Name: カルシウムイメージング技術によるニューロン-グリア回路の変化の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: 学ぶ カルシウムイメージング技術を用いて、ニワトリ網膜培養細胞におけるニューロンとグリアの細胞内カルシウム濃度変化を可視化する方法です。KClとATP刺激による細胞特異的応答を解析し、神経回路のシグナル伝達メカニズムを解明します。

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助成金、スポンサー、資金源:MHは博士号CNPqフェローシップの受給者です。HRFは、CNPq(HRF助成金番号152071/2020-2)が支援するポスドクフェローシップの受領者です。RAMRはCNPqとFAPERJ(助成金番号E-26/202.668/2018、E-26/010.002215/2019、426342/2018-6、312157/2016-9)およびINCT-INNT(国立トランスレーショナル神経科学研究所)によってサポートされています。

動物を含むすべての実験は、「実験動物ケアの原則」(NIH、ベセスダ、米国)に従って、リオデジャネイロ連邦大学の施設動物ケアおよび使用委員会のガイドラインによって承認され、それに従って実施されました。受精ホワイトレグホーン鶏の卵のための許可番号IBCCF-035。
1. 溶液の調製
<ol><li>クレブス溶液(132 mM NaCl、4 mM KCl、1.4 mM MgCl2、2.5 mM CaCl2、6 mM グルコース、10 mM HEPES、pH 7.4、373 mOsm)を調製する。</li>
	<li>生理食塩水緩衝液(Ca2+およびMg2+遊離溶液 - CMF)を調製する:76.55 g/L NaCl、3.05 g/L KCl、1.65 g/L Na2HPO4、0.610 g/L KH2PO4、21.95 g/L グルコース、および 7.90 g/L NaHCO3。</li>
	<li>インキュベート溶液を調製する(クレブス溶液中のFura-2と共に:)5μMフラ-2-アセトキシメチルエステル(フラ-2)、0.1%脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン(BSA)、および0.02%ポロクサマー407。</li>
	<li>混合集団またはグリア培養の場合は、10%ウシ胎児血清(FCS)と40mg/Lゲンタマイシンを培地としたDMEM/F12を調製する。</li>
	<li>ニューロン富化培養のために、1%FCS、神経細胞培養サプリメント、40mg/Lおよびゲンタマイシンを培地として含むDMEM/F12を調製する。</li>
</ol>網膜解剖および細胞培養製剤
<ol><li>空気細胞がある8日齢のひよこの胚(E8)の卵を開きます。</li>
	<li>卵の内容物をペトリ皿に取り出し、一対のピンセットで断頭して胚安楽死を進める。</li>
	<li>頭を清潔なペトリ皿に持ってきて、カルシウムとマグネシウムを含まない溶液(CMF)を注いで洗ってください。</li>
	<li>その過程で目を傷つけないように注意しながら、目を取り除きます。 メモ:眼腔から取り出す前に、眼の層を切断または細断しないでください。</li>
	<li>CMFを含むきれいなペトリ皿に目を持ってきてください。</li>
	<li>レンズを取り外して眼の解剖を開始します。</li>
	<li>レンズが残した穴から始めて、目に3〜4個の縦方向の切り込みを入れます。ピンセットを引っ張り、目の強膜を反対方向に保持して切り取ります。</li>
	<li>透明な硝子体を慎重に取り除き、網膜がそれに束縛されていないことを確認してください。</li>
	<li>色素沈着した上皮から網膜を剥離し、残りの組織を除去する。</li>
	<li>透明な網膜を細かく切る。</li>
	<li>網膜を別のレシピエントに移し、それを短時間遠心分離(〜1,800 x gで1分間)してCMFを除去した。</li>
	<li>1mLの0.25%トリプシンで網膜を酵素的に解離させ、37°Cで10分間インキュベートする。</li>
	<li>10%FCSを含む培地1mLを加えて反応を停止する。</li>
	<li>網膜を培地で2〜3回洗う。洗浄は、培地を添加し、遠心分離(約1,800 x gで1分間)によってそれを除去するサイクルからなる。</li>
	<li>網膜あたり2mLの完全培地を加え、上下にピペッティングすることによって網膜を穏やかに機械的に解離させる。 注:ここでは、研究者はどのタイプの培養物を準備するかを選択できます。強化されたニューロン培養のために、DMEM-F12 +ニューロンサプリメント+ 1%FCS +抗生物質を使用してください。混合集団または精製グリアについては、DMEM-F12 + 10%FCS +抗生物質を使用してください。</li>
	<li>細胞を数え、所望の密度に希釈する。 注:理想的には、これは〜2 x 106 細胞以下の低密度培養物であるべきです。</li>
	<li>50 μLの細胞懸濁液を各カバースリップに加える。</li>
	<li>カバースリップトリートメント<ol>
<li>カバースリップを37°Cの滅菌精製水中の10-50μg/mLポリ-L-リジン1mL中で少なくとも1時間(理想的には一晩)インキュベートする。</li>
		<li>ポリ-L-リジン溶液を取り出し、滅菌精製水でカバーグラスを2~3回洗浄する。</li>
		<li>UVライトが点灯した状態で安全キャビネット内でカバースリップを乾かします。この時点で、それらを4°Cの密閉容器に最大1ヶ月間保管してください。</li>
		<li>オプションのステップ:ニューロン強化培養の場合、PBSまたは培地中の10-20ng/mLラミニン50μLを各カバースリップに37°Cで2時間加える。 インキュベーション後、過剰のラミニン溶液を除去し、カバースリップを使用する準備が整います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞をガラスに付着するまで、5%CO2 雰囲気で37°Cでインキュベートする。これには約1〜2時間かかります。</li>
	<li>各ウェルに1mLの完全培地を加え、実験日までプレートをインキュベーターに戻した。必要に応じて、2〜3日ごとに培地を交換してください。</li>
</ol>3. Fura-2 AMでセルをロードする
<ol><li>Fura-2 AMの50μgバイアルを50μLのDMSOで再構成する。</li>
	<li>作動中のFura-2 AM溶液を調製するために、3 μLの10%ポロクサマー407、7.5 μLのFura-2 AMをDMSOおよびクレブス溶液q.s.p.に1.5mL加える。</li>
	<li>水浴中で7分間混合物を超音波処理する。</li>
	<li>細胞培養物3xでカバースリップをクレブス溶液で洗浄してから、Fura-2でインキュベートする。</li>
	<li>37°Cと5%CO2 で30分間インキュベートする。</li>
	<li>インキュベーション後、それを再び3倍に洗浄し、クレブスを含む別のレシピエントに移し、光から保護する。 注:作業中のFura-2 AMソリューションは、光から保護されていれば24時間安定したままです。</li>
</ol>4. 細胞のカルシウムイメージング
<ol><li>各実行の前に、実験中の漏れを避けるために、カバースリップサポートとチャンバーにシリコンを加えてください。</li>
	<li>顕微鏡レンズの塩の結晶化を避けるために、カバースリップの底を蒸留水で洗ってください。</li>
	<li>カバースリップを支持体の上に置き、境界線を静かに押します。</li>
	<li>支持体とチャンバーを顕微鏡に取り付け、Krebs溶液で細胞を灌流し始める。 注:単一細胞カルシウムイメージング実験中の細胞灌流は、0.5mL/minの流速に較正され、プラットフォーム溶液が完全に交換されるまでに8〜10秒かかります。</li>
	<li>セルを見て、適切な視野を選択します。</li>
	<li>細胞体は、その明確な形態に基づいて手動で選択する。</li>
	<li>刺激を加える前に、ベースラインの安定化を待ちます。各刺激には約30秒かかります。 注: 各実験の直前にすべての溶液を準備します。</li>
	<li>340および380nmでの交互励起(750ミリ秒)後の510nmで放出される蛍光の比を定量化することによって、[Ca2+]i の変動を評価する。</li>
	<li>蛍光解析ソフトを用いて取得した値を処理します。</li>
	<li>実験結果を、各行が個々のセルを表し、各行が時点を表す表で表します。</li>
</ol>5. データ処理
<ol><li>表計算ソフトを用いて、特異細胞のFura-2蛍光比値の変動を別々に、またはそれらの全てを同時にプロットする。</li>
	<li>決定された刺激に対する反応性細胞の数を定量化するために、カルシウムベースラインレベルの30%増加のカットオフを設定する</li>
</ol>

<ol><li>Tsien, R. Y., Pozzan, T., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+homeostasis+in+intact+lymphocytes%3A+cytoplasmic+free+calcium+monitored+with+a+new%2C+intracellularly+trapped+fluorescent+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new, intracellularly trapped fluorescent indicator.</a> Journal of Cell Biology. 94 (2), 325-334 (1982).</li>
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<li>Islam, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Signaling%3A+From+Basic+to+Bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium Signaling: From Basic to Bedside.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1131, 1-6 (2020).</li>
<li>De Melo Reis, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+of+cell+phenotypes+differentiating+from+mice+retinal+neurospheres+using+single+cell+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Functional identification of cell phenotypes differentiating from mice retinal neurospheres using single cell calcium imaging.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 31 (6), 835-846 (2011).</li>
<li>Ganguly, K., Schinder, A. F., Wong, S. T., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+itself+promotes+the+developmental+switch+of+neuronal+GABAergic+responses+from+excitation+to+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">GABA itself promotes the developmental switch of neuronal GABAergic responses from excitation to inhibition.</a> Cell. 105 (4), 521-532 (2001).</li>
<li>Schitine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ampakine+CX546+increases+proliferation+and+neuronal+differentiation+in+subventricular+zone+stem%2Fprogenitor+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ampakine CX546 increases proliferation and neuronal differentiation in subventricular zone stem/progenitor cell cultures.</a> European Journal of Neuroscience. 35 (11), 1672-1683 (2012).</li>
<li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+subventricular+zone+oligodendrogenesis%3A+a+role+for+hemopressin%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59(2014).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もありません。

我々は網膜組織を用いて、KClまたはATPによって媒介されるカルシウム応答が、それぞれニューロン応答およびグリア応答に明確に区画化されていることを示した(図1)。文献中のいくつかのデータは、P2X7受容体がニューロンに発現しており、ニューロン活性およびシナプス神経伝達物質の放出を調節することを示唆しているが20、他の著者らはニューロンP2X7受容体の存在に疑問を呈している。実際、現在の結果は、初代グリアP2X7受容体が、不健康な組織に見られる高い細胞外ATP濃度に合計されたニューロン効果を媒介するという考えを支持している21。
我々は以前、KClまたはAMPA(グルタミン酸アゴニスト)によって活性化される[Ca2+]iシフトの変異が成熟ニューロンのマーカーである微小管関連タンパク質(MAP-2)を発現するように、網膜細胞の機能分化を表現型ディスプレイと結びつけ...

セカンドメッセンジャーとしてのカルシウムの普遍的な特性のために、このイオンは、遺伝子転写、誕生と死、増殖、遊走と分化、シナプス伝達、可塑性など、膨大な数のシグナル伝達活動に関与しています。したがって、カルシウム活性化ダイナミクスを忠実度と敏捷性で追跡できる方法は、ユニークな空間 - 時間応答を観察する方法を提供するでしょう。このような方法は、細胞カルシウムイメージング技術であり、カルシウムシフト機能データを、それらの別個の応答に基づいて特定の細胞表現型と相関させる。
Ca2+プローブは1980年代に初めて開発され、後に改良され、これらの分子を生細胞アッセイで使用できるようになりました1。化学的指標として、Fura-2は定量的[Ca2+]i測定の標準であると考えられています。この指標のアセトキシメチル(AM)エステル(すなわち、Fura-2AM)は、細胞膜を容易に透過し、インキュベーション希釈液の20倍大きい細胞内濃度(例えば、[5μM]o/[100μM]i)に達することができる。Fura-2のもう1つの利点は、良好なフォトブリーチング耐性を有することである。したがって、このインジケータを長期間イメージングしても、蛍光能力に大きく影響することはありません。最後に、Fura-2は、〜100nM〜〜100μMの広範囲のカルシウムレベルに感受性であり、〜145nMのKdを有し、これは静止[Ca2+]i2に匹敵する。 その後、細胞カルシウムイメージングは、色素負荷の影響を受けないレシオメトリックプローブとともに、より優れた蛍光顕微鏡と計算方法で開発されました。
すべての細胞は、特定のシグネチャとして最終応答に寄与する異なるカルシウムデバイス(ポンプ、トランスポーター、受容体、およびチャネル)を発現する。重要なヒントは、表現型発現と相関する異なるタイプの細胞の選択的応答を見つけることである。したがって、カルシウムシフトを介して作動する少なくとも2つの異なる受容体が存在する:速いモードでCa2+を透過するイオントロピック受容体およびシグナル伝達経路に結合された遅い代謝指向性受容体およびイノシトール三リン酸および環状ADP-リボース3などのセカンドメッセンジャーによって活性化されたCa2+を放出する細胞内ストック。
例えば、前駆細胞は未熟な網膜でネスチンを発現し、GABA(またはムシモール)によって脱分極されたGABAA受容体を示す4。これは、細胞内の高いCl-レベルを有するCl-電気化学的勾配のために起こる。組織が発達するにつれて、KCC2トランスポーターは、前駆細胞の興奮から成熟GABA作動性ニューロンの阻害に切り替わります5。一方、出生後のげっ歯類の未熟な脳室下帯(SVZ)でsox-2を発現する幹細胞も、ヒスタミンがCa2+をゆっくりと増加させることによって活性化された代謝性H1受容体を提示する6。トロンビンによって活性化され、下流のG(q/11)およびホスホリパーゼC(PLC)に活性化されたプロテアーゼ活性化受容体-1(PAR-1)ファミリーの第2の代謝型受容体は、多能性SVZ神経幹細胞から生成された希突起膠細胞(O4およびPLPを発現する)にゆっくりとしたCa2+シフトを与える7。
一般に、ニューロンは、電位依存性カルシウムチャネルならびにCa2+に透過性の主要な神経伝達物質受容体を、グルタミン酸作動性(AMPA、NMDA、カイネート)および末梢および中枢ニコチン性受容体として発現する。塩化カリウムは、通常、末梢ニューロンを活性化するための脱分極剤として、後根神経節ニューロン8または中枢ニューロンとして、脳室下帯9または網膜10からのように使用される。一方、ATPは、P2X7およびP2X4として、選択的Ca2+透過性P2Xメンバーを活性化する主要なグリオトランスミッタ(D-セリンに加えて)として認められている。両方の受容体は同等のCa2+電流を呈し、伝達物質11によって活性化される最大のCa2+電流として認識されているNMDA受容体によって示されるものと同様である。P2X7受容体はミクログリア上では高発現するが、アストロサイトおよび希突起膠細胞上ではより低い密度で、炎症誘発性サイトカインの放出に役割を有する12。P2X7受容体は網膜のシュワン細胞13とミュラーグリアにも発現しています14,15。
網膜は、脳内に見られるほとんどすべての伝達物質を示すことが知られています。例えば、縦軸(光受容体、双極性および網膜神経節細胞)は主にグルタミン酸作動性であり、カルシウム透過性AMPAまたはカイニン酸塩受容体はOFFバイポーラ細胞で発現し、mgluR6はONバイポーラ細胞で発現する16。奇妙なことに、3つの受容体はすべてミュラーグリアにも見られ、カルシウムとイノシトールの三リン酸経路に結合されています17,18。水平阻害軸は、水平およびアマクリン細胞によって作られ、GABAだけでなく、ドーパミン、アセチルコリン、および他の古典的な神経伝達物質も分泌する。アマクリン細胞は、鳥網膜培養物に見られる細胞の主なタイプであり、グルタミン酸作動性、プリン作動性、ニコチン性および電圧依存性カルシウムチャネルとして、いくつかのタイプのカルシウム操作チャネルを示す。このため、これはニューロンとグリアの間でカルシウムシフトの異なる特性を評価するための優れたモデルである。
したがって、異なる受容体およびチャネルの組み合わせは、異なるアゴニスト応答パターンを有する発生中に選択的表現型マーカーに合計され、選択的シグナル伝達装置を介して作動するステム、前駆細胞、ニューロン、アストロサイト、希突起膠細胞、およびミクログリアにおけるユニークなシグネチャを可能にする。

<table><tbody><tr><td>15 mm カバーガラス</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>111550</td><td>セルサポート</td></tr><tr><td>510 nm ロングパスフィルター</td><td>カールツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A1852</td><td></td></tr><tr><td>B-27 サプリメント</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Suplement</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>CoolSNAP デジタルカメラ</td><td>ローパーサイエンティフィック、ニュージャージー州</td><td></td><td></td>トレントン</tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>ネオン</td><td>1466</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/ F-12</td><td>Gibco</td><td>12400-24</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>Excel ソフトウェア</td><td>マイクロソフト</td><td></td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児 血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td>補助</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Axiovert 200;カールツァイス</td><td>B 40-080</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>分子プローブ</td><td>F1221</td><td>レシオメトリック Ca2+ インジケータ</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン 硫酸塩</td><td>カルビオケム</td><td>1405-41-0</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>シグマ</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>シグマ</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>ラムダDG-4 装置</td><td>Sutter Instrument, Novato, CA</td><td>DG-4PLUS/OF30</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Gibco</td><td>23017-015</td><td>細胞接着を助ける</td></tr><tr><td>Metafluor software</td><td>Universal Imaging Corp. West Chester, PA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M4880</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Vetec</td><td>129</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Isofar</td><td>310</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Vetec</td><td>306</td><td></td></tr><tr><td>PH3 platform</td><td>Warner Intruments, Hamden, CT</td><td>64-0286</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Molecular Probes</td><td>P6866</td><td>nonionic, surfactant</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>細胞接着を助ける</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA0.25%</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>解離酵素</td></tr></tbody></table>

カルシウムイメージング技術によるニューロン-グリア回路の変化の可視化

Visualizing Shifts on Neuron-Glia Circuit with the Calcium Imaging Technique

ここでは、カルシウムシフトの観点から動的に研究されたグリア(アストロサイト、希突起膠細胞、ミクログリア)および/または末梢(後根神経節)および中枢組織(皮質、脳室下帯、オルガノイド)からのニューロンに基づく回路の選択的in vitroモデルについて報告する。結果を説明するために選択されたモデルは網膜であり、複雑な細胞相互作用を有する単純な組織である。カルシウムは、重要な細胞の役割のほとんどに関与する普遍的なメッセンジャーです。我々は、培養中の網膜ニューロングリア細胞がどのように調製され、評価され、カルシウムシフトを想定することができるかを段階的なプロトコルで説明する。このモデルでは、KClおよびATPに対する選択的応答に基づいてニューロンをグリアと区別する。カルシウム透過性受容体およびチャネルは、異なる区画において選択的に発現される。カルシウム応答を分析するために、我々はFura-2のようなレシオメトリック蛍光ダイスを使用する。このプローブは、Ca2+非含有およびCa2+結合形態に基づいて遊離Ca2+濃度を定量し、2つの波長で知覚される蛍光強度に基づいて2つの異なるピークを提示する。

ここでは、胚発生8日目のひよこからの培養中の網膜細胞を用いて、ニューロンとグリアのシグナルがカルシウムシフトでどのように変化するかを調べた。培養物は、本質的に記載されているように15,19を混合ニューロングリア細胞として(≥1 x 106細胞/ディッシュの密度で)インビトロで7日間の段階で調製した(図1A)。あるいは、低密度で調製した濃縮ニューロン細胞(5 x 105細胞/ディッシュ)を、インビトロで3日間の段階で処理したポリ-L-リジン(10 μg/mL)カバーグラス上に播種する(図1B<p class="jove_content" fo:keep-together.wit...

細胞カルシウムイメージングは、ユニークな機能的シグネチャを与えるカルシウム透過性チャネル/受容体の発現に基づいて、培養中の混合集団、または覚醒した動物でさえも、個々の細胞の動的シグナル伝達を研究するための汎用性の高い方法論です。

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral ...

この手順の全体的な目標は、塩化カリウムまたはATP刺激に基づいてニューロンまたはグリア応答を分化させるために、生細胞における細胞質ゾルカルシウム濃度の変化を監視することである。カルシウムは、神経伝達、可塑性、およびアポトーシスを含むいくつかの細胞プロセスに関与する重要なセカンドメッセンジャーである。Fura-2 AMなどの高選択的蛍光カルシウム色素の出現は、より優れた蛍光顕微鏡および計算方法の開発に関連して、生きた細胞および生物上のカルシウムシグナル伝達を画像化するために、高度の空間的および時間的分解能を有する高解像度光学データをもたらした。このプロトコルは、富化ニューロン、精製グリア、または混合集団培養物に適応可能である。これは、塩化カリウムおよびATPに対する差動応答に基づいて、どの細胞型が決定的な刺激に応答したかを追跡する。塩化カリウムは細胞の膜電位を変化させます。そして、これはニューロンによって本質的に発現される電圧ゲート化カルシウムチャネルを開く。一方、ATPはP2X7大部分チャネルを活性化し、主にグリア細胞に存在する。塩化カリウムおよびATP刺激を他の薬物と結合させることによって、細胞内カルシウム濃度の増加に基づいて、神経系のどの区画がそれらに応答しているかを見ることができる。この手順では、いくつかの手術器具やピンセットが必要になります。バイオセーフティキャビネットを使用し、汚染を避けるためにベストプラクティスを実行します。鶏網膜培養を開始するには、空気細胞が位置する底のそばで受精卵を慎重に開きます。内容物をペトリ皿に取り出し、一対のピンセットで断頭して胚提供を進める。頭が取り除かれたら、それをきれいなペトリ皿に持ってきて、それにカルシウムとマグネシウムを含まない溶液を加えます。次に、その過程で目を傷つけないように注意しながら、目を取り除きます。CMF溶液を含む別のペトリ皿に目を持って行きます。ピンセットのペアで、レンズを取り外して目を解剖し始めます。次に、レンズによって残された穴から始めて、眼に3つまたは4つの縦方向の切り込みを行う。透明な硝子体を慎重に取り外してください。網膜がそれに結合していないことを確認してください。次に、色素沈着した上皮から網膜を静かに剥離する。残りの上皮組織をすべて除去する。網膜が完全に透明になったら、それを細かく切ります。自動ピペットの助けを借りてすべての網膜組織を取ります。網膜を短時間遠心分離し、全てのCMFを除去した。1mLの0.25%トリプシンを加える。そして、組織を37°Cで10分間インキュベートした。10%ウシ胎児血清を含む培地1mLを加えてトリプシン反応を停止させる。網膜を遠心分離してすべてのトリプシンを除去します。細胞を10%FCSを含む培地で2〜3回洗浄する。次に、網膜あたり2mLの培地を加え、穏やかに機械的に解離させる。血球計数器で適切にカウントできるように細胞を希釈します。使用 15 ミリ ポリ-L-リジンとラミニンで保護されたカバースリップは、細胞の接着を助けます.希釈した細胞を各カバースリップに50 Lピペットで貼り付けます。細胞を5%CO2雰囲気中の37°Cでインキュベートする。そして、ガラスを取り付けるためにそれらを冷やします。これには約1〜2時間かかります。1mLの培地を加え、実験日までインキュベーターに戻した。必要に応じて、2〜3日ごとに培地の半分を交換してください。Fura-2 AMの50gバイアルを50LのDMSOで再構成する。Krebs溶液は、蛍光測定を妨げないため、実験中に細胞を移すための良い選択肢です。開始する前に、ソリューションを 37 に予熱します。ポロクサマー 407 を追加します。Fura-2 AM と DMSO を追加します。水浴中で7分間超音波処理する。クレブス溶液を3つのウェルに加える6ウェルプレートを作製し、別のウェルにFura-2溶液を作用させた。Fura-2ウェルに加える前に、細胞が入ったカバースリップを3回洗ってください。細胞を37°Cおよび5%CO2雰囲気で暗所インキュベーター内で30分間インキュベートする。インキュベーション後、もう一度3回洗ってください。クレブスを含む別の受信者に転送し、光から保護します。調製したFura-2を再利用して、より多くのカバースリップを細胞と共にインキュベートすることができる。各実行前にカバースリップサポートとチャンバーにシリコンを追加して、溶液の漏れを防ぎます。クレブス溶液からカバースリップを取り出し、顕微鏡レンズの塩の結晶化を避けるために蒸留水で底を慎重に洗ってください。カバースリップを支持体の上に置き、境界線を慎重に押します。カバースリップ支持体とチャンバーを顕微鏡に取り付け、Krebs溶液で細胞の灌流を開始します。適切なセルを選択し、適切なフィールドを選択します。異なる形態に基づいて細胞体を選択することにより、関心のある領域を手動で決定する。カルシウム濃度の変動を、340および380nmでの交互励起に続いて510nmで放出される蛍光の比を定量することによって評価した。塩化カリウムを添加すると、多くの細胞が光り輝き、蛍光応答がグラフ上に上昇するのを見ることができます。塩化カリウムは、電圧ゲート付きカルシウムチャネルを開き、主にニューロンに提示する。グラフ上の個々の線は、一意の関心領域を表します。したがって、実験中に個々の細胞応答を追跡することができる。ATP刺激は、グリア細胞によって本質的に発現されるP2X7受容体を開く。これは豊かなニューロン文化です。したがって、ここにはグリア細胞はほとんどありません。これが、ATP刺激に反応する細胞が非常に少ない理由です。取得した値は、Metafluorソフトウェアを使用して処理されました。実験結果は Excel テーブルで表され、各行は個々のセルを表し、各行はタイム ポイントを表します。Excelソフトウェアを使用すると、個々の細胞のカルシウム変動を別々に、またはそれらのすべてのカルシウム変動を同じグラフでプロットすることができます。任意の刺激に対する反応性細胞の量を定量化するには、カルシウムベースラインレベルを増加させる30%のカットオフを設定します。ここでは、胚発生8日目のひよこの培養中の網膜細胞を用いて、50mmの塩化カリウムと1mmのATP刺激を受けた後、カルシウムの観点からニューロンとグリアシグナルがどのように変化するかを調べます。各実験において、約100個の細胞が容易に分析された。図Aは、ニューロンとグリアの両方を含む混合培養物を表し、1週間維持した。応答を定量化すると、分析された細胞の約半分が塩化カリウムに答え、残りの半分がATPに応答したことがわかります。図Bは、ニューロン富化培養物を指す。それはわずか3日間インキュベートされたので、ほとんどのグリア細胞はまだ分化していない。この場合、細胞の89%が塩化カリウムに答え、ニューロンの有病率を補強する。図Cは、精製グリア培養物を示す。これらの細胞を3日ごとに培地交換しながら10日間維持した。その後、ほとんどのニューロンが死に、グリアだけが残ります。実際、この培養物はATPによってのみ活性化された。この方法論は、セカンドメッセンジャーとしてのカルシウムの普遍的な性質のために広く使用されてきた。表現型解析は、カルシウムイメージング後の固定細胞の免疫化学でこの方法論を補完することによって強化することができます。このプロトコールはまた、他のカルシウムチャネルを発現する他の混合細胞系にも適合させることができる。重要なヒントは、表現型発現と相関する異なるタイプの細胞の選択的応答を見つけることである。

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Research

JoVE Journal

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カルシウムイメージング技術によるニューロン-グリア回路の変化の可視化

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