意のブランドと交換</td></tr>するのに適しています 利用可能な<tr><td>解剖はさみ</td><td>NA</td><td></td><td>NA任意のブランドとして、利用可能な</td></tr><tr><td>ドライアイス</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意のブランド、利用可能な</td></tr><tr><td>余分な長さの鉗子</td><td>NA</td><td></td><td>NA任意のブランド、利用可能な</td></tr><tr><td>可燃性グレードの冷蔵庫</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意のブランド、</td></tr><tr><td>利用可能なマイクロ遠心チューブ用の冷凍庫収納ボックス</td>NA <td></td><td>NA</td><td>任意のブランド、利用可能な</td></tr><tr><td>ヒュームフード</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意のブランドとして、利用可能な</td></tr><tr><td>高解像度質量として分光計</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意のブランド、サーモフィッシャーQ-Exactive Plus(カタログ番号0726030)</td></tr><tr><td>アイスバケツ</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意のブランド、利用可能な</td></tr><tr><td>iliソフトウェア</td><td>ili.embl.de</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>大型タッパーウェア</td><td>NA</td><td></td><td>NA任意のブランドとして、利用可能として、快適に収納するのに十分な大きさマウス、コットンボール</td></tr><tr><td>LC-MS グレードアセトニトリル</td><td>フィッシャーオプティマ</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS グレード ジクロロメタン</td><td>フィッシャーオプティマ</td><td>D151-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS グレードギ酸</td><td>フィッシャーオプティマ</td><td>A11750</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS グレードメタノール</td><td>フィッシャーオプティマ</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS グレード水</td><td>フィッシャーオプティマ</td><td>W64</td><td></td></tr><tr><td>液体クロマトグラフィーカラム</td><td>Phenomenex</td><td>00B-4499-AN</td><td>は、関心のある代謝物に応じて他のブランドやモデルに変更することができます</td></tr><tr><td>液体クロマトグラフィーカラムガードカートリッジ</td><td>Phenomenex</td><td>AJ0-8784</td><td>は、関心のある代謝物に応じて他のブランドやモデルに変更することができます</td></tr><tr><td>液体クロマトグラフィーカラムガードカートリッジ</td><td>ホルダーPhenomenex</td><td>AJ0-9000</td><td>関心のある代謝物のために他のブランドやモデルに変更することができます</td></tr><tr><td>液体窒素</td><td>NA</td><td></td><td>利用可能な</td></tr><tr><td>ルシフェリン</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>MeshLabソフトウェア</td><td></td> <td>https://www.meshlab.net/ NA</td><td></td></tr><tr><td>Meshmixerソフトウェア</td><td>https://www.meshmixer.com/</td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MS校正NA</td><td></td><td>NA</td><td>利用可能な機器に適したもの</td></tr><tr><td>MS データ処理ソフトウェア</td><td>NA</td><td></td><td>NA 複数のオプションが利用可能; 著者は MZmine</td></tr><tr><td>MSConvert ソフトウェア</td><td>を推奨</td>します <td>http://proteowizard.sourceforge.net/ NA</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-ONE-W</td><td>他の nanodrop モデルも適しています</td></tr><tr><td>p1000 ピペットチップ</td><td>NA</td><td>NA</td><td>利用可能なピペ</td></tr><tr><td>ッターp1000ピペットNA</td><td></td><td>NA</td><td>任意のブランド</td></tr>に合うように適切なブランドを使用してください、利用可能な<tr><td>p20ピペットのヒント</td><td>NA</td><td>NA</td>は<td>、利用可能なピペットp20</td></tr>ピペットNA NAとして、利用可能なピペッターp200ピ<tr><td>ペットNA</td><td></td><td></td>任意のブランドに合うように適切なブランド<td>を使用してください利用可能なピペット</td>ピット</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200に合うようにピペットNA</td><td></td><td>NA</td><td>任意のブランド、利用可能な</td></tr><tr><td>個人用保護具(手袋、白衣、安全メガネ/ゴーグル、フェイスシールド)</td><td>NA</td><td></td> NA<td>任意のブランド、利用可能な</td></tr><tr><td>Q-Plexマウスサイトカイン-スクリーン(16-Plex)</td><td>Quansys biosciences</td><td>110949MS</td>は、<td>他の市販サイトカインELISAキット</td></tr><tr><td>Quick-DNA Miniprep Plusキット(200プレップ)などの他のタンパク質ベースのサイトカインアッセイに置き換えることができます</td><td>Zymo</td><td>D4069</td>は、利用可能な塩シェーカーまたは茶注入器NA NA任意のブランドとして、利用可能なリアルタイムサーモサイクラーNA NA任意のブランド<td>として、哺乳類のDNA抽出キットの任意のブランドと交換</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>します<tr><td></td><td></td><td></td><td>。イソフルラン浸漬綿球を含み、マウスの皮膚</td></tr><tr><td>SketchUpソフトウェア</td><td>https://www.sketchup.com/</td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>標本との接触を防ぐために鉗子</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意のブランド</td></tr>、<tr><td>利用可能なspeedvacとマイクロ遠心チューブと96ウェルプレート容量</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意のブランド、利用可能な</td></tr><tr><td>スプレッドシートソフトウェア</td><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td><td>NA</td>は、適用可能なスルファクロロピリダジンシグマS9882-100G<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>として、他のスプレッドシート管理ソフトウェアに置き換えることができます</tr><tr><td>スルファジメトキシン</td><td>Sigma</td><td>S7007-10G</td><td></td></tr><tr><td>Sybr green qPCR reaction mix</td><td>Fisher</td><td>A25780</td><td>は、必要に応じて他の Sybr green qPCR 反応ミックスと交換できます</td></tr>。必要に応じて、<tr><td>TCCCTCTCATCAGTTCTAT GGCCCA プライマー</td><td>NA</td><td>任意の</td><td>ブランド、利用可能な場合; Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR ly-time PCR.分子および生化学的寄生虫学。129 (1), 53&ndash;59 (2003).</td></tr><tr><td>組織ホモジナイ</td><td>ザーNA</td><td></td><td>NA利用可能な任意のブランド;例えば、Qiagen TissueLyser II、カタログ番号85300、TissueLyserアダプターセット(2 x 24)、カタログ番号69982</td></tr>組織<tr><td>サンプル</td><td>NA</td><td></td> NA<td>から適切な感染モデル</td></tr><tr><td>TissueLyserシングルビーズディスペンサーQiagen</td><td></td><td>69965</td><td></td></tr><tr><td>UHPLC</td><td>NA</td><td>NA</td><td>ThermoFisher Vanquish(カタログ番号IQLAAAGABHFAPUMBHV)</td></tr><tr><td>超低温冷凍庫(-80)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意のブランド、利用可能な</td></tr><tr><td>超音波バス</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意のシステム、利用可能な</td></tr><tr><td>ウェットアイス</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意のブランド、利用可能な</td></tr><tr><td>ゾーンフリーシーリングフィルム</td><td>VWR</td><td>&nbsp;490007から390</td><td></td></tr></tbody></table>

トリパノソマチド感染を研究するための化学地図作成アプローチ

Chemical Cartography Approaches to Study Trypanosomatid Infection

病原体指向性および疾患指向性は、病原体によって選択的にコロニー形成または損傷を受けた組織位置を指し、局在性疾患症状をもたらす。ヒト感染性トリパノソマチド寄生虫には、シャーガス病の原因物質である トリパノソーマクルジ が含まれる。 トリパノソーマブルーセイ、 睡眠病の原因物質;リーシュマニア種、リー シュマニア 症の原因物質。共同で、彼らは世界中の2000万人に影響を与えます。これらの寄生虫は、心臓、食道、 T. cruzi の結腸、脂肪組織、膵臓、皮膚、 T. brucei の循環系および中枢神経系、皮膚指向性 リーシュマニア 株の皮膚、および内視向性 リーシュマニア 株の肝臓、脾臓、骨髄。したがって、トリパノソマチド病の病因を理解するためには、空間的視点が不可欠です。化学地図作成は、微生物学的および免疫学的パラメータと比較して、液体クロマトグラフィー - 質量分析 によって 生成された小分子の存在量の3D視覚化を生成する。このプロトコルは、体系的な組織サンプリングと代謝産物抽出から始まり、液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析データ取得、代謝産物分布の3Dマップの生成に続いて、トリパノソマチド感染中の病原性プロセスを研究するために化学地図作成をどのように適用できるかを示しています。この方法は、 T. cruzi、T. brucei 、または Leishmania による組織コロニー形成のための栄養所要量、感染部位での免疫代謝、局所組織代謝摂動と臨床疾患症状との関係など、複数の研究課題に使用でき、トリパノソーマチド病の病因を包括的に把握することができます。

得られる代謝産物特徴の数は、分析された組織タイプおよびデータ処理パラメータに依存する。例えば、このプロトコルは、T. cruzi感染のマウスモデルにおける胃腸管代謝物に対するT. cruzi感染の空間的影響を分析するために使用されている。 以前の研究では、雄のC3H/HeJに1,000 CL + luc T. cruzi寄生虫を腹腔内に注射した32,6。動物を感染後12または89日目に安楽死させ、胃腸管の13の連続したセグメントの化学地図作成分析を、このプロトコールに記載されるように実施した。この分析により、5,502 個のフィーチャのフィーチャ テーブルが作成され、このプロトコルで説明されている手順を使用して 3D に視覚化されました。このアプローチにより、寄生虫負荷の高い部位(キヌレニン、図2B対寄生虫負荷、図2A)、組織領域間で分布が異なる代謝産物(グルタミン、図2C)、および小腸および大腸で同等のレベルで見られる代謝産物の特徴(LPE 16:0 図2D)の個々の動物の代謝産物の特徴を視覚化することができます。 ).キヌレニンが可視化のために選択されたのは、炎症との既知の関係およびキヌレニン由来代謝産物がT. cruzi負荷を調節する能力に関する以前の出版物のためである33。ランダムフォレストベースの機械学習モデルは、キヌレニンレベルと感染状態との関連を以前に明らかにしていました6。グルタミンは、インビトロでのグルタミン利用能とT. cruzi薬物感受性との関係を実証する以前の出版物に基づく可視化のために選択された34。微分分布はロジスティック回帰を用いて確認し、p&lt;0.05とした。LPE 16:0は、組織部位全体で同等のレベルで見出された代謝産物の特徴を発見するために、データの目視検査の後に選択された。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63255/63255fig01.jpg"> 図1:プロトコルの概要 イラストは BioRender.com で作成されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63255/63255fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63255/63255fig02.jpg"> 図2:化学地図作成分析 雄のC3H/HeJマウスに、1,000個のCL+luc T. cruzi 寄生虫を腹腔内に注射した32。動物を感染後12または89日目に安楽死させ、胃腸管を採取し、体系的に切片化した(ステップ1)6。ステップ2のように代謝産物を抽出し、LC-MS/MSで解析し.3D SketchUpソフトウェアを用いてモデル生成を行い(ステップ5)、ステップ6と同様にデータを3Dでプロットした。(a)特定のマウスにおける寄生虫分布、感染後12日目。(b)同じマウスにおけるキヌレニン代謝産物分布、感染後12日目。(c)感染マウス全体にわたる平均グルタミン分布、感染後89日目。(D) 2-ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(LPE 16:0)と注釈が付けられた m/z 454.292保持時間2.929分の同等のレベルを、小腸および結腸のAおよびBと同じマウスで投与した。サンプルおよびデータは6で生成された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63255/63255fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、サンプル収集、代謝産物抽出、液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析データ取得の概要、3Dモデル生成、および最後にデータ視覚化を含む、トリパノソマチド感染中の代謝産物分布の3Dモデルを生成する手順を説明する。

Pathogen tropism and disease tropism refer to the tissue locations selectively colonized or damaged by pathogens, leading to localized disease symptoms. ...

このプロトコルは、代謝産物および寄生虫分布の3Dモデルを構築するために使用することができる。これは、局所組織代謝摂動、寄生虫分布、および臨床疾患症状との関係を理解するのに役立ちます。この方法の主な利点は、代謝産物分布対病原体分布のライブスケール臓器間マッピングとその統計分析を可能にすることです。理論的には、化学地図作成は、病因および治療の効果に関与する代謝産物を直接調べることによって、疾患の発症および宿主への影響を探求することができる。チューブの重量を量り、ラベルを付けることから始めます。チューブごとに1つのセクションで組織を体系的に切断する。組織サンプルを含むチューブを計量してサンプル重量を決定し、重量を記録します。組織サンプルの水ベースの均質化を行うには、組織サンプルを含む2ミリリットルの微量遠心管に1つの5ミリメートルのステンレス鋼ビーズを加える。LCMSグレードの水を入れたブランクチューブを1本作ります。冷却したLCMSグレードの水を加えて、サンプルの50ミリグラムあたり500マイクロリットルまでの容量を作り、25ヘルツで3分間サンプルを均質化します。サンプルは完全に均質化する必要があります。ホモジナイズ量の1/10をDNA抽出やその他の分析のために収集します。4マイクロモルのスルファクロロピリダジンでスパイクした氷冷LCMSグレードのメタノールをホモジネートに加える。サンプルを組織ホモジナイザーで25ヘルツで3分間ホモジナイズし、続いて10分間遠心分離を行った。等量の上清を96ウェルプレートに集め、上清を回収しながら固体残渣を氷上に保持する。水性抽出上清を最高速度および加熱なしで完全に乾燥させる。固体残渣サンプルの50ミリグラム当たり2マイクロモルのスルファクロロピリダジンでスパイクしたメタノールに1,000マイクロリットルの予め冷却されたジクロロメタンを加えることによって有機抽出を行う。サンプルを25ヘルツで5分間ホモジナイズし、続いて10分間遠心分離を行った。等量の上清を96ウェルプレートに集める。目的の臓器の写真を撮ります。[ファイル] をクリックし、SketchUp ソフトウェアで [インポート] をクリックして、目的の臓器の画像をインポートします。線ツールをクリックし、フリーハンドオプションを選択します。鉛筆ツールを使用して、目的の臓器の輪郭をトレースして描画します。プッシュ/プルツールを選択し、シェーディングされた領域をプルアップして、図面を2Dから3Dに変換します。ファイルをdae形式でエクスポートするには、[ファイルのエクスポート]をクリックし、[3Dモデル]をクリックします。モデルのリアリズムを向上させるには、[ファイル] を選択し、[メッシュのインポート] をクリックして、モデルを MeshLab ソフトウェアにインポートします。トップメニューの「ワイヤフレーム」(Wireframe) を選択し、「フィルタ」(Remeshing Simplification and Reconstruct) をクリックしてから、「サブディビジョンサーフェス中点」(SubDivision Surfaces Midpoint) をクリックします。すべての値をデフォルトのままにし、[適用] を 2 回選択します。モデルをSDL形式でエクスポートするには、[ファイル]、[メッシュのエクスポート方法]の順にクリックし、[ファイルの種類]ドロップダウンメニューで[SDLファイル形式]を選択します。これを保存し、次のポップアップメニューで「OK」を選択します。メッシュミキサーソフトウェアを開き、前の手順で生成されたSDLファイルをインポートします。スカルプト、ブラシ、ドラゴンスカルプト、ブラシ、インフレーションツールを使用して、丸みを帯びる必要があるモデル表面を引き出します。モデルが目的の外観になったら、[ファイルとエクスポート]をクリックしてSDL形式で保存します。必要に応じてファイルに名前を付け、SDLバイナリ形式を選択して保存します。MeshLab ソフトウェアで 3D モデルを開きます。ポストオープン処理ポップアップウィンドウで[OK]をクリックします。各サンプリング スポットの X、Y、Z 座標を取得するには、ポイント選択ツールを選択し、3D モデル サーフェス全体で等間隔で右クリックします。必要な座標がすべて選択されたら、フォームポップアップウィンドウの一番上の[保存]ボタンをクリックします。表計算ソフトで、前の手順で作成したppファイルを開きます。データ表示を調整するには、[列へのデータテキスト]をクリックし、[区切り]をクリックします。[次へ]をクリックし、[スペース]を選択して[完了]をクリックします。スプレッドシートのセルに数値のみが残るように再書式を設定するには、「ホーム検索」と「置換」を選択します。[検索対象] ボックスに「Y 等しいコート」と入力し、置換ボックスを空のままにします。[すべて置換]をクリックし、[OK]をクリックします。X 等しいコート、Z 等しいコート、および より大きいコートスラッシュについて繰り返します。表計算ソフトウェアのテーブルでは、行は各位置に対応し、列はデータに対応します。適切なメタデータと代謝産物の特徴の豊富さをスプレッドシートの後続の列に貼り付けます。半径列に、モデル上で視覚化するサンプリングスポットの希望サイズを入力します。半径の値を経験的に決定し、CSV形式でファイルを保存します。ELIプロットソフトウェアに移動し、[サーフェス]を選択してから、作成した3Dモデルをブラウザウィンドウにドラッグアンドドロップします。作成したフィーチャーテーブルを同じブラウザウィンドウにドラッグアンドドロップします。右下隅の凡例を使用して、目的のデータ列を 3D モデルに投影します。各データ列を連続して選択して、3D モデル上のこの代謝産物フィーチャの分布を評価します。この分析により、5, 502 個のフィーチャとその 3D での視覚化の表が作成されました。このアプローチにより、寄生虫負荷の高い部位で高い個々の動物の代謝産物の特徴、組織領域間で差異分布を持つ代謝産物、および小腸と大腸で同等のレベルで見られる代謝産物の特徴を視覚化することができます。LCMS溶媒のみを使用し、隣接するすべての組織を収集し、収集されたすべてのサンプルの代謝産物を抽出して、空間マップのギャップを回避することを忘れないでください。この技術は、トリパノソマチド型寄生虫による組織コロニー形成のための栄養所要量を探索し、感染時の3D代謝産物分布マップを比較することによって疾患の病因を理解するために使用することができる。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

この原稿は、アフリカのトリパノソーマの生物発光株を使用して、後期感染の追跡を可能にする方法を説明し、in...

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このプロトコルでは透明なゼブラフィッシュ幼虫に蛍光に分類されたt.

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Trypanosoma cruziの3つのIn Vitroライフサイクルステージにおける超微細構造拡大顕微鏡

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ハイブリッド深層学習モデルを用いたトリパノソーマ寄生虫の優れた自動同定

アフリカのトリパノソーマの血流型のグリコソームの環境的手がかりにpHがどのように応答するかを研究する方法について説明します。このアプローチでは、pH感受性遺伝性タンパク質センサーとフローサイトメトリーを組み合わせて、経時アッセイとハイスループットスクリーニングフォーマットの両方でpHダイナミクスを測定します。...

生きているTrypanosoma bruceiの動的グリコソームpH変化の測定

ここで提供されるプロトコルは、 Trypanosoma cruzi...

薬効研究のためのシャーガス病モデルマウスのIn vivo生物発光イメージングの謎解き

学ぶ トリパノソマチド感染時の代謝物分布を3Dモデル化する手法。組織サンプリング、LCMS抽出、SketchUpとMeshLabによる可視化を含み、5,500以上の代謝物特徴をマッピングし、病原体負荷との相関を解析する。

トリパノソマチド感染を研究するための化学地図作成アプローチ

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