Name: マウス組織における安定微小管、不安定な微小管、遊離チューブリンを分離するための定量的微小管分画技術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-17T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 学ぶマウス組織における微小管分画技術。安定微小管、不安定微小管、遊離チューブリンを定量的に分離し、構造的安定性を評価します。この方法はアルツハイマー病やがんなどの微小管関連疾患の治療研究に有用です。

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この活動の一部は、JSTの科学技術イノベーション創出に向けた大学フェローシップの設立(A.HT;JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT.;JPMJSP2129)、科学研究費補助金特別研究員奨励費(A.HT;23KJ2078)、科学研究費助成事業基盤研究(B)日本学術振興会科学研究費補助金(22H02946)、文部科学省新学術領域研究「脳蛋白の老化と認知症制御」(26117004)、上原記念財団上原特別研究員(202020027)が奨励された。著者らは、競合する金銭的利益がないことを宣言します。

1. MT分別法
注:本研究で実施したすべての実験は、同志社大学動物倫理委員会の承認を受けたものです。ここでは、雌雄ともに3〜4ヶ月齢のC57BL/6Jマウスを用いた。このプロトコルでは、解剖されたティッシュ、例えば、頭脳、レバー、または胸腺は、MTの解重合だけでなく、再重合を防ぐ濃度でタキソール(MTの安定装置)を含んでいた氷冷した微小管の安定の緩衝(MSB)で、すぐに均質化されました。ホモジネートは、2段階の超遠心分離プロセスにより3つのフラクションに分離しました(図1)。このプロトコルのすべてのステップは涼しい温度の環境で中断なしで完了し、ティッシュおよび画分はナトリウムのdodecyl硫酸塩(SDS)サンプル緩衝液で分解されるまで凍結しなかった。
<ol><li>MSBおよびマイクロチューブの調製<ol><li>MSBを調製するには、以下の試薬を混合します:0.1 M 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、pH 6.8(KOHで中和)、10%グリセロール、0.1 mM DTT、1 mM MgSO 4、1 mM EGTA、0.5% Triton X-100、ホスファターゼ阻害剤(1 mM NaF、1 mM β-グリセロリン酸、1 mM Na3VO4、0.5 μMオカダ酸)、1xプロテアーゼ阻害剤カクテル、 およびプロテアーゼ阻害剤(0.1 mM PMSF、0.1 mM DIFP、1 μg/mLペプスタチン、1 μg/mLの抗疼痛剤、10 μg/mLのアプロチニン、10 μg/mLのロイペプチン、50 μg/mL TLCK)(資料表を参照)およびMSB(-)と表記します。</li>
		<li>組織解剖の直前に、10 μM タキソールと 2 mM GTP( 材料表を参照)を MSB(-) に添加します。このバッファーは MSB(+) と表記されます。使用当日に緩衝液を準備し、氷上に保管してください。</li>
		<li>サンプリング用のマイクロチューブを準備します。ホモジネート保存用の空の2.0 mLマイクロチューブ。上清1(S1)ライセート、沈殿物2(P2)サンプル、および沈殿物3(P3)サンプル保存用の空の1.5 mLマイクロチューブ。解剖組織保存用の氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1 mLを含む1.5 mLマイクロチューブ。1.5 mL マイクロチューブと 200 μL の 2x SDS サンプルバッファー(0.16 M トリス pH 6.8、20% グリセロール、2% 2-メルカプトエタノール、4% SDS)を添加した S1 サンプルおよび上清 3(S3)サンプル保存用。TLA55およびTLA120.2遠心分離機ローター用の遠心分離マイクロチューブ( 材料表を参照)。すべてのチューブにラベルを付け、氷の上に置きます。</li>
	</ol></li>
	<li>マウス組織のホモジナイズ<ol><li>組織解剖用のチルドテーブルを準備します。まず、箱に砕いた氷を入れ、内側を上にして、外側を上にして、2つのシャーレを氷の上に置きます。氷冷したPBSを1つの皿に充填し、一過性の洗浄と解剖組織の保存を行います。PBSで湿らせた濾紙を裏返した別の皿に置きます。</li>
		<li>マウスを犠牲にするには、ブトルファノール、ミダゾラム、メデトミジンの混合麻酔薬を使用して、深い麻酔下で子宮頸部脱臼を行います。次に、脳、肝臓、胸腺などの組織を直ちに解剖し、ペトリ皿で氷冷したPBSで洗浄します。 注:この方法では、あらゆるタイプの軟部組織を分析できます。ただし、組織のサイズは、使用するホモジナイザーの推奨容量範囲によって制限されます。例えば、2 mL の量のホモジナイザーを使用する場合は、50 〜 100 mg の組織が推奨されます。</li>
		<li>PBSを充填した1.5mLのマイクロチューブを秤量して解剖組織保存した後、マイクロチューブ内の組織を切り取って保存し、各マイクロチューブを再計量します。各組織の湿重量は、組織を追加する前後のチューブの重量を差し引くことによって計算できます。</li>
		<li>冷やしたホモジナイザーを使用して、氷冷MSB(+)で組織を直ちに均質化します( 材料表を参照)。MSB(+)の体積は、組織湿重量(mg)の19倍(μL)であった。組織片が消えるまで20ストロークで均質化を行います。 注:例えば、100 mgの組織に対して1,900 μLのMSB(+)が使用されます。添加するMSB(+)の量は、分析する組織片の湿重量ごとに調整する必要があるため、各組織片を正確に計量する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>マウス組織ホモジネートの遠心分離<ol><li>ホモジネート全体をパスツールピペットで2 mLのマイクロチューブに移し、2,400 × g で2°Cで3分間遠心分離し、沈殿 によって 破片を除去します。</li>
		<li>上清全体(S1フラクション)を新しい1.5 mLマイクロチューブに移し、ボルテックスします。次に、200μLのS1フラクションを遠心分離用マイクロチューブに分注し、TLA-55ローターを使用して2°Cで20分間、100,000× g で遠心分離し、比較的大きな分子量のタンパク質を沈殿物(P2フラクション)として得る。 注:超遠心分離ステップに供するサンプルの量は、遠心分離の半径と分子の沈殿効率に影響を与えます。このステップの後は、不正確な分画を防ぐために、サンプル量を200 μL以下に保ちます。</li>
		<li>さらに、得られたすべての上清(S2フラクション)を500,000 × g でTLA-120.2ローターを使用して2°Cで60分間遠心分離し、沈殿物中の不溶性タンパク質複合体(P3フラクション)を上清中の可溶性タンパク質(S3フラクション)から分離します。</li>
		<li>400 μL の 1x SDS サンプルバッファー (0.08 M トリス pH 6.8; 10% グリセロール; 1% 2-メルカプトエタノール; 2% SDS) を P2 および P3 フラクションチューブに加え、短時間超音波処理して沈殿物を溶解します。これらのフラクションサンプルを空の1.5 mLマイクロチューブに移します。</li>
		<li>総S3画分を200 μLの2x SDSサンプルバッファーに溶解します。</li>
		<li>残りの S1 フラクションを等量の 2x SDS サンプルバッファーと混合し、ウェスタンブロッティングの検量線として使用します。</li>
		<li>これらすべてのサンプルを100°Cで3分間煮沸します。サンプルが室温まで冷却されたら、サンプルを-20°Cで保管します。</li>
	</ol></li>
	<li>各画分におけるタンパク質の定量<ol><li>P2、P3、S3画分のタンパク質をウェスタンブロッティングで定量します。まず、10% SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を使用して、適切に希釈したP2、P3、S3画分、および段階希釈したS1サンプルを検量線として任意の個体からタンパク質を分離します。次に、サンプルをポリフッ化ビニリデンメンブレンにエレクトロブロットします( 材料表を参照)。 注:各フラクションの希釈比は、目的タンパク質の濃度と抗体の反応性によって異なります。(例:脳組織におけるα-チューブリン、TUBB3、β-tub、およびチロシン化チューブリン:S3 = 1/400、P3 = 1/2,000、P2 = 1/2、 000、S1 = 1/50,000、1/20,000、1/10,000、1/5,000、1/2,000; 脳組織におけるアセチル化チューブリン:S3 = 1/200、P3 = 1/400、P2 = 1/8,000、S1 = 1/100,000、1/40,000、1/20,000、1/10,000、1/4,000; 肝臓のα-チューブリン:S3 = 1/20、P3 = 1/100、P2 = 1/20、S1 = 1/50,000、1/20,000、1/20,000、1/5,000、1/2,000; 胸腺のα-チューブリン:。 S3 = 1/100、P3 = 1/400、P2 = 1/20、S1 = 1/50,000、1/20,000、1/10,000、1/5,000、1/2,000の組織濃度の希釈)。</li>
		<li>5%脱脂乳をトリス緩衝生理食塩水(50 mM Tris-HCl pH 7.6;152 mM NaCl)と0.1% Tween 20(TBS-T)で30分以上ブロッキングします。</li>
		<li>メンブレンを一次抗体を含むTBS-T( 材料表を参照)に2時間以上浸漬します。その後、TBS-Tで3分間(3回)メンブレンを洗浄します。</li>
		<li>HRP標識二次抗体( 材料表参照)をTBS-Tで1時間以上標識します。その後、TBS-Tで3分間(3回)メンブレンを洗浄します。</li>
		<li>強化化学発光試薬でメンブレンを開発します。次に、発光イメージアナライザーで目的のバンドを分析します( 材料表を参照)。</li>
		<li>画像解析ソフトウェア( 材料表を参照)を使用してタンパク質のバンド強度を定量し、標準曲線に使用した希釈S1サンプルの希釈単位をX軸にプロットし、バンド強度をY軸にプロットして標準曲線を作成します。</li>
		<li>希釈したフラクションサンプルに対応するタンパク質濃度(単位)を読み取ります。読み取った濃度にサンプル希釈係数を掛けて、各フラクションのタンパク質単位を取得します。各画分の測定単位を総タンパク質単位(P2 + P3 + S3)で割って、パーセンテージを求めます。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 各画分におけるチューブリンの特性評価
注:この生化学的方法は、沈降特性によって定義されるチューブリン複合体の3つのグループを提供します。ここでは、これらのフラクションで得られたチューブリン複合体の状態を、複合体およびチューブリン-PTMのサイズに基づいて同定した。このプロトコルのすべてのステップは、低温環境で中断することなく完了しますが、フラクションサンプルがSDSサンプルバッファーに溶解するまで凍結しないでください。
<ol><li>フィルタートラップアッセイ<ol><li>S2 および S3 フラクション(各 500 μL)を 300 kDa 限外ろ過スピンカラムでろ過します( 材料表を参照)。上清全体がろ過され、溶出されたタンパク質がレシーバーチューブに集められ、捕捉されたタンパク質がリザーバーチューブのフィルターに残るまで、2°Cで14,000 × g の遠心分離を行います。</li>
		<li>レシーバーチューブ内の濾液全体(約 500 μL)を新しい 1.5 mL マイクロチューブに変換し、500 μL の 2x SDS サンプルバッファーに溶解します。</li>
		<li>リザーバーチューブのフィルター上の残留物を、ピペッティングして新しい1.5 mLマイクロチューブに移し替え、1,000 μLの1x SDSサンプルバッファーに可溶化します。</li>
		<li>サンプルを100°Cで3分間煮沸します。サンプルが室温まで冷却されたら、サンプルを-20°Cで保管します。</li>
		<li>DM1A(抗α-チューブリン抗体、 材料表参照)によるウェスタンブロッティングにより、チューブリンの量を分析します。</li>
	</ol></li>
	<li>サイズ排除クロマトグラフィー<ol><li>ステップ 1.1.1 で説明したように、1/10 濃度のプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加したキャリアバッファー(0.1 M MES、pH 6.8、10% グリセロール、1 mM MgSO4、1 mM EGTA、0.1 mM DTT)を調製します。次に、溶液をろ過し、低温環境で保管します。</li>
		<li>分取液体クロマトグラフィーシステムを備えたゲルろ過クロマトグラフィーカラムを、4°Cのクロマトグラフィーチャンバー( 材料表参照)に調製します。</li>
		<li>カラムにサンプルを注入する前に、180 mL のキャリアバッファーを流してカラムを洗浄します。流速は1mL/minで3時間です。</li>
		<li>市販の精製ブタチューブリン( 材料表を参照)をコントロールとして、またはマウス脳由来のS3画分(各500 μL)をカラムに注入します。</li>
		<li>流速1.0 mL/minでキャリアバッファーで溶出します。1.5 mLフラクションを120分間回収します。溶出タンパク質を280 nmの吸光度でモニタリングします。最大圧力は0.3MPa以下にしてください。</li>
		<li>回収したフラクションをボルテックスした後、1.5 mLのマイクロチューブで50 μLのフラクションを50 μLの2x SDSサンプルバッファーと混合します。すべてのサンプルを100°Cで3分間煮沸します。サンプルが室温まで冷却されたら、サンプルを-20°Cで保管します。</li>
		<li>抗α-チューブリン抗体であるDM1Aおよび抗β-チューブリン抗体であるKMX-1を用いてウェスタンブロッティングすることにより、チューブリンの量を分析します( 材料表を参照)。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Janke, C., Magiera, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tubulin+code+and+its+role+in+controlling+microtubule+properties+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).</li>
<li>Conde, C., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+assembly%2C+organization+and+dynamics+in+axons+and+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319-332 (2009).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubule+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li>
<li>Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+properties+of+neuronal+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Stability properties of neuronal microtubules.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).</li>
<li>Challacombe, J. F., Snow, D. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+microtubule+ends+are+required+for+growth+cone+turning+to+avoid+an+inhibitory+guidance+cue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynamic microtubule ends are required for growth cone turning to avoid an inhibitory guidance cue.</a> Journal of Neuroscience. 17 (9), 3085-3095 (1997).</li>
<li>Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+neuronal+microtubule+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Building the neuronal microtubule cytoskeleton.</a> Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).</li>
<li>Leo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+fidgetin+restrains+axonal+growth+by+severing+labile+domains+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Vertebrate fidgetin restrains axonal growth by severing labile domains of microtubules.</a> Cell Reports. 12 (11), 1723-1730 (2015).</li>
<li>Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tubulin+code%3A+molecular+components%2C+readout+mechanisms%2C+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions.</a> Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).</li>
<li>Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+post-translational+modifications+and+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2207(2017).</li>
<li>Baas, P. W., Black, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+microtubules+in+the+axon+consist+of+domains+that+differ+in+both+composition+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Individual microtubules in the axon consist of domains that differ in both composition and stability.</a> Journal of Cell Biology. 111 (2), 495-509 (1990).</li>
<li>Cartelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+alterations+occur+early+in+experimental+parkinsonism+and+the+microtubule+stabilizer+epothilone+D+is+neuroprotective%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microtubule alterations occur early in experimental parkinsonism and the microtubule stabilizer epothilone D is neuroprotective.</a> Scientific Reports. 3, 1837(2013).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-binding+drugs+offset+tau+sequestration+by+stabilizing+microtubules+and+reversing+fast+axonal+transport+deficits+in+a+tauopathy+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (1), 227-231 (2005).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+alpha-tubulin+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of alpha-tubulin in Alzheimer disease.</a> Translational Neurodegeneration. 4, 9(2015).</li>
<li>Miyasaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+improves+tau-induced+neuronal+dysfunction+of+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Curcumin improves tau-induced neuronal dysfunction of nematodes.</a> Neurobiology of Aging. 39, 69-81 (2016).</li>
<li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+microtubule+assembly+competent+tubulin+synthesis+leads+to+accumulation+of+phosphorylated+tau+in+neuronal+cell+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Inhibition of microtubule assembly competent tubulin synthesis leads to accumulation of phosphorylated tau in neuronal cell bodies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 521 (3), 779-785 (2020).</li>
<li>Vielkind, U., Swierenga, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+fixation+procedure+for+immunofluorescent+detection+of+different+cytoskeletal+components+within+the+same+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">A simple fixation procedure for immunofluorescent detection of different cytoskeletal components within the same cell.</a> Histochemistry. 91 (1), 81-88 (1989).</li>
<li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+multiple+tau+isoforms+and+microtubule+bundle+formation+in+fibroblasts+transfected+with+a+single+tau+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA.</a> Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173-1184 (1989).</li>
<li>Brown, A., Li, Y., Slaughter, T., Black, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+microtubules+of+the+axon%3A+quantitative+analysis+of+tyrosinated+and+acetylated+tubulin+along+individual+axonal+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Composite microtubules of the axon: quantitative analysis of tyrosinated and acetylated tubulin along individual axonal microtubules.</a> Journal of Cell Science. 104 (2), 339-352 (1993).</li>
<li>Black, M. M., Slaughter, T., Moshiach, S., Obrocka, M., Fischer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+is+enriched+on+dynamic+microtubules+in+the+distal+region+of+growing+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tau is enriched on dynamic microtubules in the distal region of growing axons.</a> Journal of Neuroscience. 16 (11), 3601-3619 (1996).</li>
<li>Caron, J. M., Jones, A. L., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+of+tubulin+synthesis+in+hepatocytes+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts.</a> Journal of Cell Biology. 101 (5), 1763-1772 (1985).</li>
<li>Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+destruction+of+stable+microtubules+and+axons+by+inhibitors+of+protein+serine%2Fthreonine+phosphatases+in+cultured+human+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons.</a> Journal of Neuroscience. 17 (15), 5726-5737 (1997).</li>
<li>Miyasaka, T., Sato, S., Tatebayashi, Y., Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+destruction+induces+tau+liberation+and+its+subsequent+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Microtubule destruction induces tau liberation and its subsequent phosphorylation.</a> FEBS Letters. 584 (14), 3227-3232 (2010).</li>
<li>Hagita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fractionation+of+tissue+microtubules+with+distinct+biochemical+properties+reflecting+their+stability+and+lability%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Quantitative fractionation of tissue microtubules with distinct biochemical properties reflecting their stability and lability.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 560, 186-191 (2021).</li>
<li>Montecinos-Franjola, F., Chaturvedi, S. K., Schuck, P., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+tubulins+are+not+alike%3A+Heterodimer+dissociation+differs+among+different+biological+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">All tubulins are not alike: Heterodimer dissociation differs among different biological sources.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (26), 10315-10324 (2019).</li>
<li>Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+taxol-dependent+procedure+for+the+isolation+of+microtubules+and+microtubule-associated+proteins+%28MAPs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A taxol-dependent procedure for the isolation of microtubules and microtubule-associated proteins (MAPs).</a> Journal of Cell Biology. 92 (2), 435-442 (1982).</li>
<li>Bartolo, M. E., Carter, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+microtubule+stabilization+on+the+freezing+tolerance+of+mesophyll+cells+of+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effect of microtubule stabilization on the freezing tolerance of mesophyll cells of spinach.</a> Plant Physiology. 97 (1), 182-187 (1991).</li>
<li>Strang, K. H., Golde, T. E., Giasson, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPT+mutations%2C+tauopathy%2C+and+mechanisms+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">MAPT mutations, tauopathy, and mechanisms of neurodegeneration.</a> Laboratory Investigation. 99 (7), 912-928 (2019).</li>
<li>Fourel, G., Boscheron, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+mutations+in+neurodevelopmental+disorders+as+a+tool+to+decipher+microtubule+function%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Tubulin mutations in neurodevelopmental disorders as a tool to decipher microtubule function.</a> FEBS Letters. 594 (21), 3409-3438 (2020).</li>
<li>Terry, R. D., Gonatas, N. K., Weiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+in+Alzheimer%27s+presenile+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies in Alzheimer's presenile dementia.</a> The American Journal of Pathology. 44 (2), 269-297 (1964).</li>
<li>Yoshida, H., Ihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+in+paired+helical+filaments+is+functionally+distinct+from+fetal+tau%3A+assembly+incompetence+of+paired+helical+filament-tau%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Tau in paired helical filaments is functionally distinct from fetal tau: assembly incompetence of paired helical filament-tau.</a> Journal of Neurochemistry. 61 (3), 1183-1186 (1993).</li>
<li>Cash, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+reduction+in+Alzheimer%27s+disease+and+aging+is+independent+of+tau+filament+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Microtubule reduction in Alzheimer's disease and aging is independent of tau filament formation.</a> The American Journal of Pathology. 162 (5), 1623-1627 (2003).</li>
<li>Hempen, B., Brion, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+acetylated+alpha-tubulin+immunoreactivity+in+neurofibrillary+tangle-bearing+neurons+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Reduction of acetylated alpha-tubulin immunoreactivity in neurofibrillary tangle-bearing neurons in Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 55 (9), 964-972 (1996).</li>
<li>Miyasaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imbalanced+expression+of+tau+and+tubulin+induces+neuronal+dysfunction+in+C.+elegans+models+of+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Imbalanced expression of tau and tubulin induces neuronal dysfunction in C. elegans models of tauopathy.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 415(2018).</li>
<li>Boiarska, Z., Passarella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-targeting+agents+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Microtubule-targeting agents and neurodegeneration.</a> Drug Discovery Today. 26 (2), 604-615 (2021).</li>
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著者には、報告すべき利益相反はありません。

生体由来の組織中のチューブリンの状態を調べる際の最も重要なタスクは、調製中の偶発的なMT重合または解重合を防ぐことです。サンプル中のMTの安定性は、MSB中のタキソールの濃度、緩衝液に対する組織量の割合、組織除去からホモジナイズおよび遠心分離までのプロセス中の温度などの要因の影響を受けます。したがって、20倍の量のホモジネートでマウス組織を分析するためのプロトコルの各ステップで条件を最適化しました。高濃度のタキソールは、冷蔵条件下でも in vitroでMT重合を誘発することができる25。チューブリン濃度が大きく異なる組織を分析したり、プロトコルを大幅に変更したりする場合は、各オペレーターが実験の特定の目的に従ってステップを最適化する必要があります。
実施された研究では、500,000 × g20 での超遠心分離を使用して、従来の「可溶性画分」から P3 と呼ばれる新しい MT の集団が得られました。ローターのKファクター、遠心力、遠心分離の持続時間な...

微小管(MT)は、α/β-チューブリンヘテロ二量体サブユニットからなるプロトフィラメントからなる細長い管状構造です。それらは、細胞分裂、運動性、形状維持、細胞内輸送などのさまざまな細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしており、真核生物の細胞骨格の不可欠な構成要素となっています1。α-チューブリンサブユニットが露出するMTのマイナス末端は比較的安定であるのに対し、β-チューブリンサブユニットが露出するプラス末端は動的解重合と重合2を受ける。プラス末端でのチューブリン二量体の付加と解離の連続的なサイクルは、動的不安定性と呼ばれ、レスキューと大惨事の繰り返しのプロセスをもたらします3。MTは、安定ドメインと不安定ドメインを含む、動的不安定性に局所的な変動を伴う焦点ドメインを示します4。
MTの動的不安定性の正確な制御は、多くの細胞機能、特に複雑な形態を特徴とするニューロンにとって非常に重要です。MTの適応性と耐久性は、神経細胞の発達と適切な機能に重要な役割を果たします5,6,7。MTの動的不安定性は、アセチル化、リン酸化、パルミトイル化、脱チロシン化、デルタ2、ポリグルタミン酸化、ポリグリシル化など、チューブリンのさまざまな翻訳後修飾(PTM)に関連していることがわかっています。さらに、微小管関連タンパク質(MAP)の結合は、調節機構として機能します8。アセチル化を除くPTMは、主にMTの外表面に位置するチューブリンカルボキシ末端領域に発生します。これらの変更により、MTに多様な表面条件が生じ、MAPとの相互作用に影響を与え、最終的にはMTの安定性を支配します9。α-チューブリン中のカルボキシ末端チロシン残基の存在は、遊離チューブリンプールに急速に置き換わる動的MTを示しています。逆に、カルボキシ末端の脱チロシン化とLys40のアセチル化は、動的不安定性が低減された安定したMTを意味する9,10。
チューブリンのPTMは、MT 5,7,11,12,13,14,15のダイナミクスと安定性を評価するための実験に広く用いられています。例えば、細胞培養研究では、チューブリンは遊離チューブリンプールとMTプールの2つのプールに分離できます。これは、残りのMT15、16、17、18、19を固定する前に、細胞透過処理によって遊離チューブリンを放出することによって達成されます。生化学的方法では、MTを大惨事から保護する化学的MT安定剤を使用し、遠心分離によってMTと遊離チューブリンを分離することができます20,21,22。しかし、これらの手順では、安定なMTと安定性の低い(不安定な)MTを区別しないため、脳などの組織におけるMTや可溶性チューブリンを定量することは不可能です。その結果、生理学的および病理学的条件下での生物のMT安定性を評価することは困難であることが証明されています。この実験的限界に対処するために、我々はマウス組織中のMTと遊離チューブリンを正確に分離するための新しい技術を開発した23。
このユニークなMT分画法では、組織内のチューブリンの状態を維持する条件下での組織ホモジナイズと、安定なMT、不安定なMT、遊離チューブリンを分離するための2段階の遠心分離を行います。この簡便な手法は、生体内のMTやMAPに関する基礎研究、MTの安定性に関わる健康や疾患の生理・病理学的解析、MTを標的とした医薬品などの治療法の開発など、幅広い研究に応用できます。

<table><tbody><tr><td>500</td> ベ<td>ックマン・コールター</td><td>357448</td><td></td></tr><tr><td>1A2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9028</td><td>1:5,000 希釈</td></tr><tr><td>2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸 (MES)</td> <td>Nacalai Tesque</td><td>02442-44</td><td></td></tr><tr><td>300 kDa 限外ろ過スピンカラム</td><td>Aproscience</td><td>PT-1013</td><td></td></tr><tr><td>6-11B1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td>1:5,000 の 1.5 ML TUBE CASE希釈</td></tr><tr><td>&#196;KTAprime plus</td><td>Cytiva</td><td>11001313</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスIgG Jackson</td><td>ImmunoResearch</td><td>115-035-146</td><td>1:5,000</td></tr>希釈<tr><td>抗疼痛</td><td>ペプチド研究所</td><td>4062</td><td></td></tr><tr><td>アプロチニン</td><td>Nacalai Tesque</td><td>03346-84</td><td></td></tr><tr><td>Chemi-Lumi One L</td><td>Nacalai Tesque</td><td>07880-54</td><td></td></tr><tr><td>コーニングボトルトップ真空フィルターシステム</td><td>コーニング</td><td>430758</td><td>0.22&micro;メートル33.2cm&sup2;ニトロセルロースメンブレン</td></tr><tr><td>DIFP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55-91-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>デジタルホモジナイザーHK-1</td><td>AS ONE</td><td>1-2050-11</td><td></td></tr><tr><td>DM1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td>1:5,000</td></tr>希釈 <tr><td>DTT</td><td>Nacalai Tesque</td><td>14128-46</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Nacalai Tesque</td><td>37346-05</td><td></td></tr><tr><td>FluoroTrans W 3.3 Meter Roll</td><td>Pall Corporation</td><td></td> BSP0161 <td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17018-25</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17450-61</td><td></td></tr><tr><td>高速冷蔵マイクロ遠心分離機 Kitman</td><td>TOMY</td><td>KITMAN-24</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column</td><td>Cytiva</td><td>28-9893-35</td><td></td></tr><tr><td>イメージゲージソフトウェア&nbsp;</td><td>フジフィラム和光純薬株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イムノスター LD&nbsp;</td><td>フジフィラム和光純薬(株</td>) <td>292-69903</td><td></td></tr><tr><td>KMX-1</td><td>ミリポア</td><td>MAB3408</td><td>1:5,000</td></tr>希釈 <tr><td>LAS-4000 発光画像分析装置</td><td>フジフィラム和光純薬(株</td><td></td><td></td></tr>) <tr><td>ロイペプチン</td><td>ペプチド研究所</td><td>43449-62</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Nacalai Tesque</td><td>21003-75</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4</sub</td><td>>Nacalai Tesque</td><td>32013-92</td><td></td></tr><tr><td>NaF Nacalai</td><td>Tesque</td><td>31420-82</td><td></td></tr><tr><td>okadaic acid</td><td>LC Laboratories</td><td>O-2220&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>OPTIMA MAX-XP</td><td>ベックマン・コールター</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>ペプスタチン</td><td>ナカライ テスク</td><td>26436-52</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>ナカライ テスク</td><td>27327-81</td><td></td></tr><tr><td>TLA120.2</td><td>ベックマン・コールター</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル (cOmplete&#8482;, EDTA-free)</td> <td>ロシュ</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>精製チューブリン&nbsp;</td><td>Cytoskeleton</td><td>T240</td><td></td></tr><tr><td>QSONICA Q55</td><td>QSonica</td><td>Q55</td><td></td></tr><tr><td>Taxol</td><td>LC Laboratories</td><td>P-9600</td><td></td></tr><tr><td>TLA-120.2 ローター</td><td>Beckman Coulter</td><td>357656</td><td></td></tr><tr><td>TLA-55 ローター</td><td>Beckman Coulter</td><td>366725</td><td></td></tr><tr><td>TLCK</td><td>Nacalai Tesque</td><td>34219-94</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai Tesque</td><td>12967-45</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-グリセロリン酸</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>G9422</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス組織における安定微小管、不安定な微小管、遊離チューブリンを分離するための定量的微小管分画技術

Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues

α/β-チューブリン二量体で構成される微小管は、真核細胞の細胞骨格の重要な構成要素です。これらのチューブ状ポリマーは、チューブリンヘテロ二量体サブユニットが重合と解重合を繰り返すため、動的不安定性を示します。チューブリンの翻訳後修飾や微小管関連タンパク質によって達成される微小管の安定性と動態の精密な制御は、さまざまな細胞機能に不可欠です。微小管の機能不全は、神経変性疾患などの病因に強く関与しています。現在進行中の研究は、安定性を調節する微小管を標的とする治療薬に焦点を当てており、これらの疾患やがんに対する潜在的な治療選択肢を提供しています。したがって、微小管の動態を理解することは、疾患の進行と治療効果を評価するために重要です。
従来、微小管の動態は、チューブリンの翻訳後修飾を標的とする抗体を用いて、粗分画またはイムノアッセイによってin vitro または培養細胞で評価されてきました。しかし、このような手順を用いて組織中のチューブリンの状態を正確に分析することは困難です。本研究では、マウス組織において安定な微小管、不安定な微小管、遊離チューブリンを分離する簡便で革新的な微小管分画法を開発しました。
この手順では、解剖したマウス組織を微小管安定化バッファー中で19:1の体積比でホモジナイズしました。次に、ホモジネートを、最初の低速遠心分離(2,400 × g)に続いて 2 段階の超遠心分離プロセスで分画し、破片を除去しました。第1の超遠心分離工程(100,000 × g)で安定な微小管を沈殿させ、得られた上清を第2の超遠心分離工程(500,000 × g)にかけ、不安定な微小管および可溶性チューブリン二量体を分画した。この方法では、マウスの脳内で安定または不安定な微小管を構成するチューブリンの割合が決定されました。さらに、微小管の安定性における明確な組織変動が観察され、構成細胞の増殖能力と相関しました。これらの知見は、生理学的および病理学的状態における微小管の安定性を分析するためのこの新しい方法の大きな可能性を浮き彫りにしています。

MT分画法によるマウス脳のP2、P3、S3画分中のチューブリンの定量 マウス組織中のチューブリンをMT分画法によりP2、P3、S3画分に分離し、ウェスタンブロッティングにより定量しました(図1A)。100,000 × g で20分間の超遠心分離によってP2画分に残ったMTの沈殿物は、マウス脳の総チューブリンの34.86%±1.68%を占めました。上清(S2)をさらに500,000 × g で60分間遠心分離した。沈殿物(P3画分)と上清(S3画分)が得られ、マウス脳の総チューブリンのそれぞれ56.13%±2.12%または9.01%±0.68%を占めました(図1B)。
この研究で使用した大脳皮質には、神経細胞とグリアなどの非神経細胞が含まれています。マウス脳のニューロンにおけるMTの安定性を選択的に評価するために、中枢神経系および末梢神経系のニューロンにのみ発現するチューブリンサブタイプであ...

チューブリンポリマーである微小管は、真核細胞の細胞骨格成分として重要な役割を果たしており、動的に不安定であることで知られています。本研究では、微小管を分画して安定微小管、不安定な微小管、遊離管に分離し、マウスの各種組織における微小管の安定性を評価する方法を開発しました。

Microtubules, composed of &#945;/&#946;-tubulin dimers, are a crucial component of the cytoskeleton in eukaryotic cells. These tube-like polymers exhibit ...

私たちの新しいプロトコルは、動物組織における安定な微小管、不安定な微小管、遊離尿細管など、チューブリングの3つの状態を区別し、定量化するのに役立ちます。この手法は簡単なステップで構成されており、チューブの翻訳後修飾の定量化では検出できないチューブの構造安定性を評価できます。この方法は、アルツハイマー病やがんなど、微小管の安定性が重要な疾患の治療法の研究開発に不可欠です。組織解剖用のラボウェアを準備することから手順を開始します。箱に砕いた氷を入れ、その上にペトリ皿を2つ置きます。1つの皿に氷冷したリン酸緩衝液またはPBSを充填し、解剖した組織を一過性に洗浄および保存します。PBSで湿らせたろ紙を2皿目に置きます。次に、解剖組織保存用のPBSを充填した1.5ミリリットルのマイクロチューブを秤量します。安楽死させたマウスから組織を抽出した後、それらをチューブに移し、各マイクロチューブを再計量します。氷冷した微小管安定化バッファーまたは MSB+培地を含むガラス製ホモジナイザーに組織を移し、チルドホモジナイザーを使用して組織を直ちにホモジナイズします。次に、パスツールピペットを使用して組織ホモジネートを2ミリリットルのマイクロチューブに移し、2, 400 Gで摂氏2度で3分間遠心分離します。上清を新しい1.5ミリリットルのマイクロチューブに移し、破片を取り除きます。上清またはS1フラクションを新しい1.5ミリリットルのマイクロチューブにボルテックスします。すぐに200マイクロリットルのS1画分を遠心分離用マイクロチューブにピペットで移し、TLA-55ローターを使用して100, 000Gで2°Cで20分間遠心分離します。2回目の遠心分離後、S2上清をP2沈殿物から分離します。直ちに全量のS2画分を遠心分離マイクロチューブに移し、TLA-120.2ローターを使用して、500, 000 Gで摂氏2度で60分間回転させます。3回目の遠心分離後、S3上清をP3沈殿物から分離します。S3画分全体を200マイクロリットルの2Xドデシル硫酸ナトリウム(SDSサンプルバッファー)に溶解します。残りの S1 フラクションを等量の 2X SDS サンプルバッファーと混合し、ウェスタンブロッティングの検量線として使用します。次に、400マイクロリットルのSDSサンプルバッファーをP2およびP3フラクションチューブに添加します。次に、溶液を短時間超音波処理して沈殿物を溶解してから、サンプルを新しい1.5ミリリットルのマイクロチューブに移し、アイスボックスに入れます。すべてのサンプルを摂氏100度で3分間煮沸します。P2画分の微小管は、マウス脳の総α-チューブリンの34.86%を占め、P3画分とS3画分の微小管は、それぞれ56.13%と9.01%を占めました。P2、P3、およびS3画分におけるβ-3チューブリンの割合は、α-チューブリンのそれと有意差はありませんでした。S2フラクションは、300キロダルトンの限外濾過スピンカラムを通るチューブリンの通過を制限しましたが、S3フラクションはチューブリン複合体の完全な継代を可能にしました。クロマトグラフィー分離により、100 キロダルトンの S3 チューブリンが溶出しました。α-チューブリンとβ-チューブリンの比率が等しい割合で各画分で回収されました。P2画分はアセチル化α-チューブリンで有意に濃縮され、チロシン化α-チューブリンはP3画分で優勢でした。ホモジナイズ前に脳を凍結すると、P2画分のα-チューブリン濃度が低下しました。しかし、α-チューブリンはP3画分で増加しました。凍結はまた、アセチル化レベルを低下させ、P2画分のα-チューブリンのチロシン化レベルを上昇させた。ノコダゾール治療により、P2画分のα-チューブリンが減少しました。.凍結とは対照的に、ノコダゾールはP2チューブリンの翻訳後修飾に影響を与えませんでした。脳組織はP2チューブリンの濃度が有意に高かったのに対し、P3チューブリンは増殖組織に集中していた。ウェスタンブロッティングにより、神経系に特異的に見られるP2チューブリンは安定な微小管に由来し、P3チューブリンは不安定な微小管に由来することが示されました。微小管の安定性は非常に動的です。このプロトコルは、低温環境で中断することなく迅速に完了することが重要です。また、組織およびフラクションがSDSサンプルバッファーに溶解するまで凍結されていないことを確認してください。各画分を用いた免疫提示とプロテオミクスを組み合わせることで、微小管の動態に関与する因子を同定できることが期待されます。この手法を用いて、微小管上に正常なタウがどのように存在するかを明らかにしました。また、認知症の新薬標的を特定するために、老化した脳でどのように異常になるかを研究するためにも使用できます。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

微小管は本質的に不安定なポリマーであり、成長との間の短縮その切り替えは、確率および制御することは困難である。ここでは、photoablatable安定キャップでセグメント化された微小管を使用してプロトコルを記述します。セグメント化された微小管の脱重合することにより、分解、微小管末端を有する運動の分析を支援する、高い時間および空間分解能でトリガすることができる。...

逆アセンブル微小管端部によって駆動される運動を研究するセグメント化微小管の調製

この方法では、複数のマウス組織から中間体フィラメント（IF）タンパク質を迅速かつ効率的に単離するための生化学的手順を提示する。単離されたIFは、質量分析および他の生化学アッセイによる翻訳後修飾の変化を研究するために使用することができる。...

複数のマウス組織からの中間体フィラメントタンパク質の単離による老化に関連する翻訳後修飾の研究

ここでは、他の組織に広く適用される、ゼブラフィッシュ脳の発達における微小管の異なる集団を分析するメソッドについて反応について説明します。最初のプロトコルでは、反応の安定性と動的微小管の最適化手法について説明します。第二議定書は、画像し、初期微小管を具体的に数値化する方法を提供します。...

ゼブラフィッシュ胚の安定した、動的、および初期の微小管を分析する反応の利用

ここでは、生細胞紡糸ディスク共焦点顕微鏡法とMATLABベースの画像処理を用いてプロメタフェイズで同期した細胞における微小管ダイナミクス解析の堅牢かつ詳細な方法を提示する。...

単極有糸状スピンドルにおけるスピンディスク顕微鏡による微小管ダイナミクスの測定

このプロトコルは、培養細胞や単一マウス脳などの中小規模の源からのチューブリン精製を、重合および非重合サイクルを用いて記述する。精製されたチューブリンは、特定のアイソタイプで濃縮されるか、または特定の翻訳後修飾を有し、微小管のダイナミクスおよび相互作用を研究するためにインビトロ再構成アッセイで使用することができる。...

重合・脱重合サイクルによる限定的な供給源からの制御された翻訳後修飾と同一型を用いたチューブリンの精製

ここでは、TIRF顕微鏡ベースの インビトロ...

TIRF顕微鏡による インビトロでの 架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化

ここでは、微小管束を in vitroで...

再構成された活性微小管束内の力を直接測定

ここで紹介するのは、微小管およびキネシンモーターから活性ネマティクスを調製する方法であり、タンパク質の調製および構築、ならびに活性ネマチック閉じ込めのためのウェルの使用を含む。...

微小管ベースのアクティブネマティクスの形成、閉じ込め、観察

このプロトコールは、小規模の装置に最適化されたブタの脳からのチューブリンの高収率単離技術について説明しています。単離手順は、共沈降アッセイと透過型電子顕微鏡を使用して in vitro...

ブタ脳組織からのチューブリン収量の最適化

ここでは、特定の微小管修飾酵素を欠くか含む可能性のある哺乳類細胞から内因性チューブリンを抽出し、特定の修飾のために富んだ微小管を得るためのプロトコルについて説明します。次に、抽出した微小管を精製した微小管結合タンパク質で修飾して、クライオ電子顕微鏡用のグリッドを準備する方法について説明します。...

クライオ電子顕微鏡による微小管-タンパク質複合体の研究のための哺乳類細胞からの修飾微小管抽出

このプロトコルでは、微小管ポリマーの力学を調査するのに適したマイクロ流体デバイスの設計と製造について詳しく説明します。マイクロファブリケーション、自動フロー制御、および計算モデリング技術の合成により、 in...

微小管ポリマーメカニクス研究のためのマイクロ流体工学に基づくアプローチの開発

学ぶマウス組織における微小管分画技術。安定微小管、不安定微小管、遊離チューブリンを定量的に分離し、構造的安定性を評価します。この方法はアルツハイマー病やがんなどの微小管関連疾患の治療研究に有用です。

マウス組織における安定微小管、不安定な微小管、遊離チューブリンを分離するための定量的微小管分画技術

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