Name: 微生物化学およびタンパク質生産のための光制御発酵 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶ光制御発酵法による微生物代謝の動的制御と化学・タンパク質生産の最適化。Saccharomyces cerevisiaeを用いた青光源調節プロトコルで、非侵襲的かつ可逆的なプロセス制御を実現する。

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この研究は、米国エネルギー省科学局、生物環境研究局賞番号DE-SC0019363、NSF CAREER賞CBET-1751840、ピュー慈善信託、およびカミーユドレフュス教師学者賞の支援を受けました。

<ol><li>Figueroa, D., Rojas, V., Romero, A., Larrondo, L. F., Salinas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+and+shine+of+yeast+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">The rise and shine of yeast optogenetics.</a> Yeast. 38 (2), 131-146 (2021).</li>
<li>Pouzet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+optogenetics+for+bioproduction%3A+Dynamic+control+strategies+and+scale-up+instruments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">The promise of optogenetics for bioproduction: Dynamic control strategies and scale-up instruments.</a> Bioengineering. 7 (4), 151(2020).</li>
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<li>Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Avalos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+future+modalities+of+dynamic+control+in+metabolic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Current and future modalities of dynamic control in metabolic engineering.</a> Current Opinion in Biotechnology. 52, 56-65 (2018).</li>
<li>Zhao, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+characterization+of+rapid+optogenetic+circuits+for+dynamic+control+in+yeast+metabolic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Design and characterization of rapid optogenetic circuits for dynamic control in yeast metabolic engineering.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (12), 3254-3266 (2020).</li>
<li>Lalwani, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+the+lac+operon+for+bacterial+chemical+and+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of the lac operon for bacterial chemical and protein production.</a> Nature Chemical Biology. 17 (1), 71-79 (2021).</li>
<li>Zhao, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+regulation+of+engineered+cellular+metabolism+for+microbial+chemical+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optogenetic regulation of engineered cellular metabolism for microbial chemical production.</a> Nature. 555 (7698), 683-687 (2018).</li>
<li>Baumschlager, A., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biological+approaches+for+optogenetics+and+tools+for+transcriptional+light-control+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic biological approaches for optogenetics and tools for transcriptional light-control in bacteria.</a> Advanced Biology. 5 (5), 2000256(2021).</li>
<li>Dvorak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exacerbation+of+substrate+toxicity+by+IPTG+in+Escherichia+coli+BL21%28DE3%29+carrying+a+synthetic+metabolic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Exacerbation of substrate toxicity by IPTG in Escherichia coli BL21(DE3) carrying a synthetic metabolic pathway.</a> Microbial Cell Factories. 14, 201(2015).</li>
<li>Hartline, C. J., Schmitz, A. C., Han, Y., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+control+in+metabolic+engineering%3A+Theories%2C+tools%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Dynamic control in metabolic engineering: Theories, tools, and applications.</a> Metabolic Engineering. 63, 126-140 (2021).</li>
<li>Ni, C., Dinh, C. V., Prather, K. L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+control+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Chemical+and+Biomolecular+Engineering%22%5BJournal%5D)">Dynamic control of metabolism.</a> Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 12, 519-560 (2021).</li>
<li>Zhao, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+amplification+circuits+for+light-induced+metabolic+control%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic amplification circuits for light-induced metabolic control.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (5), 1143-1154 (2021).</li>
<li>Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Wegner, S. A., Avalos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neurospora+crassa+Inducible+Q+System+Enables+Simultaneous+Optogenetic+Amplification+and+Inversion+in+Saccharomyces+cerevisiae+for+Bidirectional+Control+of+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">The Neurospora crassa Inducible Q System Enables Simultaneous Optogenetic Amplification and Inversion in Saccharomyces cerevisiae for Bidirectional Control of Gene Expression.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (8), 2060-2075 (2021).</li>
<li>Motta-Mena, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li>
<li>Marx, H., Mecklenbräuker, A., Gasser, B., Sauer, M., Mattanovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+gene+copy+number+amplification+in+Pichia+pastoris+by+vector+integration+into+the+ribosomal+DNA+locus%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Directed gene copy number amplification in Pichia pastoris by vector integration into the ribosomal DNA locus.</a> FEMS Yeast Research. 9 (8), 1260-1270 (2009).</li>
<li>Nordén, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+gene+dosage+greatly+enhances+recombinant+expression+of+aquaporins+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Increasing gene dosage greatly enhances recombinant expression of aquaporins in Pichia pastoris.</a> BMC Biotechnology. 11, 47(2011).</li>
<li>Zhao, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-based+control+of+metabolic+flux+through+assembly+of+synthetic+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Light-based control of metabolic flux through assembly of synthetic organelles.</a> Nature Chemical Biology. 15 (6), 589-597 (2019).</li>
<li>Dowee, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li>
<li>Zhou, K., Edgar, S., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+microbes+to+synthesize+plant+isoprenoids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Engineering microbes to synthesize plant isoprenoids.</a> Methods in Enzymology. 575, 225-245 (2016).</li>
<li>Arfman, N., Worrell, V., Ingram, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+tac+promoter+and+lacI%28q%29+for+the+controlled+expression+of+Zymomonas+mobilis+fermentative+genes+in+Escherichia+coli+and+Zymomonas+mobilis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Use of the tac promoter and lacI(q) for the controlled expression of Zymomonas mobilis fermentative genes in Escherichia coli and Zymomonas mobilis.</a> Journal of Bacteriology. 174 (22), 7370-7378 (1992).</li>
<li>Steen, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+Saccharomyces+cerevisiae+for+the+production+of+n-butanol%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol.</a> Microbial Cell Factories. 7 (1), 1-8 (2008).</li>
<li>Tan, S. Z., Manchester, S., Prather, K. L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+central+carbon+metabolism+for+improved+pathway+yields+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Controlling central carbon metabolism for improved pathway yields in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (2), 116-124 (2015).</li>
<li>Jayaraman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light-mediated+transcriptional+activation+and+repression+of+gene+expression+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Blue light-mediated transcriptional activation and repression of gene expression in bacteria.</a> Nucleic Acids Research. 44 (14), 6994(2016).</li>
<li>Fernandez-Rodriguez, J., Moser, F., Song, M., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+RGB+color+vision+into+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineering RGB color vision into Escherichia coli.</a> Nature Chemical Biology. 13 (7), 706-708 (2017).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-powered+Escherichia+coli+cell+division+for+chemical+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Light-powered Escherichia coli cell division for chemical production.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-14 (2020).</li>
<li>Senoo, S., Tandar, S. T., Kitamura, S., Toya, Y., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-inducible+flux+control+of+triosephosphate+isomerase+on+glycolysis+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Light-inducible flux control of triosephosphate isomerase on glycolysis in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 116 (12), 3292-3300 (2019).</li>
<li>Ramakrishnan, P., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+synechocystis+PCC6803+UirS-UirR+as+a+UV-violet%2Fgreen+photoreversible+transcriptional+regulatory+tool+in+E.+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Repurposing synechocystis PCC6803 UirS-UirR as a UV-violet/green photoreversible transcriptional regulatory tool in E. Coli.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (7), 733-740 (2016).</li>
<li>Tabor, J. J., Levskaya, A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multichromatic+control+of+gene+expression+in+escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Multichromatic control of gene expression in escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 405 (2), 315-324 (2011).</li>
<li>Stewart, C. J., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+an+automated+illuminating%2C+culturing%2C+and+sampling+system+for+microbial+optogenetic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of an automated illuminating, culturing, and sampling system for microbial optogenetic applications.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (120), e54894(2017).</li>
<li>Grødem, E. O. S., Sweeney, K., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+calibration+of+optoPlate+LEDs+to+reduce+light+dose+variation+in+optogenetic+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments.</a> BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).</li>
<li>Gerhardt, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-hardware+platform+for+optogenetics+and+photobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An open-hardware platform for optogenetics and photobiology.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Bugaj, L. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+multicolor+optogenetics+in+microwell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates.</a> Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).</li>
<li>Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+characterisation+and+manipulation+of+biological+systems+with+Chi.Bio%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ characterisation and manipulation of biological systems with Chi.Bio.</a> PLoS Biology. 18 (7), (2020).</li>
<li>Carrasco-López, C., García-Echauri, S. A., Kichuk, T., Avalos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+and+biosensors+set+the+stage+for+metabolic+cybergenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optogenetics and biosensors set the stage for metabolic cybergenetics.</a> Current Opinion in Biotechnology. 65, 296-309 (2020).</li>
<li>Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+optogenetic+feedback+control+for+precise+and+robust+regulation+of+gene+expression+and+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-11 (2016).</li>
<li>Melendez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optogenetic+control+of+intracellular+protein+concentration+in+microbial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%3A+Quantitative+Biosciences+From+Nano+to+Macro%22%5BJournal%5D)">Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences From Nano to Macro. 6 (3), 366-372 (2014).</li>
<li>Milias-Argeitis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+feedback+for+in+vivo+regulation+of+a+gene+expression+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).</li>
<li>Castillo-Hair, S. M., Baerman, E. A., Fujita, M., Igoshin, O. A., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+Bacillus+subtilis+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of Bacillus subtilis gene expression.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).</li>
<li>Xia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+modification+of+pseudomonas+aeruginosa+enables+controllable+twitching+motility+and+host+infection%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic modification of pseudomonas aeruginosa enables controllable twitching motility and host infection.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (3), 531-541 (2021).</li>
<li>Pu, L., Yang, S., Xia, A., Jin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+manipulation+enables+prevention+of+biofilm+formation+of+engineered+pseudomonas+aeruginosa+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetics manipulation enables prevention of biofilm formation of engineered pseudomonas aeruginosa on surfaces.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), 200-208 (2018).</li>
</ol>

著者らは、この記事で説明した光遺伝学的回路および方法に関するいくつかの特許を申請している。

動的制御は、代謝工学と組換えタンパク質生産の収量を改善するために長い間適用されてきました4。酵素発現の変化は、IPTG21、ガラクトース22、およびテトラサイクリン23などの化学誘導物質を用いて最も典型的には実施されるが、温度およびpHなどのプロセス条件を用いて媒介される。遺伝子発現の光遺伝学的制御により、発酵パラメータや培地組成を変更する必要がなくなり、従来の誘導戦略に容易に適用できる代替手段となります。光を簡単にオンまたはオフにできることは、遺伝子投与量の迅速かつ可逆的な調整などの新しい機能も提供します。さらに、これらのプロトコルは青色光応答系に焦点を当てていますが、既存の光応答を反転させる光遺伝学的ツール24、または他の波長の光に応答する光遺伝学的ツール25,26,27,28,29の存在は<sup cla...

光応答性タンパク質による生物学的プロセスの制御であるオプトジェネティクスは、化学的およびタンパク質生産のための微生物発酵を動的に制御する新しい戦略を提供します1,2。操作された代謝経路の負担と、一部の中間体および生成物の毒性は、しばしば細胞増殖を損なう3。このようなストレスは、バイオマスの蓄積不良や生産性の低下につながる可能性があります3。この課題は、発酵を時間的に成長段階と生産段階に分け、代謝資源をバイオマス蓄積または製品合成にそれぞれ捧げることによって対処することができます4。我々は最近、この二相発酵における成長から生産への移行が、照明条件の変化によって誘発され得ることを示した5,6,7。光入力の高い同調性、可逆性、直交性8は、従来の二相発酵の動的制御に使用される化学誘導物質では複製が困難または不可能な光制御発酵に独自の利点を提供します4,9,10,11。
エリスロバクター・リトラリス由来の青色光応答性EL222タンパク質は、サッカロミセス・セレビシエ5,7,12,13における代謝工学のためのいくつかの光遺伝学的回路を開発するために使用されている。EL222は、青色光活性化(465nm)時に立体構造シフトを受ける光酸素電圧センサ(LOV)ドメインを含み、これにより、同族DNA配列(C120)13に結合することができる。EL222をウイルスVP16活性化ドメイン(VP16-EL222)に融合させることで、合成プロモーターPC120からS. cerevisiae7および他の生物14における遺伝子発現を可逆的に活性化することができる青色光応答性転写因子が得られる。EL222に基づくいくつかの回路が開発され、目的の遺伝子がPC120から直接発現される基本的な光活性化OptoEXPシステム7など、S. cerevisiaeの化学生産に使用されています(図1A)。しかし、発酵の生産段階で典型的に遭遇する高い細胞密度での光の浸透の懸念は、OptoINVRTおよびOptoQ-INVRT回路(図1B)5、7、13のような暗闇で誘導される反転回路を開発する動機となった。これらの系は、それぞれセレビシエ菌およびクラッサ菌由来のガラクトース(GAL)またはキナ酸(Q)レギュロンを利用し、対応するリプレッサー(GAL80およびQS)をVP16-EL222で制御して、光では遺伝子発現を抑制し、暗闇では強く誘導します。OptoEXP回路とOptoINVRT回路を組み合わせることで、遺伝子発現の双方向制御が可能になり、成長期が青色光で誘導され、生産期が暗さで誘導される2相発酵が可能になります(図2A)5,7。
生産段階で遺伝子発現を誘導するために暗闇の代わりに光を使用することは、光遺伝学的制御の能力を大幅に拡大するが、発酵のこの段階で典型的に遭遇する高い細胞密度の光浸透制限を克服することも必要である。この目的のために、我々は、青色光刺激に対する転写応答を増幅するOptoAMPおよびOptoQ-AMPとして知られる回路を開発しました。これらの回路は、VP16-EL222の野生型または過敏性変異体を使用して、GALまたはQレギュロンの転写活性化剤Gal4pまたはQF2の産生をそれぞれ制御し、光による感度の向上とより強い遺伝子発現を達成します12,13(図1C)。OptoAMP回路は、光学密度(600nmで測定)で5Lバイオリアクターで完全かつ均質な光誘導を達成することができます。OD600)は、照明のわずか〜0.35%(バルク表面の〜7%のみに5%の光線量)を有する少なくとも40の値である。これは、100%に近い照明を必要とするOptoEXPと比較して、より高い感度を示しています12。高い細胞密度で光で遺伝子発現を効果的に誘導する能力は、発酵の動的制御のための新しい機会を開きます。これには、化学生産を最適化するために独自の光スケジュールで成長、誘導、生産段階が確立される三相発酵など、2つ以上の時間的段階における発酵の操作が含まれます(図2B)12。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63269/63269fig1v2.jpg"> 図1:セレビシエ菌の動的制御のための光遺伝学的回路 OptoEXP、OptoINVRT、およびOptoAMP回路は、光に敏感なVP16-EL222システムに基づいています。(A)OptoEXP回路では、青色光への曝露はVP16-EL222の立体構造変化および二量体化を引き起こし、DNA結合ドメインを露出させ、PC120からの転写を可能にする。この図はZhao et al.7から修正されたものである。(B)OptoINVRT回路は、GALまたはQレギュロンを利用して、暗闇での発現を誘導する。GALベースの回路では、VP16-EL222およびGAL4が恒常的に発現され、PC120はGAL80リプレッサーの発現を駆動する(Qベースの回路では、GAL4およびGAL80はそれぞれQF2およびQSに置き換えられ、GALプロモーターの代わりに合成QUAS含有プロモーターが使用される)。光の中で、Gal80pはPGAL1からの目的遺伝子の活性化を妨げる。暗闇では、GAL80は発現されず、構成的デグロンドメイン(小さな茶色のドメイン)に融合することによって急速に分解され、Gal4pによるPGAL1の活性化を可能にする。この図はZhao et al.5から修正されています。(C) OptoAMP回路はVP16-EL222を使用してGALまたはQレギュロンも制御します。これらの回路では、GAL80リプレッサー(またはQS)が恒常的に表現され、光感受性デグロン(小さな青色領域)に融合され、暗闇でのタイトな抑制を保証します。PC120および過敏性VP16−EL222変異体は、光でGAL4(またはQF2)の発現を制御し、光中でPGAL1(またはQUAS含有プロモーター)を強く活性化する。GAL由来の回路は、活性が増大したPGAL1-MやPGAL1-Sなどの操作型PGAL1や、GALレギュロン(PGAL1、PGAL10、PGAL2、PGAL7)によって制御される野生型プロモーターを使用することができる。この図はZhao et al.12から修正されています<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63269/63269fig1v2large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63269/63269fig02.jpg"> 図2:時間の経過に伴う 二相発酵と三相発酵。(A)逆回路で操作される二相発酵は、光駆動の成長段階と暗黒生産段階からなる。成長段階では、生産経路が抑制されたままであるため、バイオマスは蓄積します。所望のOD600に達すると、細胞は、産生段階のために新鮮な培地に再懸濁される前に代謝的に調整するために暗所にシフトされる。(B)三相プロセスにおいて、成長、インキュベーション、および生産段階は、暗い成長期間、パルスインキュベーション、および完全に照らされた生産段階からなることができる固有の光スケジュールによって定義される。バイオレンダーで作成した図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63269/63269fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
光遺伝学的回路は、大腸菌における化学的およびタンパク質産生の動的制御のためにも開発されている。OptoLAC回路は、YF1/FixJ 2成分系をベースとする光応答性pDawn回路を使用して、細菌のLacIリプレッサを制御します6(図3)。OptoINVRT5と同様に、OptoLAC回路は、光の中で遺伝子発現を抑制し、暗闇の中でそれを誘導するように設計されています。OptoLAC回路を用いた発現レベルは、標準的なイソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)誘導で達成された発現レベルに匹敵するか、それを超えることができるため、化学的誘導の強度を維持しながら、同調性と可逆性を高めます6。したがって、OptoLAC回路は、大腸菌における代謝工学のための効果的な光遺伝学的制御を可能にする。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63269/63269fig03.jpg"> 図3:大腸菌の動的制御のためのOptoLAC回路。 OptoLAC回路は、pDawnシステムとlacオペロンを適応させて、暗闇の中での活性化と光での抑圧を実現します。暗所では、YF1はFixJをリン酸化し、PFixK2プロモーターを活性化してcIリプレッサーを発現させる。cIリプレッサーは、PRプロモーターからのlacIリプレッサーの発現を防止し、lacO含有プロモーターからの目的遺伝子の転写を可能にする。逆に、青色光はYF1ネットキナーゼ活性を低下させ、FixJリン酸化を逆転させ、したがってcI発現を逆転させ、lacIの発現を抑制し、lacO含有プロモーターからの発現を妨げる。この図はLalwani et al.6から修正されたものである。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63269/63269fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ここでは、化学またはタンパク質生産のための セレビシエ 菌および 大腸菌 の光制御発酵のための基本的なプロトコルについて説明します。酵母とバクテリアの両方について、まず、光駆動の増殖段階と、OptoINVRTおよびOptoLAC回路によって可能になる暗闇誘発生産段階を有する発酵に焦点を当てています。続いて、OptoAMP回路によって可能になる三相(成長、誘導、生産)光制御発酵のプロトコルについて説明します。さらに、光遺伝学的に制御された発酵をマイクロプレートからラボ規模のバイオリアクターにスケールアップする方法についても説明します。このプロトコルにより、化学的またはタンパク質生産のための光制御発酵を実行するための完全で再現性の高いガイドを提供することを目指しています。

<table><tbody><tr><td><S. cerevisiae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24ウェル培養プレート</td>を使用したstrong>光制御化学生産 <td>USA Scientific</td><td>CC7672-7524</td><td></td></tr><tr><td>寒天粉末</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>303991049</td><td></td></tr><tr><td>アルミホイ</td>ル <td>レイノルズ</td><td>B004NG90YO</td><td></td></tr><tr><td>バイオスペクトロメーター &mu;キュベット</td><td>エッペンドルフ</td><td>6135000923</td><td></td></tr><tr><td>青色LEDパネル</td><td>HQRP</td><td>884667106091218</td><td></td></tr><tr><td>EZ-L439 OptoINVRT7 プラスミド</td><td>該当なし</td><td>該当なし 参照</td><td>1</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>501879892 (G8270-5KG)</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心機</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td> サイエンティフィック サイエンティフィック <td>セ75002403</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>Yamato Scientific America</td><td>SOU-300</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>Celltreat</td><td>229656</td><td></td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0560L</td><td></td></tr><tr><td>量子計</td><td>Apogee Instruments</td><td>MQ-510</td><td></td></tr><tr><td>レプリカめっき装置</td><td>Thomas</td><td>Scientific F37848-0000</td><td></td></tr><tr><td>レプリカメッキパッド</td><td>サンライズ科学製品</td><td>3005-012</td><td></td></tr><tr><td>SC-彼の粉末</td><td>サンライズ科学製品</td><td>1303-030</td><td></td></tr><tr><td>SC 完全な粉末</td><td>サンライズ科学製品</td><td>1459-100</td><td></td></tr><tr><td>滅菌シーリングフィルム</td><td>Excel Scientific</td><td>STR-SEAL-PLT</td><td></td></tr><tr><td>YPD 寒天プレート</td><td>VWR</td><td>100217-054</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R25005</td><td></td></tr><tr><td>光制御タンパク質生産 E. coli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6X SDS サンプルバッファー</td><td>Cepham Life Sciences</td><td>10502</td><td></td></tr><tr><td>12% アクリルアミドタンパク質ゲル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>NP0341BOX</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル培養プレート</td><td>USA Scientific</td><td>CC7672-7524</td><td></td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>レイノルズ</td><td>B004NG90YO</td><td></td></tr><tr><td>バイオスペクトロメーター&mu;キュベット</td><td>Eppendorf</td><td>6135000923</td><td></td></tr><tr><td>Blue LED panel</td><td>HQRP</td><td>884667106091218</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20279</td><td></td></tr><tr><td>電気泳動セル</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>電気泳動電源</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>LB ブロス (Miller)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>BP97235</tr><tr><td>マイクロ遠心機</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>75002403</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thomas Scientific</td><td>SX0425-1</td><td></td></tr><tr><td>OptoLAC プラスミド</td><td>該当</td><td>なし 該当なし 参照</td><td>2</td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>Yamato Scientific America</td><td>SOU-300</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>セルトリート</td><td>229656</td><td></td></tr><tr><td>量子計</td><td>アポジー機器</td><td>MQ-510</td><td></td></tr><tr><td>SOC 培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>サーモミキサー</td><td>エッペンドルフ</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>Sを使用した三相発酵。cerevisiae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>「S. cerevisiaeを使用した光制御化学生産」プロトコルと同じ材料に加えて、以下を加えます:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ-L580 OptoAMP4 プラスミド</td><td>N/</td><td>A N/</td><td>A 参照 参考文献 10</td></tr><tr><td>光制御バイオリアクターでの化学生産</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アルミ箔</td><td>Reynolds</td><td>B004NG90YO</td><td></td></tr><tr><td>Antifoam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8311</td><td></td></tr><tr><td>Bioreactor with control station</td><td>Eppendorf</td><td>B120110001</td><td></td></tr><tr><td>BioSpectrometer with &mu;キュベット</td><td>エッペンドルフ</td><td>6135000923</td><td></td></tr><tr><td>漂白剤</td><td>VWR Scientific</td><td>89501-620 (CS)</td><td></td></tr><tr><td>青色LEDパネル</td><td>HQRP</td><td>884667106091218</td><td></td></tr><tr><td>BPTチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-170-15</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>501879892 (G8270-5KG)</td><td></td></tr><tr><td>塩酸 (HCl)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>M9 最小限の塩</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>サイ</td>エンティフィック A1374401 <td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>75002403</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td></td></tr><tr><td>NH4OH ソリューション</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0503-1VL</td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>ヤマトサイエンティフィック アメリカ</td><td>SOU-300</td><td></td></tr><tr><td>量子計</td><td>Apogee Instruments</td><td>MQ-510</td><td></td></tr><tr><td>SC コンプリートパウダー</td><td>サンライズ サイエンス プロダクツ</td><td>1459-100</td><td></td></tr></tbody></table>

微生物化学およびタンパク質生産のための光制御発酵

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

微生物細胞工場は、再生可能な原料から化学物質や組換えタンパク質を生産するための持続可能な代替手段を提供します。しかし、微生物に遺伝子組み換えを過剰に負担をかけると、宿主の適応度と生産性が低下する可能性があります。この問題は、動的制御(酵素および経路の誘導性発現、典型的には化学的または栄養ベースの添加剤を使用して、細胞の成長および産生のバランスをとることによって克服することができる。光遺伝学は、遺伝子発現を動的に調節する非侵襲的、高度に調整可能、かつ可逆的な方法を提供する。ここでは、化学物質または組換えタンパク質の生産のために、操作された 大腸菌 および サッカロミセス・セレビシエ の光制御発酵を設定する方法について説明します。私たちは、発酵制御と生産性を向上させるために微生物の増殖と生産を切り離すために、選択された時間と投与量で光を適用する方法、および最良の結果を得るための主要な最適化考慮事項について説明します。さらに、ラボ規模のバイオリアクター実験のための光制御を実装する方法について説明します。これらのプロトコルは、発酵性能を向上させるために、操作された微生物における光遺伝学的制御の採用を容易にする。

微生物代謝の光遺伝学的調節は、バイオ燃料、バルク化学物質、タンパク質、天然物を含む様々な製品を生産するために首尾よく実施されている5,6,7,12,13。これらのプロセスのほとんどは、細胞増殖が光の中で起こるように設計されており(細胞密度が低い場合、光透過に最小限の課題をもたらす場合)、および細胞が増殖すると暗闇によって産生が誘導されるように設計されている。このアプローチを用いて酵母から生産された様々な化学物質には、貴重な高分子前駆体や食品添加物である乳酸や、次世代バイオ燃料であるイソブタノールなどが含まれる。両方の化学物質について、共通の課題は、S. cerevisiaeがグルコースを目的の生成物ではなくエタノール生産に向けて代謝する強い駆動力と、深刻な成長欠陥を引き起こすことなくエタノール発酵...

微生物代謝の光遺伝学的制御は、発酵プロセスに対する柔軟な動的制御を提供する。ここでのプロトコルは、異なる体積スケールでの化学およびタンパク質生産のための青色光調節発酵を設定する方法を示しています。

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

光遺伝学は、典型的な誘導物質と比較して、いくつかの化学物質およびタンパク質のより高い力価を達成するために使用されてきた。このプロトコルを使用すると、他の人は光ベースの制御で独自のプロセスを強化できます。光遺伝学制御は、非侵襲的であり、高度に調整可能であり、可逆的である。これらの品質により、微生物プロセスの合理化された最適化が可能になり、三相発酵や多色制御などのユニークな機会も開かれます。新しい化学物質の場合、最適な光条件は異なります。したがって、このプロトコルのパラメータを使用して低生産が観察された場合は、異なる光条件をテストする必要があります。まず、OptoINVRTプラスミドに必要なマーカーであるHIS3オキシトロフィーを有するサッカロミセス・セレビシエ株を取得することから始める。サッカロミセス・セレビシエに天然の遺伝子を制御しようとする場合、進行する前に遺伝子の内因性コピーが欠失していることを確認してください。株構築を開始するには、EZL439などのOptoINVRT7回路を含むプラスミドを線形化します。EGA1プロモーターを光の中で抑制し、暗闇の中でそれを活性化する成分を含むEZL439を使用する場合は、Pme1制限部位で線形化する。標準的な酢酸リチウム形質転換法を用いて、プラスミドをHIS3栄養要求性株に組み込む。形質転換に続いて、細胞を150Gで1分間遠心分離する。細胞を200マイクロリットルの新鮮なSC−HIS培地に穏やかに再懸濁する。細胞体積全体をSC-HIS寒天プレートにプレートし、コロニーが現れるまで摂氏30度で2〜3日間インキュベートする。標準的な酢酸リチウム形質転換プロトコルを使用してコンピテントセルを作製します。PIGA1MまたはPIGA1Sプロモーターの下流に光遺伝学的に制御したい遺伝子を含むプラスミドで細胞を形質転換します。形質転換後、培養物を150Gで1分間遠心分離し、細胞ペレットを200マイクロリットルの新鮮なSCドロップアウト培地に穏やかに再懸濁する。酵母エキスペプトンデキストロース寒天プレート上に全細胞体積をプレートし、デルタ部位に組み込む場合は選択マーカーを含むプラスミドで形質転換すればSCドロップアウトプレートとする。細胞を摂氏30度で一定の青色光の下で16時間インキュベートし、光遺伝学的に制御された遺伝子を抑制したままにする。波長465ナノメートルの光源を使用し、光強度が毎秒約80〜110マイクロモルになるように、プレートの上に約40センチメートルのLEDパネルを配置します。量子メーターを使用して強度を測定します。デルタ部位に統合する場合は、1ミリリットルあたり400マイクログラムから1ミリリットルあたり1,200マイクログラムの間のゼオシン濃度の範囲を含む酵母エキスペプトンデキストロースプレート上にプレートを複製して、さまざまな統合コピー数を選択します。レプリカプレートを摂氏30度で、一定またはパルス状の青色光の下で、コロニーが現れるまで2〜3日間インキュベートする。予備スクリーニングを行うには、各プレートから8つのコロニーを選択し、それらを使用して、24ウェルプレートの個々のウェルに2%グルコースを添加したSC-HIS培地1ミリリットルを接種する。一定の青色光照明下で毎分200回転で30°Cの振とうで細胞を一晩成長させる。翌日、各培養物をグルコース2%の新鮮なSC-HIS培地で希釈し、600ナノメートルで0.01〜0.3の範囲の光学密度値を取得し、光学密度が2〜9に達するまで摂氏30度の一定光またはパルス光下で毎分200回転の振とう条件で培養物を増殖させる。次に、プレートをアルミホイルで包み、ライトパネルをオフにし、毎分200回転で30°Cで4時間暗闇の中でプレートをインキュベートします。24ウェルプレート内の培養物を234Gで5分間遠心分離し、2%グルコースを含む1ミリリットルの新鮮な合成完全ドロップアウト培地に細胞を再懸濁する。滅菌マイクロプレート封止テープを用いて目的物の蒸発を防ぐためにプレートを密封する。密封プレートを暗所で30°Cで毎分200回転で48時間振とう発酵させる。発酵物を回収するには、プレートを234Gで5分間遠心分離し、800マイクロリットルの上清を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。目的の化学物質に応じて、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー質量分析、または使用する機器に最も適したサンプル調製技術を使用した別の分析方法を使用して分析します。各プレートから8つのコロニーを選択し、それらを使用して、24ウェルプレートの個々のウェルに1ミリリットルのSC-HIS培地に2%グルコースを接種する。暗所で30°Cで一晩中細胞を成長させ、毎分200回転の振とう。翌朝、各培養物を2%グルコースを含む新鮮なSC-HIS培地で0.1光学濃度に希釈する。プレートをアルミ箔で包んで光にさらされないようにし、30°Cの暗闇の中で培養物を毎分200回転の振とうで3つの光学密度に達するまで成長させます。その後、プレートをパルス光の下で摂氏30度で12時間インキュベートし、毎分200回転振る。培養物を234Gで5分間遠心分離し、2%グルコースを有する新鮮なSC−HIS培地に再懸濁する。滅菌マイクロプレート封止テープを用いて目的物の蒸発を防ぐためにプレートを密封する。密封したプレートを光で48時間、摂氏30度で毎分200回転で振とう発酵させる。光遺伝学的発酵を行った後、化学的生産を、2つの回路を用いて誘導時の細胞密度の範囲で試験した。OptoINVRT7回路は、OptoINVRT1および2回路と比較して、誘導値7.0および8.75の最適な細胞密度で乳酸およびイソブタノールの高力価を実証した。OptoAMP回路を用いた発酵は、異なる光デューティサイクルによって定義される3つの段階で研究された。乳酸生産は、パルス増殖段階および完全に照射された誘導および生産段階を使用して最適化することができる。イソブタノール生産は、パルス成長相、完全照射誘導相、およびパルス生産相を用いて最適化された。一方ナリンゲニン生合成は、パルス成長完全照射誘導および暗黒産生相を用いて最適に最適化された。OptoLACシステムは、IPDGによる化学的誘導を用いて達成されたものと同程度またはそれ以上の力価で転写因子FDERを産生するために大腸菌で使用されてきた。OptoLAC回路はメバロン酸塩を産生するために適用されており、その産生はIPDG誘導を用いて達成された力価を超えている。バイオリアクターレベルでのメバロン酸塩生産は、マイクロプレートレベルを超えた細菌における化学的およびタンパク質産生に対する光遺伝学的調節のスケーラビリティおよび同調性を実証する。照明されたステップで光の強度が適切な範囲にあり、暗闇を必要とするステップで光の汚染が回避されていることを確認することが重要です。この技術は、酵母におけるイソブタノールの記録的な力価を達成し、光でコンソーシアム集団を安定化させ、合成光制御細胞小器官を使用して代謝フラックスを制御する方法を開いた。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

出典:ヘメリッヒ、J.ら。自動マイクロバイオリアクター技術を用いた異質タンパク質生産の最適化プロトコル。J. Vis.

自動マイクロバイオリアクターを用いた異なる培地製剤における細菌増殖のモニタリング

我々は、倒立顕微鏡を用いて流出液中の微生物、定期的に画像を細胞の培養物を照明する光遺伝学システムを使用するための連続的な培養装置を設計しました。照明の動的応答は、数日間にわたって測定することができるように培養、サンプリング、画像化、および画像解析は完全に自動化されています。...

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自動液滴マイクロ流体プラットフォームを用いたL-乳酸高産生 バチルス凝固変 異体の高スループットスクリーニング

彼らはkHzのレートで安価にピコリットル、自己区分血管を生成することができるので、液滴ベースのマイクロ流体プラットフォームは、ハイスループットの実験のための有望な候補である。...

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この方法では、生分解性ポリ無水物膜およびナノ粒子のライブラリのコンビナトリアル合成し、これらのライブラリーからのタンパク質放出のハイスループット検出について説明します。...

組合せの合成と高分子膜とナノ粒子のライブラリからのハイスループットタンパクリリース

当社は、分割インテイン媒介タンパク質ヒドロゲルの合成を提示する。このヒドロゲルのビルディングブロックは、それぞれが分割インテインの架橋剤及び半分となる三量体タンパク質のサブユニットを含む二つのタンパク質の共重合体である。二つのタンパク質の共重合体の混合は、ヒドロゲルに自己組織化ペプチドユニットを得インテイントランススプライシング反応をトリガします。このヒドロゲルは、有機溶媒に対応して、高度なpHおよび温度安定性であり、簡単に機能的な球状タンパク質が組み込まれています。...

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微生物化学およびタンパク質生産のための光制御発酵

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