ヘモグロビンの脳室内注射による新生児脳室内出血のモデリング
2022年8月25日
ラットの仔を用いた新生児脳室内出血のモデルを提示し、ヒトに見られる病態を模倣した。
このプロトコルは、IVH誘発性脳損傷と水頭症の臨床的に関連するモデルを開発し、心室へのヘモグロビン注射を利用して、新しい治療戦略をテストするための心室容積のその後の定量を可能にするため、重要です。この技術の主な利点は、ヘモグロビンおよび鉄経路血液分解産物によって特異的に媒介されるIVHの病理学の研究を可能にすることである。この手法も使いやすく、用途が広いです。
この技術の意味は、IVHの病態生理学のさらなる理解と、IVH後の神経学的後遺症の予防のための臨床的に関連する治療戦略の評価を可能にするため、出血後水頭症の治療法の開発にまで及びます。手順を実演するのは、オーストラリア研究所のアソシエイトポスドクであるスルティラマギリです。まず、麻酔をかけたラットを定位装置に入れ、鼻を麻酔アダプターに配置します。
次に、外耳道の破裂していないイヤーバーを締めて頭を固定します。頭をきれいにするには、まず頭の中心にあるベタジンに浸した滅菌綿の先端のアプリケーターに触れ、外側に移動してベタジンを円を描くように広げます。次に、70%エタノールに浸したアプリケーターでこのプロセスを繰り返します。
次に、メスを使用して、頭の中央を垂直に0.3センチメートル切開して、頭蓋骨の頭蓋骨を露出させます。次に、綿の先端のアプリケーターを使用して領域を乾かします。定位インジェクターをセットアップするには、事前に調製したヘモグロビン溶液を0.3または0.5ミリリットルのシリンジに引き込み、シリンジを定位インジェクターシステムに入れます。
次に、定位インジェクターインターフェースをオンにし、構成ボタンをクリックして注入量とレート設定を入力します。音量をクリックし、音量を20, 000ナノリットルに設定します。次に、注入速度をクリックして、速度を毎分8, 000ナノリットルに設定します。
位置のリセットボタンをクリックして、構成を終了します。針先にヘモグロビンの小さなビーズが現れるまで注入ボタンをクリックして針先を洗い流し、次に綿の先端のアプリケーターを使用してビーズをそっと取り除きます。動物注射を開始するには、注射器の中外側および前後の位置を調整することにより、定位注射システムでブレグマをゼロに設定します。
次に、注射針を下げて、ブレグマの頭蓋骨にそっと触れます。選択した座標を特定したら、シリンジ針を頭蓋骨の1センチ上に上げて頭皮をクリアします。中外側座標と前後座標を設定します。
次に、針が頭蓋骨にそっと触れるように注射器を下げ、背腹座標を30秒以上設定します。座標を設定したら、定位インジェクタインターフェイスの実行ボタンをクリックして注入を開始します。注入が終了したら、溶液の逆流を最小限に抑えるために針を2分間そのままにします。
次に、針先が頭皮から2センチメートル上になるまで、2分間にわたって背腹座標に沿って注射器をゆっくりと引き出します。次に、定位インジェクターアームを手術野から離れて回転させ、6-Oモノフィラメント縫合糸で頭皮を閉じます。MRIの場合、T2強調高速スピンエコーシーケンスを選択してT2強調イメージングを実行します。
本文の説明に従ってMRIパラメータを設定した後、続行ボタンをクリックしてシーケンスを開始します。画像処理と脳容積分析のために、セグメンテーションソフトウェアでネイティブT2重み付けデータを開きます。側脳室を手動で描写するには、ペイントブラシモードをクリックして正方形のブラシスタイルを選択し、ブラシサイズを1に調整します。
次に、[レイアウトインスペクター]をクリックし、[軸方向ビュー]を選択して、[ズーム]をクリックして合わせます。次に、画像にカーソルを置き、側脳室空間をトレースして埋めます。最後に、ツールバーのセグメンテーションをクリックし、次にボリュームと統計をクリックしてセグメント化されたボリュームを表示します。
ヘモグロビン注射を受けた動物は、MRIで評価すると中等度の心室腫大を発症しました。ACSF注射動物と比較して、ヘモグロビン注射後24時間および72時間で有意に大きな側脳室を有する。2つのグループのラット間の側脳室容積の差は38日後に有意ではありませんでしたが、MRIスキャンは、ヘモグロビンを投与されたラットの44%がまだ未解決の心室腫大を有することを示しました。
また、ACSFと比較して、ヘモグロビンの注入は38日後に白質体積の有意な減少をもたらした。ヘモグロビンはまた、生理食塩水または全血ではなく、ヘモグロビンを注射した後の炎症誘発性サイトカイン腫瘍壊死因子αの有意に高いレベルから明らかなように、in vivoでの炎症反応を促進した。さらに、グリア線維性酸性タンパク質の免疫組織化学的染色により、ヘモグロビン注入後、ACSF注射後よりもアストロサイトの活性化が有意に高いことが明らかになりました。
この手順を試みるときに覚えておくべき最も重要なことは、側脳室へのヘモグロビン送達を確実にするために正しい注射座標を設定することです。この手順に従って、CSFトレーサーをCSF空間に送達して、CSF循環の変化、およびIVH後の排出パターンを評価することができます。この追加の方法は、IVH PHHでCSFフローがどのように変化するかに対処します。
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概要
本記事では、新生児期の脳室内出血（IVH）後に発生する出血後水頭症（PHH）を研究するための、臨床的関連性が高く簡便な動物モデルを紹介します。新生児ラットの側脳室にヘモグロビンを注入することで、脳室拡大、白質損傷、および炎症を確実に誘発することができ、PHHの臨床的特徴を密接に再現します。また、本プロトコルでは、MRIおよび画像解析を用いて脳室サイズを定量化する方法についても詳しく解説します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 神経発達障害
- 動物モデル
背景
- IVHは早産に伴う一般的な合併症であり、しばしばPHHや長期的な神経学的欠損を引き起こします。
- 現在のPHHに対する治療法は外科的な髄液分流術に限られており、IVH誘発性の脳損傷を予防または治療するための薬物療法は存在しません。
- 既存の動物モデルでは大容量の注入が必要な場合が多く、それが個体差を導入し、病理学的モデリングを複雑にする要因となります。
- 臨床研究において、ヘモグロビンとフェリチンがIVH後の脳室拡大に関与していることが示唆されています。
研究目的
- 少量のヘモグロビン注入を用いて、IVH誘発性PHHの簡便で再現性のある動物モデルを構築すること。
- 病態生理学的研究のために、水頭症およびそれに伴う脳損傷を確実に誘発できるようにすること。
- IVHおよびPHHを標的とした新しい治療戦略を検証するためのプラットフォームを提供すること。
使用方法
- 麻酔下にある新生ラットの側脳室へのヘモグロビン溶液の定位注入。
- 定位注入装置を用いた注入量（20,000 nanoliters）および注入速度（8,000 nanoliters/minute）の精密な制御。
- 脳室拡大および白質の変化を評価するための注入後のMRI（T2強調画像）撮影。
- 画像処理ソフトウェアを用いた脳室の手動セグメンテーションおよび体積分析。
- 炎症およびアストロサイトの活性化を評価するための免疫組織化学染色およびサイトカインアッセイ。
主要な結果
- ヘモグロビン注入により、対照群と比較して注入後24時間および72時間で中等度の脳室拡大が誘導された。
- 注入後38日時点で、ヘモグロビンを注入したラットの44%に依然として回復していない脳室拡大が認められた。
- ヘモグロビン注入動物において、38日後に白質体積の有意な減少が観察された。
- ヘモグロビンは、TNF-alphaの上昇やアストロサイトの活性化亢進を含む、強力な炎症反応を誘発した。
結論
- このモデルは、水頭症、白質損傷、炎症を含む、IVH誘発性PHHの主要な特徴を確実に再現します。
- このプロトコルは簡便で再現性が高く、ヘモグロビン介在性の病理を精密に研究することが可能です。
- IVHの病態生理の解明および潜在的な治療介入を評価するための有用なプラットフォームを提供します。
よくある質問
業界における実用的な関連性
新生児脳室内出血（IVH）および出血後水頭症（PHH）の信頼性の高いモデリングは、トランスレーショナル神経科学および神経治療法の発見において極めて重要です。このヘモグロビンを用いたラットモデルにより、ヘモグロビン介在性の損傷メカニズムの精密な検証が可能となり、初期段階のターゲットバリデーションや治療薬スクリーニングにおける予測の信頼性が向上します。本アプローチは、IVH誘発性の脳損傷および水頭症を標的とする神経発達薬ポートフォリオのリスク低減に向けた重要な転換点となるものです。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- IVHの病理におけるヘモグロビンおよび鉄経路の関与について、メカニズムに基づいたリスク低減を可能にする。
- 神経炎症および白質損傷経路に対する機能的なターゲットバリデーションを支援する。
- 候補となる神経保護介入の仮説駆動的な評価を促進する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 心室拡大および白質消失を定量的に評価するための、再現性のあるin vivoシステムを提供する。
- MRIベースの体積読み取りを標準化し、研究間での比較可能性を確保する。
- IVH誘発性の損傷メカニズムを標的とした薬理学的薬剤の堅牢なスクリーニングを可能にする。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 臨床的なPHHで観察される水頭症や神経炎症などの、疾患に関連するエンドポイントと一致している。
- メカニズムの解明から神経治療薬の前臨床薬効試験への連続性をサポートする。
- 新生児脳損傷におけるトランスレーショナル研究のためのバイオマーカー開発を促進する。
パイプラインおよびワークフローの統合
このモデルは、神経発達障害の発見から前臨床に至る連続的なプロセスに統合され、メカニズム研究と治療候補物質の評価を橋渡しするものです。
- 探索生物学：新生児脳損傷におけるヘモグロビン介在性傷害および炎症経路の仮説検証を可能にします。
- スクリーニング：化合物評価のための標準化された定量的なMRIおよび組織学的アウトプットを提供します。
- 分析：コホート間で介入効果を比較するための体積およびサイトカイン測定を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：前臨床所見をPHHの臨床的特徴と整合させ、バイオマーカーおよびエンドポイントの選択を支援します。
- エンタープライズ再利用：継続的な神経治療パイプライン開発のための、拡張可能で再現性のあるプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： IVHおよびPHHにおけるターゲットバリデーションおよびメカニズムのデリスキングに対する予測信頼性を向上させる。
- 運用的価値： 動物モデル作成とMRI定量化を標準化し、再現性のある結果を可能にする。
- 戦略的価値： 神経保護薬および抗炎症薬候補のgo/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響： 新生児脳損傷を標的とした治療プログラムのリスク調整後の優先順位付けを可能にする。
実施上の注意点
- 定位注入および新生児動物のハンドリングに関する専門知識が必要です。
- 体積定量化のためのMRIイメージングおよび画像解析インフラへのアクセスが必要です。
- 再現性を確保するため、注入座標と注入量の厳格な標準化が求められます。
- メカニズムに関する洞察を広げるため、さらなるCSFトレーサー研究への適応が可能です。
- ヘモグロビン介在性損傷のモデル化に限定されており、すべてのIVH病因を捉えられない可能性があります。
