Name: ヘモグロビンの脳室内注射による新生児脳室内出血のモデリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T12:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 学ぼう、ヘモグロビンを新生児ラットの脳室に注入して脳室内出血後の水頭症を誘導する方法。この再現性の高いモデルは、MRIによる脳室容積の定量化と新規治療戦略の評価に有用です。

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JMSは、NIH/NINDS R01 NS110793およびK12(脳神経外科医研究キャリア開発プログラム)から資金提供を受けました。BAMは、NIH / NINDS K08 NS112580-01A1、ケンタッキー大学神経科学研究優先地域賞、および 水頭症協会 イノベーター賞から資金提供を受けました。

注:すべての動物プロトコルは、施設の動物管理および使用委員会によって承認されました。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、機器、およびソフトウェアの詳細については、 材料の表 を参照してください。
1.ヘモグロビンおよびCSF溶液の調製
<ol><li>500 μLのaCSF溶液を1.5 mLマイクロチューブに加えて滅菌人工CSF(aCSF)溶液を調製し、氷上で保存します。</li>
	<li>1.5 mLマイクロチューブ中の500 μLのaCSFに75 mgのヘモグロビンを加えて滅菌済みの150 mg/mLヘモグロビン溶液を調製し、氷上で保存します。</li>
</ol>2.注射用動物の準備
<ol><li>ラットの体温を維持するために、加熱パッドを中程度の設定に回します。</li>
	<li>生後4日目(P4)ラットを3%イソフルランで満たされた誘導チャンバーで麻酔します。 注意: 15分ごとにつま先/尾のピンチ応答を使用して十分な麻酔を確認します。組織の色、体温、呼吸数を目視観察して麻酔を監視します。</li>
	<li>麻酔をかけたラットに5 mg / kgの皮下カルプロフェン注射で痛みを和らげます。.</li>
	<li>麻酔をかけたラットを定位装置に入れ、鼻を麻酔アダプターに配置し、1.5%イソフルランの一定の流れで配置します。</li>
	<li>外耳道の破裂しないイヤーバーを締めて、頭を固定します。 注:注射の年齢で目が開いている場合は、目を潤いを保つために獣医軟膏を塗布してください。</li>
	<li>ベタジンと70%エタノールに浸した滅菌綿先端アプリケーターと交互に頭をきれいにします。<ol><li>ベタジンに浸したアプリケーターを頭皮の中心に触れ、ベタジンを円を描くように広げ、外側に移動します。</li>
		<li>エタノールに浸したアプリケーターで手順2.6.1.1を繰り返します。</li>
		<li>ステップ 2.6.1.1 とステップ 2.6.1.2 を 3 回繰り返します。</li>
	</ol></li>
	<li>手術野を保護するために、滅菌手術用ドレープを適用します。</li>
	<li>滅菌メスを使用して、頭の中央を垂直に0.3 cm切開し、頭蓋骨のブレグマを露出させます。 注:ラムダから注入する場合は、ブレグマの代わりに頭蓋骨のラムダを露出させます。</li>
	<li>滅菌綿先端のアプリケーターを使用して、その領域を乾燥させます。</li>
</ol>3.定位インジェクターのセットアップ
<ol><li>ステップ1.2で調製したヘモグロビン溶液を30G針付きの0.3mL滅菌シリンジに引き込み、シリンジを定位インジェクターシステムに入れます。 注:制御条件を生成する場合は、手順1.1で調製したaCSF溶液を0.3 mL滅菌シリンジに引き込み、プロトコルに進みます。</li>
	<li>定位インジェクターインターフェースをオンにし、 構成 ボタンをクリックして、注入量と速度の設定を入力します。<ol><li>容量をクリックし、容量を20,000 nL(20 μL)に設定します。</li>
		<li>注入速度をクリックし、 速度 を 8,000 nL /分(8 μL/分)に設定します。</li>
	</ol></li>
	<li>[Posのリセット]ボタンをクリックして構成を終了します。</li>
	<li>ヘモグロビン溶液の小さなビーズが針先に現れるまで、 Infuse ボタンをクリックして針先を洗い流します。</li>
	<li>滅菌綿先端のアプリケーターで針先からヘモグロビン溶液をそっと吸い取ります。</li>
</ol>4.動物注射
<ol><li>シリンジの中外側と前後の位置を調整して定位インジェクターシステムでブレグマをゼロに設定してから、フラッシュしたシリンジ針の先端を下げてブレグマの頭蓋骨にそっと触れます。 注: ラムダから注入する場合は、 ラムダ を ゼロに設定します。</li>
	<li>選択した座標を特定します。<ol><li>ブレグマから注射する場合、ここに記載の P4ラット では、 ブレグマから外側1.5 mm、前方0.4 mm、深さ2.0 mmを使用します。</li>
		<li>ラムダから注射する場合は、P4ラットに次の座標を使用します :ラムダから1.1 mmの外側、4.6 mm前方、および3.3 mmの深さ。</li>
	</ol></li>
	<li>シリンジ針を頭蓋骨から1 cm上に上げて頭皮をきれいにします。シリンジが上がったら、中外側座標と前後座標の設定に進みます。</li>
	<li>注射針を下げて頭蓋骨にそっと触れます。針が頭蓋骨に触れていることを確認します。</li>
	<li>背腹座標を30秒の期間に設定します。 注意: 背腹座標を設定している間、針は頭蓋骨に穴を開けます。注射器が頭蓋骨を変形させることなく頭蓋骨を通過するように注意する必要があります。頭蓋骨の変形は、変形が発生した場合に背腹座標に沿って針をゆっくりと引き抜き、同じ軌道に沿って針を戻すことで回避されます。これにより、針はより少ない力と変形なしに頭蓋骨の穴を通過することができます。</li>
	<li>定位インジェクターインターフェースで、[ 実行 ]ボタンをクリックしてインジェクションを開始します。</li>
	<li>注入が終了したら、溶液の逆流を最小限に抑えるために、シリンジ針を2分間そのままにします。</li>
	<li>針先が頭皮から2cm上になるまで、背腹座標に沿って2分間ゆっくりと注射器を引き出します。</li>
	<li>定位インジェクターアームを回転させて術野から離します。</li>
</ol>5.術後ケア
<ol><li>6-0モノフィラメント縫合糸で頭皮を閉じます。0.3 cmの切開の中心に1つの簡単な中断縫合糸を作成します。</li>
	<li>子犬を麻酔から外し、加熱パッドの安全な場所に置きます。</li>
	<li>げっ歯類をホームケージに戻し、ダムの世話の下で麻酔から回復します。 注:ダムのケアにタイムリーに戻ると、術後早期死亡率が低下します。</li>
	<li>手術後3時間ごとに右反射が失われ、動物の麻酔を監視します。</li>
	<li>通常の活動、食物摂取、および体重増加について、動物を7日間毎日監視します。手術部位での創傷治癒、閉鎖、および毛皮の再現について切開部位を監視します。 注:モニタリング中に発作、中枢性うつ病、食欲減退などの神経学的変化が観察されるまれなケースでは、麻酔下で血管内灌流または頸部脱臼を使用して動物を安楽死させます。.</li>
	<li>縫合糸が閉じられ、創傷が治癒した後の感染を防ぐために、切開部位に局所トリプル抗生物質を適用します。</li>
</ol>6. MRIの取得と定量
<ol><li>4.7Tまたは9.4T小動物スキャナーでMRIを実行します。</li>
	<li>ラットの体温を維持するために、加熱パッドを中程度の設定に回します。</li>
	<li>3%イソフルランを使用してチャンバー内で麻酔を誘発する。 注意: 15分ごとにつま先/尾のピンチ応答を使用して十分な麻酔を確認します。組織の色、体温、呼吸数を目視観察して麻酔を監視します。</li>
	<li>麻酔をかけたラットをMRIにうつ伏せにして、鼻を麻酔アダプターに配置し、1.5%イソフルランの一定の流れで配置します。</li>
	<li>T2強調高速スピンエコーシーケンスを選択して、T2強調イメージングを実行します。<ol><li>4.7T MRIスキャナーを使用する場合は、MRIソフトウェアに次のパラメータを入力します:繰り返し時間= 3,000ミリ秒、エコー時間= 27.50ミリ秒、平均数= 3、視野= 18.0 mm x 18.0 mm、マトリックス= 128 x 128、軸方向スライスの数= 24、厚さ= 0.50 mm。</li>
		<li>9.4T MRIスキャナーを使用する場合は、MRIソフトウェアに次のパラメータを入力します:繰り返し時間= 5,000ミリ秒、エコー時間= 66.00ミリ秒、エコー間隔= 16.50ミリ秒、平均数= 2、繰り返し= 1、まれ係数= 8、視野= 16.0 mm x 16.0 mm、マトリックス= 256 x 256、軸方向スライスの数= 32、厚さ= 0.50 mm。</li>
	</ol></li>
	<li>[ 続行 ]ボタンをクリックして、シーケンスを開始します。</li>
</ol>7. 画像処理・解析
<ol><li>ネイティブのT2強調データを使用して、脳の体積を分析します。セグメンテーションソフトウェアを使用して、側脳室6を手動で描写します。ペイントブラシ モード をクリックして、 正方形のブラシ スタイルを選択します。ブラシサイズを 1に調整します。 [レイアウトインスペクター] をクリックし 、 軸方向ビューを選択します。 [ズーム] をクリックして合わせます。画像にカーソルを置きます。側脳室腔をトレースして埋めます。</li>
	<li>ツールバーの [セグメンテーション ]をクリックします |ボリュームと統計 : セグメント化されたボリュームを表示します。</li>
</ol>

<ol><li>Robinson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+posthemorrhagic+hydrocephalus+from+prematurity%3A+Pathophysiology+and+current+treatment+concepts%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%3A+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Neonatal posthemorrhagic hydrocephalus from prematurity: Pathophysiology and current treatment concepts: A review.</a> Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 9 (3), (2012).</li>
<li>Hasselager, A. B., Børch, K., Pryds, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+in+perinatal+care+for+extremely+premature+infants+in+Denmark+from%5BTitle%5D)+AND+%22Danish+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Improvement in perinatal care for extremely premature infants in Denmark from.</a> Danish Medical Journal. 63 (1), to (1994).</li>
<li>Johnston, P. G., Gillam-Krakauer, M., Fuller, M. P., Reese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence-Based+Use+of+Indomethacin+and+Ibuprofen+in+the+Neonatal+Intensive+Care+Unit%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Perinatology%22%5BJournal%5D)">Evidence-Based Use of Indomethacin and Ibuprofen in the Neonatal Intensive Care Unit.</a> Clinics in Perinatology. 39 (1), (2012).</li>
<li>Mahaney, K. B., Buddhala, C., Paturu, M., Morales, D., Limbrick, D. D., Strahle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraventricular+Hemorrhage+Clearance+in+Human+Neonatal+Cerebrospinal+Fluid%3A+Associations+with+Hydrocephalus%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Intraventricular Hemorrhage Clearance in Human Neonatal Cerebrospinal Fluid: Associations with Hydrocephalus.</a> Stroke. , (2020).</li>
<li>Strahle, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+CSF+Iron+Pathway+Proteins+in+Posthemorrhagic+Hydrocephalus%3A+Associations+with+Ventricle+Size+and+Neurodevelopmental+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Longitudinal CSF Iron Pathway Proteins in Posthemorrhagic Hydrocephalus: Associations with Ventricle Size and Neurodevelopmental Outcomes.</a> Annals of Neurology. 90 (2), (2021).</li>
<li>Strahle, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Hemoglobin+and+Iron+in+hydrocephalus+after+neonatal+intraventricular+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Role of Hemoglobin and Iron in hydrocephalus after neonatal intraventricular hemorrhage.</a> Neurosurgery. 75 (6), (2014).</li>
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<li>Goulding, D. S., Caleb Vogel,, Gensel, R., Morganti, J. C., Stromberg, J. M., Miller, A. J., A, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+brain+inflammation%2C+white+matter+oxidative+stress%2C+and+myelin+deficiency+in+a+model+of+neonatal+intraventricular+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%3A+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Acute brain inflammation, white matter oxidative stress, and myelin deficiency in a model of neonatal intraventricular hemorrhage.</a> Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 26 (6), (2020).</li>
<li>Strahle, J., Garton, H. J. L., Maher, C. O., Muraszko, K. M., Keep, R. F., Xi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Hydrocephalus+After+Neonatal+and+Adult+Intraventricular+Hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Stroke+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Hydrocephalus After Neonatal and Adult Intraventricular Hemorrhage.</a> Translational Stroke Research. 3, (2012).</li>
<li>Jinnai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Model+of+Germinal+Matrix+Hemorrhage+in+Preterm+Rat+Pups%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Model of Germinal Matrix Hemorrhage in Preterm Rat Pups.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).</li>
<li>Georgiadis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+acute+brain+injuries+and+neurobehavioral+profiles+in+a+rabbit+model+of+germinal+matrix+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Characterization of acute brain injuries and neurobehavioral profiles in a rabbit model of germinal matrix hemorrhage.</a> Stroke. 39 (12), (2008).</li>
<li>Cherian, S. S., Love, S., Silver, I. A., Porter, H. J., Whitelaw, A. G. L., Thoresen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posthemorrhagic+ventricular+dilation+in+the+neonate%3A+Development+and+characterization+of+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Posthemorrhagic ventricular dilation in the neonate: Development and characterization of a rat model.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 62 (3), (2003).</li>
<li>Balasubramaniam, J., Xue, M., Buist, R. J., Ivanco, T. L., Natuik, S., del Bigio,, R, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+motor+deficit+following+infusion+of+autologous+blood+into+the+periventricular+region+of+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Persistent motor deficit following infusion of autologous blood into the periventricular region of neonatal rats.</a> Experimental Neurology. (1), (2006).</li>
<li>Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+injury+in+premature+infants%3A+a+complex+amalgam+of+destructive+and+developmental+disturbances%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances.</a> The Lancet Neurology. 8 (1), (2009).</li>
<li>Dobbing, J., Sands, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+the+brain+growth+spurt%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Human+Development%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of the brain growth spurt.</a> Early Human Development. 3 (1), (1979).</li>
<li>Craig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Experimental Neurology. 181 (2), (2003).</li>
<li>Lodygensky, G. A., Vasung, L., Sv Sizonenko,, Hüppi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimaging+of+cortical+development+and+brain+connectivity+in+human+newborns+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Neuroimaging of cortical development and brain connectivity in human newborns and animal models.</a> Journal of Anatomy. 217 (4), (2010).</li>
<li>Dean, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+differences+in+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Developmental Neuroscience. 33 (34), (2011).</li>
<li>Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Development of the blood-brain barrier.</a> Cell and Tissue Research. 314 (1), (2003).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+required+for+blood%C4%9D%E2%82%AC%26%2334%3Bbrain+barrier+integrity+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes are required for bloodĝ€&#34;brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468 (7323), (2010).</li>
<li>Alles, Y. C. J., Greggio, S., Alles, R. M., Azevedo, P. N., Xavier, L. L., DaCosta, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+preclinical+rodent+model+of+collagenase-induced+germinal+matrix%2Fintraventricular+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">A novel preclinical rodent model of collagenase-induced germinal matrix/intraventricular hemorrhage.</a> Brain Research. 1356, (2010).</li>
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</ol>

著者は、利益相反がないことを宣言します。

ヘモグロビン注射を利用するこのIVHモデルは、ヘモグロビンによって特異的に媒介されるIVHの病理学の研究を可能にする。補完的な研究のために、ヘモグロビンは in vitro でも簡単に送達することができ、全血中に存在するミクログリア/マクロファージによって作られたタンパク質の生化学的アッセイを混乱させません。
IVH-PHHの主要な理論には、CSF循環の機械的閉塞、上衣壁の内側を覆う繊毛の破壊、炎症、線維症、および鉄毒性が含まれます10。コラゲナーゼ誘導ラット仔モデルなどのIVHの既存の動物モデルは、細胞外マトリックスの直接損傷および破壊を介してIVHを誘導する11が、グリセロール誘発ウサギ仔モデルなどの他のモデルは、頭蓋内低血圧の効果としてIVHを誘導する12。追加のモデルは、側脳室13、 14への自家お...

新生児IVHは、発達中の脳の側脳室に隣接する急速な細胞分裂の部位である胚マトリックスに由来します。この高度に血管構造は、早産に関連する血行動態不安定性に対して脆弱である。胚基質出血(GMH)-IVHでは、胚基質内の脆弱な血管が破裂すると、血液が側脳室に放出されます。グレードIVのIVHの場合、脳室周囲出血性梗塞も脳内の血液製剤の放出に寄与する可能性があります。1 GMH-IVHの組み合わせは、特に高悪性度出血(グレードIIIおよびIV)1の後にPHHを引き起こす可能性があります。PHHは心室腹腔シャントの留置で治療できますが、シャントの留置はIVHから発生する可能性のある脳損傷を元に戻すものではありません。現代の新生児集中治療室ではIVH 2,3の発生率が低下していますが、一度発生したIVHによって引き起こされる脳損傷や水頭症に対する特定の治療法はありません。IVH誘発性脳損傷およびPHHの予防的治療法の開発における重大な制限は、IVH病態生理学の不完全な理解である。
最近、主要な血液分解産物ヘモグロビンの初期CSFレベルは、高悪性度のIVH4を有する新生児におけるPHHの後期発症と関連していることが示されている。さらに、鉄処理経路タンパク質(ヘモグロビン、フェリチン、ビリルビン)のCSFレベルは、新生児IVHの心室サイズに関連しています。これは、早産PHHの乳児の多施設コホートでも示され、フェリチンの心室CSFレベルが高いほど、心室サイズが大きくなりました5。
本研究では、脳室へのヘモグロビン注入を利用したIVH誘発性脳損傷と水頭症の臨床的関連モデルを開発し、脳損傷とPHHの定量化と新しい治療戦略の検証を可能にしました(図1)6、 7。このIVHモデルは、処置期間中全身麻酔下に置かれる新生児ラットの子犬を利用します。頭皮に正中線切開を行い、頭蓋骨のランドマーク(ブレグマまたはラムダ)に由来する座標を使用して、側脳室を注射の対象にします。輸液ポンプを使用したゆっくりとした注射は、ヘモグロビンを心室に送達します。このプロトコルは使いやすく、用途が広く、PHHをもたらすIVHのさまざまなコンポーネントをモデル化できます。

<table><tbody><tr><td>0.3 mL インスリン シリンジ</td><td>BD Microfine + Insulin Syringe</td><td>230-4533</td><td>0.3-0.5 mL シンリンジは機能します</td></tr><tr><td>1.5 mL マイクロチューブ</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>ロット番号 K194642H -3 511</td></tr><tr><td>4.7T MRI</td><td>Agilent/Varian</td><td>4.7T/33 cm</td><td>Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI System</td></tr><tr><td>6-0 モノフィラメント縫合糸</td><td>ETHICON</td><td>667G</td><td></td></tr><tr><td>9.4TMRI</td><td>Bruker</td><td>BioSpec 94/20</td><td>クライオプローブなしでこのプロトコルで使用</td></tr><tr><td>分析バランス</td><td>CCURIS Instruments</td><td>W3200-320</td><td></td></tr><tr><td>人工 CSF (aCSF)</td> <td>Tocris Bioscience</td><td>3525</td><td>バッチ番号: 72A</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>301005-00</td><td>NDC 67618-150-09</td></tr><tr><td>カルプロフェン(注射剤)</td><td>Zoetis Inc.&nbsp;</td><td>PI</td><td>4019448 Rimadyl</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>加熱パッド</td><td>Sunbeam</td><td>E12107-819</td><td>UL 612A、Z-1228-001</td></tr><tr><td>ヘモグロビン</td><td>MP バイオメディカル 100714</td><td></td><td>ロット番号 SR02321</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ピラマル クリティカル ケア</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン気化器</td><td>VETEQUIP</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>定位装置用ライト</td><td>Dolan-Jenner industries</td><td>Fiber-Lite MI-150</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクションシリンジポンプ</td><td>World Precision Instruments</td><td>MICRO21</td><td>Serial 184034 T08K</td></tr><tr><td>MRIソフトウェア</td><td>Bruker BioSpin</td><td>Paravision 360 3.2</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>Airgas Healthcare</td><td>UN1072</td><td>LOT NUMBER S1432080XA02</td></tr><tr><td>Sprague Dawley ラット</td><td>チャールズリバー研究所</td>ひずみ<td>コード:001</td><td></td></tr>定<tr><td>位機器</td><td>KOPFインスチュメント</td><td>モデル900LS怠惰なスーザン</td><td></td></tr><tr><td>滅菌綿チップアプリケーターFischerbrand</td><td></td><td>23-400-118</td><td></td></tr>外科<tr><td>用ブレード</td><td>コヴェラス</td><td>#10</td><td></td></tr><tr><td>局所トリプル</td><td>抗生物質軟膏</td><td>NDC 51672-2120-1</td><td></td></tr><tr><td>心室容積定量化ソフト</td><td>ITK-SNAP</td><td>ITK-SNAP 4.0.0 beta</td><td></td></tr></tbody></table>

ヘモグロビンの脳室内注射による新生児脳室内出血のモデリング

Modeling Neonatal Intraventricular Hemorrhage Through Intraventricular Injection of Hemoglobin

新生児脳室内出血(IVH)は早産の一般的な結果であり、脳損傷、出血後水頭症(PHH)、および生涯にわたる神経学的欠損につながります。PHHは一時的および恒久的な脳脊髄液(CSF)の迂回手順(それぞれ心室リザーバーと心室腹腔シャント)で治療できますが、IVH誘発性脳損傷と水頭症を予防または治療するための薬理学的戦略はありません。IVHの病態生理学をよりよく理解し、薬理学的治療をテストするには、動物モデルが必要です。新生児IVHの既存のモデルがありますが、水頭症を確実にもたらすモデルは、大量の注射の必要性によって制限されることが多く、病状のモデリングを複雑にしたり、観察される臨床表現型の変動を引き起こしたりする可能性があります。
最近の臨床研究では、ヘモグロビンとフェリチンがIVH後の心室肥大を引き起こすことが示唆されています。ここでは、血液破壊産物ヘモグロビンの少量の脳室内注射を利用して、PHHの臨床表現型を模倣した簡単な動物モデルを開発します。このモデルは、心室肥大と水頭症を確実に誘発することに加えて、脳室周囲および白質領域に白質損傷、炎症、および免疫細胞浸潤をもたらします。この論文では、脳室内注射を使用して新生児ラットのIVH-PHHをモデル化するためのこの臨床的に関連する簡単な方法について説明し、注射後の心室サイズを定量化する方法を示します。

注射の成功は、放射線学的および免疫組織化学的手段によって確認された。ヘモグロビン注射を受けた動物は、MRIで評価すると中等度の急性心室腫大を発症し(図2A)、ヘモグロビン注射後24時間および72時間で側脳室が有意に大きくなりました(図2B、C)。注射後38日目のヘモグロビン注射動物とCSF注射動物の間で側脳室容積に有意差はありませんでしたが(図2D)、注射後38日目まで追跡されたヘモグロビン注射群の動物の44%(4/9)がこの時点で未解決の心室腫大を示したことに注意することが重要です(図2D).心室サイズのこの広い分布は、IVH-PHHの臨床経過と一致するパターンです。また、注射後38日目の時点で白質体積を定量したところ(図3)、ヘモグロビン注入群ではaCSF注入群と比較して有意に減少した(<strong c...

ラットの仔を用いた新生児脳室内出血のモデルを提示し、ヒトに見られる病態を模倣した。

Neonatal intraventricular hemorrhage (IVH) is a common consequence of premature birth and leads to brain injury, posthemorrhagic hydrocephalus (PHH), and ...

このプロトコルは、IVH誘発性脳損傷と水頭症の臨床的に関連するモデルを開発し、心室へのヘモグロビン注射を利用して、新しい治療戦略をテストするための心室容積のその後の定量を可能にするため、重要です。この技術の主な利点は、ヘモグロビンおよび鉄経路血液分解産物によって特異的に媒介されるIVHの病理学の研究を可能にすることである。この手法も使いやすく、用途が広いです。この技術の意味は、IVHの病態生理学のさらなる理解と、IVH後の神経学的後遺症の予防のための臨床的に関連する治療戦略の評価を可能にするため、出血後水頭症の治療法の開発にまで及びます。手順を実演するのは、オーストラリア研究所のアソシエイトポスドクであるスルティラマギリです。まず、麻酔をかけたラットを定位装置に入れ、鼻を麻酔アダプターに配置します。次に、外耳道の破裂していないイヤーバーを締めて頭を固定します。頭をきれいにするには、まず頭の中心にあるベタジンに浸した滅菌綿の先端のアプリケーターに触れ、外側に移動してベタジンを円を描くように広げます。次に、70%エタノールに浸したアプリケーターでこのプロセスを繰り返します。次に、メスを使用して、頭の中央を垂直に0.3センチメートル切開して、頭蓋骨の頭蓋骨を露出させます。次に、綿の先端のアプリケーターを使用して領域を乾かします。定位インジェクターをセットアップするには、事前に調製したヘモグロビン溶液を0.3または0.5ミリリットルのシリンジに引き込み、シリンジを定位インジェクターシステムに入れます。次に、定位インジェクターインターフェースをオンにし、構成ボタンをクリックして注入量とレート設定を入力します。音量をクリックし、音量を20, 000ナノリットルに設定します。次に、注入速度をクリックして、速度を毎分8, 000ナノリットルに設定します。位置のリセットボタンをクリックして、構成を終了します。針先にヘモグロビンの小さなビーズが現れるまで注入ボタンをクリックして針先を洗い流し、次に綿の先端のアプリケーターを使用してビーズをそっと取り除きます。動物注射を開始するには、注射器の中外側および前後の位置を調整することにより、定位注射システムでブレグマをゼロに設定します。次に、注射針を下げて、ブレグマの頭蓋骨にそっと触れます。選択した座標を特定したら、シリンジ針を頭蓋骨の1センチ上に上げて頭皮をクリアします。中外側座標と前後座標を設定します。次に、針が頭蓋骨にそっと触れるように注射器を下げ、背腹座標を30秒以上設定します。座標を設定したら、定位インジェクタインターフェイスの実行ボタンをクリックして注入を開始します。注入が終了したら、溶液の逆流を最小限に抑えるために針を2分間そのままにします。次に、針先が頭皮から2センチメートル上になるまで、2分間にわたって背腹座標に沿って注射器をゆっくりと引き出します。次に、定位インジェクターアームを手術野から離れて回転させ、6-Oモノフィラメント縫合糸で頭皮を閉じます。MRIの場合、T2強調高速スピンエコーシーケンスを選択してT2強調イメージングを実行します。本文の説明に従ってMRIパラメータを設定した後、続行ボタンをクリックしてシーケンスを開始します。画像処理と脳容積分析のために、セグメンテーションソフトウェアでネイティブT2重み付けデータを開きます。側脳室を手動で描写するには、ペイントブラシモードをクリックして正方形のブラシスタイルを選択し、ブラシサイズを1に調整します。次に、[レイアウトインスペクター]をクリックし、[軸方向ビュー]を選択して、[ズーム]をクリックして合わせます。次に、画像にカーソルを置き、側脳室空間をトレースして埋めます。最後に、ツールバーのセグメンテーションをクリックし、次にボリュームと統計をクリックしてセグメント化されたボリュームを表示します。ヘモグロビン注射を受けた動物は、MRIで評価すると中等度の心室腫大を発症しました。ACSF注射動物と比較して、ヘモグロビン注射後24時間および72時間で有意に大きな側脳室を有する。2つのグループのラット間の側脳室容積の差は38日後に有意ではありませんでしたが、MRIスキャンは、ヘモグロビンを投与されたラットの44%がまだ未解決の心室腫大を有することを示しました。また、ACSFと比較して、ヘモグロビンの注入は38日後に白質体積の有意な減少をもたらした。ヘモグロビンはまた、生理食塩水または全血ではなく、ヘモグロビンを注射した後の炎症誘発性サイトカイン腫瘍壊死因子αの有意に高いレベルから明らかなように、in vivoでの炎症反応を促進した。さらに、グリア線維性酸性タンパク質の免疫組織化学的染色により、ヘモグロビン注入後、ACSF注射後よりもアストロサイトの活性化が有意に高いことが明らかになりました。この手順を試みるときに覚えておくべき最も重要なことは、側脳室へのヘモグロビン送達を確実にするために正しい注射座標を設定することです。この手順に従って、CSFトレーサーをCSF空間に送達して、CSF循環の変化、およびIVH後の排出パターンを評価することができます。この追加の方法は、IVH PHHでCSFフローがどのように変化するかに対処します。

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