アプタマーアフィニティービーズを使用したグラム陰性菌のフロースルー分離のためのマイクロ流体音響泳動
2022年10月17日
本稿では、マイクロ流体音響泳動技術と、培地からのグラム陰性菌の迅速かつ効率的な単離に使用できるアプタマー修飾マイクロビーズを用いたマイクロ流体音響ホレストリーチップの製造と操作について説明します。
このプロトコルでは、アプタマー修飾マイクロビーズを使用して培地からグラム陰性菌を迅速かつ効率的に分離するために使用できる当社のマイクロ流体音響泳動技術について説明します。マイクロ流体音響泳動システムは、合理的なスループットと非接触細胞分離でグラム陰性菌分離を可能にします。マイクロ流体音響泳動は、医療サンプルや環境サンプルから細菌を分離するために最適化することができます。
まず、ターゲット出口でPSビーズを収集し、PSサンプル混合物をサンプル入口に注入した後に残りを廃棄するマイクロ流体音響泳動チップを設計します。シリコン層の上下の層をホウケイ酸ガラスに接着したチップを準備します。そして、陽極酸化を使用して、1000ボルトと摂氏400度を追加する3番目のホウケイ酸ガラス層。
10マイクロリットル未満のシアノアクリレート接着剤を使用して、マイクロ流体チャネルに沿ってホウケイ酸ガラス層にPZTを取り付けます。GNおよびGP細菌をルリア・ベルターニ培地に接種し、摂氏37度、毎分220回転で16時間インキュベートします。培養細菌を9, 056 RCFで室温で1分間遠心分離します。
その後、1X PBSバッファーで2回洗浄します。選択したGNおよびGP細菌を結合バッファーに再懸濁して分析用に準備します。使用前に、10マイクロメートルのストレプトアビジンコーティングされたマイクロビーズ混合物を再懸濁してください。
混合物を20秒間ボルテックスします。アプタマーを摂氏95度で3分間変性させ、次に摂氏0度で2分間折り直して準備します。再懸濁したストレプトアビジンコーティングされたマイクロビーズ混合物250マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに移し、100マイクロリットルのビオチン化DNAアプタマーをチューブに加えます。
混合物を室温で30分間インキュベートし、毎分25回転で回転させます。反応混合物を室温で40秒間9, 056 RCFで遠心分離する。次に、200マイクロリットルのTris-HClバッファーでチューブを2回洗浄します。
洗浄したサンプルチューブに10マイクロリットルの100ミリグラム/ミリリットルBSAを加え、毎分25回転で回転させながら室温で30分間インキュベートします。最後に、アプタマー修飾マイクロビーズをTris-HClバッファー中で2回洗浄し、室温で40秒間9, 056RCFで遠心分離する。PEEKチューブを2つのサンプルとバッファーを注入するための2つの入口と、廃棄物を収集および排出するための2つの出口に接続します。
10ミリリットルのシリンジを使用して、マイクロ流体音響泳動チャネルに気泡のない脱塩水を満たします。流体の流れを制御するために、2つ以上の出力チャネルを備えた精密圧力コントローラーを準備します。装置を準備した後、精密圧力制御装置を使用して、サンプル入口に2キロパスカル、バッファー入口に4キロパスカルの圧力を加えて、サンプルとバッファーを注入します。
顕微鏡を使用してビーズに焦点を合わせ、PZTを使用してマイクロ流体チャネルの中心に移動します。シングルチャンネルのファンクション・ジェネレータを使用して3.66メガヘルツの共振周波数を生成し、パワーアンプを使用して標準信号を16デシベル増幅します。音響流体チップ上の分離および濃縮プロセスを、蛍光顕微鏡と毎秒1, 200フレームで動作する高速カメラで観察します。
本研究で紹介した音響膜チップは、PZTの電圧が上昇すると、10マイクロメートルサイズのビーズの中心濃度が増加することを確認した。PZT電圧の5ボルトでは、10マイクロメートルサイズのビーズのほとんどが中心に集中していました。注入された10マイクロメートルサイズのビーズの総数に対する出口で採取したビーズの数の割合を回収率とした。
採取したビーズの総数に対する10マイクロメートルサイズのビーズの数の割合を純度と称した。その結果、本装置は10マイクロメートルサイズのビーズに対して高い分離効率を有することが示された。各アプタマー修飾マイクロビーズに結合したGNおよびGP細菌の数を、高速度カメラを備えた顕微鏡を用いて測定した。
5つのGN細菌すべてがビーズに結合しましたが、テストされた物質に結合したGP細菌は大幅に少なかった。シグナル強度はGN菌とGP菌で有意に異なっていた。PZTの取り付けに使用する接着剤は、波形の精度のためにできるだけ使用せず、PZTとマイクロチャネルを平行にする必要があります。
この装置は、細菌感染症の早期診断の期間に生きた細菌または細菌由来のバイオマーカーを検出するために使用することができる。
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概要
本研究では、さまざまな培地からグラム陰性菌を迅速かつ効率的に分離するためのマイクロ流体アコーストフォレシス（音響泳動）技術を提示します。この手法では、アプタマー修飾マイクロビーズを用いて分離プロセスを強化し、妥当なスループットでの非接触細胞分離を可能にしています。
研究の主要構成要素
科学分野
- マイクロフルイディクス
- 音響泳動
- 微生物学
背景
- マイクロ流体システムにより、マイクロスケールでの精密な流体操作が可能になります。
- アコーストフォレシス（音響泳動）は、音波を利用して粒子を操作する技術です。
- グラム陰性菌は、その構造的特性により、単離において大きな課題となります。
- アプタマーは、特定の標的に選択的に結合することができる短鎖の一本鎖オリゴヌクレオチドです。
研究目的
- 効率的な細菌分離のためのマイクロ流体アコーストフォレシスチップを開発すること。
- 医療サンプルおよび環境サンプルの両方において、単離プロセスを最適化すること。
- 分離効率の向上におけるアプタマー修飾マイクロビーズの有効性を実証すること。
使用方法
- マイクロ流体アコーストフォレシスチップの設計。
- チップ作製のためのシリコン層とホウケイ酸ガラス層の接合。
- 分離のためのPSサンプル混合液のチップへの注入。
- 特定の電圧および温度条件下での陽極酸化処理の適用。
主な結果
- マイクロ流体音響泳動システムにより、グラム陰性菌の分離に成功した。
- 高スループットかつ非接触での分離を実現した。
- アプタマー修飾マイクロビーズにより、分離効率が大幅に向上した。
- 本手法は、医療試料および環境試料の両方に適用可能である。
結論
- マイクロ流体アコーストフォレシスは、細菌分離のための有望な技術である。
- アプタマー修飾により、プロセスの選択性と効率が向上する。
- この技術は、微生物学におけるさまざまな応用に有益である可能性がある。
よくある質問
業界における重要性
このマイクロ流体アコーストフォレシス（音響泳動）法により、複雑なマトリックスからグラム陰性菌を迅速かつ高純度で単離することが可能となり、感染症の早期診断や環境モニタリングにおける重大なボトルネックが解消されます。ラベルフリーの音響分離とアプタマーによる特異性を組み合わせることで、本技術は抗菌薬探索やバイオマーカー検証ワークフローにおけるターゲットのデリスキングを支援します。10倍の濃縮で98%以上の回収率と97.8%の純度が実証されており、前臨床サンプルの調製において、遠心分離やろ過に代わるスケーラブルな非接触代替法を提供します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：不均一な生物学的または環境試料から生存している病原体を分離することで、グラム陰性細菌標的の機能的検証を可能にする。
- 運用的価値：従来の分離技術と比較して、試料処理時間を短縮し、生体分子へのダメージを最小限に抑える。
- 予測的価値：標的結合および作用機序研究のための精製細菌分画を提供することで、メカニズム面でのリスク低減（de-risking）を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：表現型スクリーニングアッセイ用の精製された細菌インプットを生成し、グラム陽性菌の混入による偽陽性を減少させる。
- 運用の価値：再現可能な音響泳動フォーカシングとアプタマー介在性キャプチャにより、サンプル調製を標準化する。
- スケーラビリティ：分岐チャネル設計により、同時処理、精製、および濃縮が可能となり、スクリーニングカスケードにおけるスループットを向上させる。
トランスレーショナル＆前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：血液や尿などの臨床に近いマトリックスからグラム陰性菌を一貫して分離することを可能にし、基礎研究と前臨床段階を橋渡しします。
- バイオマーカーの整合性：早期診断への応用において、生存細菌または派生バイオマーカーの検出を容易にし、トランスレーショナルなバイオマーカー開発を支援します。
- リスク調整済みの進展：高い回収率と純度指標により、リード化合物の評価に用いられるダウンストリームアッセイの信頼性が向上します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、初期探索から前臨床に至る一連のプロセスに適合し、特にグラム陰性細菌の純度が極めて重要となるターゲットバリデーション、アッセイ準備、およびメカニズム研究のためのサンプル調製を支援します。
- 探索生物学： 混合培養物または環境サンプルから特定のグラム陰性菌株を分離し、ターゲットのデリスキングを行うことで、仮説検証を支援します。
- スクリーニング： 妨害成分のキャリーオーバーを最小限に抑えた、アッセイ準備完了状態の細菌集団を可能にし、スクリーニングの忠実度を向上させます。
- 分析： 蛍光顕微鏡および高速イメージングを介して定量的な出力を提供し、ビーズと細菌の結合比や信号強度の比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 医学的に関連のあるサンプルからの分離を可能にすることで、前臨床ワークフローへと繋げ、感染症モデル開発における継続性を支援します。
- 企業での再利用： チップベースの設計と圧力制御流体システムにより、研究室間での標準化が可能となり、再設計することなくさまざまなサンプルタイプに適応させることができます。
運用および組織への影響
- 科学的価値：サンプル不純物によるメカニズムの曖昧さを低減し、ターゲットバリデーションの信頼性を向上させます。
- 運用上の価値：精密な音響力制御と標準化されたアプタマービーズ調製により、再現性を確保します。
- 戦略的価値：高忠実度の生物学的インプットを提供することで、抗微生物薬開発プログラムにおけるgo/no-go判断の信頼性を向上させます。
- ポートフォリオへの影響：精製された細菌画分から得られるよりクリーンなメカニズムデータに基づき、リスク調整後のリード化合物の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- マイクロ流体設計、音響泳動パラメータの最適化、およびアプタマー・ビーズ接合プロトコルの専門知識が必要です。
- 圧電トランスデューサ、関数発生器、パワーアンプ、および高速イメージング機能を備えた蛍光顕微鏡に依存します。
- バッファー条件、流速（サンプル 2 kPa、バッファー 4 kPa）、および PZT 電圧校正のユーザー間での標準化が必要です。
- 異なる細菌種やサンプルマトリックスに適応させる場合、アプタマーの選択および音響共振周波数の再最適化が必要になることがあります。
- 実用上の制限として、シアノアクリレートを過剰に使用すると接着剤による流路の波打ちが生じ、音響場の均一性に影響を及ぼす可能性があります。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Microuidic Acoustophoresis Chip Design and Fabrication
1:23
Bacterial Strains and Culture
1:56
Microbeads and Immobilization of Aptamer onto Microbeads
3:10
Acoustophoresis Setup and Operation
4:19
Results: Using Microfluidics to Capture GN Bacteria from Culture Samples at High Speed
5:26
Conclusion
