Name: 薬物耐性表現型を調節する因子を同定するためのプールされたshRNAライブラリースクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 51 s
Description: 学ぶプールされたshRNAライブラリースクリーニングによる急性骨髄性白血病におけるシタラビン耐性を調節するエピジェネティック因子の同定法。MV4-11細胞株を用いたRNAiスクリーニングで治療標的を探索します。

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この研究は、バイオテクノロジー省の助成金BT / PR8742 / AGR / 36 / 773 / 2013からSRVへの資金提供を受けています。インドバイオテクノロジー省BT/COE/34/SP13432/2015およびインド科学技術省:EMR/2017/003880からP.B. RVSおよびP.B.は、それぞれWellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118およびIA/S/15/1/501842によってサポートされています。S.D.はCSIR-UGCフェローシップによって支援され、S.I.はICMRシニアリサーチフェローシップによってサポートされています。Abhirup Bagchi、Sandya Rani、CSCR Flow Cytometry Core Facilityのスタッフの協力に感謝します。また、ハイスループットシーケンシングとデータ解析を支援してくれたMedGenome Inc.にも感謝します。

インスティテューショナルバイオセーフティ委員会(IBSC)のガイドラインに従い、レンチウイルス(BSL-2)を処理するために適切な施設を使用してください。担当者は、レンチウイルスの取り扱いと処分について適切な訓練を受けるべきです。このプロトコルは、クリスチャン医科大学、ヴェローレのバイオセーフティガイドラインに従います。
1. shRNAの持続的かつ長期発現を得るための最も強力なプロモーターの選択
注:蛍光タンパク質を発現する異なるプロモーターを有するレンチウイルスベクターを用いて形質導入実験を行い、実験用に選択された細胞株においてshRNAsの安定的かつ長期発現を提供するプロモーターを同定することが不可欠である。この目的のために最も一般的に使用されるプロモーターは、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するhEF1α(ヒト伸長因子1α)、hCMV(ヒトサイトメガロウイルス)、およびSSFV(脾臓焦点形成ウイルス)プロモーターである(図2A)。
<ol><li>トリパンブルー排除法を用いて細胞数を行う。MV4-11 AraC R細胞を、8μg/mLポリブレンを含む10%RPMI培地(100U/mLペニシリンおよび100U/mLストレプトマイシンを添加した10%FBSを含むRPMI)に懸濁する。6 ウェルプレートの1.5mL培地/ウェルに1 x 106個の細胞を3連でシードする。</li>
	<li>異なる量の濃縮レンチウイルス(例えば、レンチウイルスの力価に応じて10 μL、20 μL、および40 μL)を各ウェルに加える。プレートを静かに回転させて内容物を混ぜます。</li>
	<li>920 x g 、37°Cで90分間遠心分離による散液を行う。</li>
	<li>直ちにプレートをCO2インキュベーター(37°Cで5%CO2)でインキュベートする。</li>
	<li>蛍光顕微鏡下で48時間後のGFP発現を観察し、形質導入の成功を確実にした。</li>
	<li>72時間後にフローサイトメトリーによりGFP発現を定量し、形質導入効率を評価した。</li>
	<li>細胞を合計2週間培養し、フローサイトメトリーによってGFP発現を定期的にモニターした。平均蛍光強度およびGFP+細胞の割合によって測定されたGFP発現の減少は、プロモーターサイレンシングを示す。</li>
	<li>10日目にGFP+細胞を選別し、選別後1週間培養した。培養中にGFP発現を定期的に確認する。</li>
	<li>形質導入されていない細胞を使用してゲートを設定します。x 軸の右側に向かって 1 x10 1 スケールを超える母集団は、GFP の正の母集団と見なされます。</li>
	<li>細胞の長期培養においてGFPの持続的な発現を示すプロモーターを選択する。</li>
</ol>2. プールされたレンチウイルスヒトエピジェネティック因子shRNAライブラリーの作製
<ol><li>各プレートに8mLの10%DMEM培地(100U/mlペニシリンおよび100U/mlストレプトマイシンを含む10%FBSを含むDMEM)を用いて、3つの10cm細胞培養皿で293T細胞を(低い継代数で良好な増殖速度で)培養した。</li>
	<li>細胞が60%のコンフルエント性に達したら、培地を完全な培地と交換する。</li>
	<li>無血清培地、レンチウイルスパッケージング(psPAX2)およびエンベローププラスミド(pMD2.G)、プールされたライブラリープラスミド、最後にトランスフェクション試薬を含むトランスフェクションミックス( 表1に概説)を準備します。</li>
	<li>混合物をタップしてよく混合し、室温で15分間インキュベートする。</li>
	<li>トランスフェクション混合物を293T細胞に加え、プレートを旋回させて穏やかに混合する。プレートをCO2インキュベーター(37°Cで5%CO2)でインキュベートする。24時間後に培地を交換してください。</li>
	<li>48時間後、蛍光顕微鏡下でGFP発現をチェックし、293T細胞において高いトランスフェクション効率を確保した。</li>
	<li>48時間、60時間、および72時間後にウイルス上清を収集し、4°Cで保存する。 ウイルスを回収した後の各時点で新鮮な培地(8mL)を加える。</li>
	<li>ウイルスの上清をプールします。プールされたウイルスの総量は、〜8 mL /プレート x 3 コレクション= 〜24 mL /プレートになります。〜24 mL/プレート x 3 プレート = 3 プレートから〜 72 mL。</li>
	<li>プールされたウイルスを 0.4 μm フィルターでフィルター処理します。</li>
	<li>ウイルスの高力価を得るためには、プールされたウイルスを超遠心分離により濃縮する。ろ過したウイルス上清を2本の70Tiチューブ(32mL/チューブ)に移し、18,000x g でゆっくりと加速および減速しながら2時間遠心分離します。ローターを使用し、遠心分離機を4°Cに予冷した。</li>
	<li>遠心分離機からチューブを静かに取り出し、上清を完全に取り除きます。</li>
	<li>マイクロピペットを使用して、ペレットを400μLのDMEM(FBSおよび抗生物質なし)に穏やかに再懸濁する。氷上で1時間インキュベートし、両方のチューブからペレットを混合する。</li>
	<li>ウイルスをアリコートし、−80°Cで凍結する。 注: チューブとウイルスは、手順 2.10.-2.13 の間、氷の上に保管する必要があります。プレーン培地でウイルスを再懸濁させている間は泡立ちを避けてください。培地は4°Cに維持する必要があります。</li>
	<li>以下のようにウイルスの濃度(x)を計算します。 濃縮前の総容量 = 72 mL (72,000 μL) 濃縮後の容量 = 400 μL 濃度 = 72,000/400 = 180x</li>
</ol>3. レンチウイルスの形質導入効率の推定
<ol><li>濃縮ウイルスを異なる容量(2 μL、4 μL、8 μL)で293T細胞に形質導入し、レンチウイルスの調製が成功したことを確認します。 注:濃縮ウイルスが少量(1〜2μL)で高い形質導入効率(>50%)を示す場合、濃縮ウイルスを所望の量(100倍〜75倍)で希釈することをお勧めします。</li>
	<li>濃縮したウイルスをDMEM(FBSおよび抗生物質なし)で100倍に希釈し、MV4-11 AraC R細胞株で滴定実験を行った。</li>
	<li>6ウェルプレートの1ウェルに1 x106 細胞(8 μg/mLポリブレンを含む1.5 mLの10%RPMI培地中のMV4-11 AraC R細胞株)をシードした。異なる量のウイルスと形質転換するための4つのウェルを準備します。</li>
	<li>4 つの異なる容量 (1 μL、1.5 μL、2 μL、および 2.5 μL) の 100 倍のウイルスを追加します。</li>
	<li>プレートを920 x g で37°Cで90分間遠心分離して製糸を行う。</li>
	<li>72時間後、GFP+細胞の割合をフローサイトメトリーにより測定する。</li>
	<li>ウイルスの体積を決定し、30%の形質導入効率を得る。この低い形質導入効率は、細胞当たり単一のshRNA組み込みを確実にするためである。</li>
</ol>4. 薬剤耐性細胞株におけるプールされたエピジェネティックshRNAライブラリーの形質導入
<ol><li>標的細胞株MV4-11 AraC Rを0.5 x106 細胞/mLの密度に維持する。細胞が培養中の指数関数的な成長段階にあることを確認します。</li>
	<li>ウイルス組積物の数に基づいて、以下のように実験のために採取する細胞数を計算する。 形質導入に必要な細胞数 = 5,485 (shRNA の数) × 500 (shRNA 表現の倍) / 0.25 (MOI) = 10,982,000 ~ 11 x 106 細胞</li>
	<li>16 mLの10%RPMI培地に1.1 x107 細胞を再懸濁する。</li>
	<li>ポリブレン(8μg/mL)を加え、よく混ぜる。次に、必要な量のウイルスを追加して、前のセクションで計算した 30% の形質導入効率を得ます。</li>
	<li>すべての細胞を 6 ウェルプレート上に、1 x106 細胞/1.5 mL の密度の 10% RPMI 培地で播種します。</li>
	<li>プレートを37°Cで920 x g で90分間遠心分離します。</li>
	<li>プレートをCO2インキュベーター(37°Cで5%CO2)中で一晩インキュベートする。</li>
	<li>24時間後、培地を交換し、形質導入細胞をT−75フラスコに移した。</li>
	<li>48時間後、蛍光顕微鏡下でGFPをチェックし、形質導入が成功したことを確認します。</li>
	<li>72時間後、フローサイトメトリーによりGFP+細胞の割合を定量する。</li>
</ol>5. GFP陽性細胞の濃縮
注: 形質導入細胞を 0.5 x106 cells/mL の密度で 5 ~ 7 日間培養して、細胞を展開します。これらの細胞は、形質導入と形質導入されていないものの混合集団であり、次のステップで述べたように、ソートによってGFPに基づいて選択される。
<ol><li>GFP+ 形質導入細胞のフローソーティングは、フローソーティング設定を高純度および低収率に設定して実行します。形質導入されていない細胞を使用してゲートを設定します。右側の 1 x 102 を超える母集団は、陽性集団と見なされます。</li>
	<li>選別した細胞を5% RPMI(100 U/mLペニシリンおよび100 U/mLストレプトマイシンを添加した5% FBSを含むRPMI)で収集する。</li>
	<li>選別した細胞を10%RPMI培地で培養する。</li>
	<li>72時間後、GFP+細胞の割合のソート後推定を行い、>95%のソーティング効率を確保します。 注:shRNAライブラリーの450倍〜〜500倍の表現を得るために、選別後に〜3〜5 x106 個のGFP陽性細胞を得るようにしてください。</li>
</ol>6. 薬剤耐性を媒介するエピジェネティック因子を同定するためのドロップアウトスクリーニング
<ol><li>shRNAライブラリー形質導入細胞を10%RPMIで最大5日間培養する。必要に応じて、薬物処理の前に、将来の実験のために形質導入細胞を凍結保存する。</li>
	<li>1 x107 個の細胞を280 x gで25°Cで5分間複製して遠心分離する。 上澄み液を捨て、ペレットを−80°Cで保存する。 これらのサンプルは、エピジェネティックなshRNAライブラリーのベースラインリファレンスとして役立つでしょう。</li>
	<li>残りの形質導入細胞を複製物(R1およびR2)として培養し、それぞれがライブラリーの500倍表現を提供する細胞数で維持する。</li>
	<li>重複の一方を薬物(10μMシタラビン)(R2)で治療し、もう一方を薬物治療(R1)なしで治療する。</li>
	<li>フラスコの培地を72時間ごとに薬物の有無にかかわらず交換する。9日間の累積薬物曝露について培地交換を3回繰り返す。</li>
	<li>薬物処理の9日後、トリパンブルー排除法により細胞の生存率を確認する。</li>
	<li>残りの細胞を280 x g で室温で5分間遠心分離する。細胞を滅菌PBSに再懸濁し、細胞を洗浄する。室温で280 x g で5分間遠心分離機。</li>
	<li>上清を捨て、ペレットを−80°Cで保存してDNA抽出する。</li>
</ol>7. PCRによる集積shRNAの増幅
<ol><li>形質導入ベースライン細胞(T)からDNAを抽出し(ステップ6.2)、薬物で処理した細胞(R2)および薬物で処理していない細胞(R1)を抽出する。</li>
	<li>蛍光光度計を用いて試料の濃度を確認する。</li>
	<li>PCRに必要なDNAの量を以下のように計算します。 5,485 (いいえ。shRNA の) × 500 (shRNA 表現) × 1 x 6.6−12 (g/二倍体ゲノム) = 15 μg の DNA</li>
	<li>サンプルをPCRの第1ラウンドに供する。 注:PCR反応混合物をサーマルサイクラー条件下で 表2 に示します。プライマーの詳細は、 補足表1に提供される。</li>
	<li>チューブあたり 850 ng の DNA を含む複数の反応を設定します (合計 43 回の反応)。 注: PCR の第 1 ラウンドでは、shRNA の隣接する領域が増幅され、アンプリコンサイズは 397 bp になります。</li>
	<li>PCR 産物をプールし、標準ゲル/PCR 精製キットの 3 ~ 4 カラムを使用して PCR 産物を精製します。 メモ: 詳細については、 表 3 を参照してください。</li>
	<li>各カラムから 50 μL のバッファーで生成物を溶出し、溶出液をプールします。</li>
	<li>DNAを定量し、-20°Cで保存する。 注:試薬は、サーマルサイクラー条件とともに 表4 に表されています。第 2 ラウンド PCR では、シングルフロー細胞内の NGS での多重化に必要な INDEX 配列を持つプライマーを利用します。したがって、各サンプルには異なるインデックスを付ける必要があります。プライマー配列は、 補足表1に提供される。</li>
	<li>各サンプルおよび陰性対照について、500 ng の一次 PCR 産物を総反応量 50 μL で 4 つの反応をセットアップします。</li>
	<li>2%TBEアガロースゲルを用いて電気泳動のために製品全体をロードし、1kb分子ラダーを用いてバンドサイズを確認した。アンプリコンのサイズは399bpである。</li>
	<li>ゲル文書化システム上のPCR産物を視覚化します。</li>
	<li>特定のバンドを切除し、ゲル精製キットを用いて精製する。 注: キットを使用した精製の計算は、 表 3 に示されています。</li>
	<li>溶出バッファーの最終容量 30 μL で溶出します。各溶離液のおおよその濃度は、総容量30μLで約80〜90ng/μLです。</li>
</ol>8. 次世代シーケンシングとデータ解析
<ol><li>ゲル精製物をステップ7.13から配列決定する。次世代シーケンサー(例えば、イルミナ)上で、枯渇したshRNAの読み取りカウントを取得する。</li>
	<li>生成された FastQ 読み取りのアダプター シーケンスを、Fastx ツール キット (バージョン 0.7) を使用してトリミングします。</li>
	<li>フィルター処理された読み取り値を、2 つの不一致を許可するパラメーターを持つボウタイ アライナーを使用して参照シーケンスに揃えます。アダプターのトリミング後の読み取り長さが約 21 bp であることを確認します。</li>
	<li>Samtools (バージョン 1.9) プログラムを使用してファイルをロードします。Flagstat オプションを使用して、配置の要約を計算します。</li>
	<li>トリミングしたfastQファイルをCRISPRCloud2(CC2)ソフトウェア(https://crispr.nrihub.org/)に参照shRNA配列とともにFASTAファイルの形式でロードし、指示に従って解析を実行します。<ol>
<li>CC2の [分析の開始] リンクをクリックします。</li>
		<li>画面タイプを「サバイバル画面」画面および「ドロップアウト画面」として選択します。グループ数を設定し、各グループの名前を入力します。</li>
		<li>参照ライブラリを FASTA ファイル形式でアップロードします。アップロードされたデータが処理されます。出力URLをクリックして結果を取得します。 注:このソフトウェアは、修正されたスチューデントのt検定によるβ二項モデルを使用してsgRNA/shRNAレベルの差を測定し、続いてフィッシャーの複合確率検定を使用して遺伝子レベルの有意性を推定します。これは、処理済み(濃縮/枯渇)と未処理サンプル(ベースライン)の間のエピジェネティック因子について、shRNAの推定総log2倍変化(Log2Fc)を「p値」および「FDR値」で計算します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>FDR 値がドロップアウト画面では「ネガティブ」、サバイバルスクリーンでは「ポジティブ」であることを確認します。 注:CC2は、読み取りをカウントし、サンプル間のshRNAのフォールド表現(濃縮または枯渇)を計算するための分析プラットフォームです。</li>
	<li>CC2の結果から有意に濃縮および枯渇したshRNA(FDR <0.05)を同定する。 注:各因子に対して5〜24個のshRNAがあります。各 shRNA の FDR 値を確認します。<0.01であるFDRを考え、選択されたshRNAの平均を取る。トップ40のヒットを考えてみましょう。選択した因子のグラフを、Log2FcまたはFDRの負の値に基づいてプロットします。非標的化shRNAが制御shRNAとして機能するようにデータの信頼性を確保するために、有意なFDR値も有していることを確認してください。</li>
</ol>

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</ol>

著者には利益相反はなく、開示するものもありません。

RNA干渉(RNAi)は、siRNAおよびshRNAスクリーニングを含む機能ゲノミクス研究に広く使用されている。shRNAの利点は、それらをプラスミドベクターに組み込んでゲノムDNAに組み込むことができ、安定した発現をもたらし、したがって標的mRNAのより長期のノックダウンをもたらすことである。プールされたshRNAライブラリースクリーニングは、従来のアレイスクリーニング(siRNA)と比較して堅牢で費用対効果が高い。ゲノムワイドスクリーンで特定のクラスのタンパク質の本質を特定することは、面倒な作業です。標的スクリーニングアプローチは、特定のクラス内の癌細胞の生存または薬剤耐性に対する個々のタンパク質の本質的な性質を、ノイズを低減して明らかにすることができる。このプロトコルは、必須遺伝子と非必須遺伝子の両方を体系的に調べるためのエピジェネティック因子のRNAiスクリーニングを強調し、AML薬剤耐性の原因となる標的の同定を可能にする機能的プラットフォームとしてのこのアプローチの使用を実証する。
この強力な技術は、実験の設計と実行において一定の予防措置を必要とします。第1は、shRNA...

急性骨髄性白血病(AML)の治療選択肢は、シタラビン(AraC)とアントラサイクリンをこの疾患を治療するための礎石として、過去50年近く変わっていません。AML療法の成功に対する課題の1つは、化学療法に対する白血病幹細胞の耐性であり、疾患の再発につながる1,2。エピジェネティックな調節は、がんの病因および薬剤耐性において重要な役割を果たしており、いくつかのエピジェネティックな因子が有望な治療標的として浮上している3,4,5。エピジェネティックな調節機構は、化学療法薬への継続的な曝露下での増殖および生存に影響を及ぼす。非血液学的悪性腫瘍における研究は、薬物効果を克服する細胞のごく一部が様々なエピジェネティクス修飾を受け、それらの細胞の生存をもたらすことを報告している6,7。しかしながら、AMLにおけるシタラビンに対する後天性耐性を媒介するエピジェネティック因子の役割は、探求されていない。
ハイスループットスクリーニングは、時間の経過とともに世界的に重要性を増してきた創薬へのアプローチであり、細胞メカニズム、経路プロファイリング、および分子レベルで潜在的な標的を同定するためのさまざまな側面で標準的な方法となっています8,9。合成致死性の概念は、どちらかの遺伝子のみの摂動が実行可能であるが、両方の遺伝子の同時実行可能性の喪失をもたらす2つの遺伝子間の相互作用を含む10。がん治療における合成致死性を利用することは、堅牢な合成致死的遺伝的相互作用を特定し、機械的に特徴付けるのに役立つ可能性がある11。我々は、AMLにおける後天性シタラビン耐性の原因となるエピジェネティック因子を同定するために、合成致死性を有するハイスループットshRNAスクリーニングのコンビナトリアルアプローチを採用した。
混合系統白血病遺伝子(MLL または KMT2A)の染色体転座によって引き起こされる急性白血病は、患者の生存率の低下と関連していることが知られている。得られたMLL遺伝子再構成のキメラ産物、すなわちMLL融合タンパク質( MLL-FP )は、造血幹/前駆細胞(HSPC)を複数のエピジェネティック因子の関与により白血病芽細胞に変換することができる。これらのエピジェネティックな調節因子は、白血病プログラムの維持を指示する複雑なネットワークを構成し、したがって、潜在的な治療標的を形成する可能性がある。この文脈で、我々はMV4-11細胞株(FLT3-ITD変異を有するMLL融合遺伝子MLL-AF4を保有し、MV4-11Pと称される)を用いて、MV4-11 AraC Rとして知られる後天性シタラビン耐性細胞株を開発した。細胞株は、薬物の休日として知られている薬物治療からの断続的な回復を伴うシタラビンの用量の増加に曝露された。半最大阻害濃度(IC50)を インビトロ 細胞傷害性アッセイにより評価した。
我々は、pZIPレンチウイルス骨格を有するhEF1aプロモーターによって駆動されるプールされたエピジェネティックshRNAライブラリー( 材料表を参照)を使用した。このライブラリーは、407のエピジェネティック因子を標的とするshRNAを含む。各因子には5~24個のshRNAがあり、5個の非標的対照shRNAを含む合計5,485個のshRNAがあります。修飾された「UltrmiR」miR−30スキャフォールドは、効率的な一次shRNA生合成および発現12、13のために最適化されている。
この実験の概要を 図1Aに示します。現在のプロトコルは、浮遊細胞株であるMV4-11 AraC R細胞株(図1B)におけるエピジェネティック因子shRNAライブラリーを用いたRNAiスクリーニングに焦点を当てています。このプロトコルは、任意の薬剤耐性細胞株中の任意の標的ライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。形質導入プロトコルは、接着細胞について異なるであろうことに留意されたい。

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 bp ラダー ハイパーラダー</td><td>BIOLINE</td><td>BIO-33025</td><td></td></tr><tr><td>1kb ラダー ハイパーラダー</td><td>BIOLINE</td><td>BIO-33056</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>ロンザ Seachekm</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>ベタイン (5mM)</td><td>シグマ</td><td>B03001VL</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>クオリゲン</td><td>12005</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プラスチック製品</td><td>コーニング</td><td>適性</td><td></td></tr><tr><td>シトシン &β;-D-アラビノフラノシド塩酸塩</td><td>Σ</td><td>C1768-500MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>MP BIO</td><td></td><td></td></tr> 91233354 <tr><td>DMSO</td><td>Wak Chemie GMBH</td><td>Cryosure DMSO 10ml</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Σ</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>臭化</td><td>エチジウムSigma</td><td>E1510-10 mL</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>ゲル/PCR 精製キット</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>REF&nbsp;740609.50</td><td></td></tr><tr><td>Gibco- RPMI 1640</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>サイエン</td>ティフィック 23400021 <td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>Thermo</td><td>Q11007</td><td></td></tr><tr><td>hCMV GFP プラスミド</td><td></td><td>トランスオミクス トランスオミクス プロモーター選択キット</td><td></td></tr><tr><td>hEF1a GFPlasmid</td><td>トランスオ</td><td>ミクス トランスオミクス プロモーター選択キット</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>HL60細胞株</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td></td></tr><tr><td>KOD ホットスタートポリメラーゼ</td><td>Merck</td><td>71086</td><td></td></tr><tr><td>Molm13細胞株</td><td>Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MV4-11 cell line</td><td>ATCC</td><td>CRL-9591</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15140122 psPAX2 および pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>Addgene プラスミド no.12260 &Addgene プラスミド no. 12259</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>REF Q32854</td><td></td></tr><tr><td>SFFV&nbsp;GFP Plasmid</td><td>Transomics</td><td>TransOmics Promoter selection KIT</td><td></td></tr><tr><td>shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics</td><td>Transomics</td><td>Cat No.TLH UD7409;ロット番号:A116。V 132.14</td><td></td></tr><tr><td>Trans-IT-LTI Mirus</td><td>Mirus Mirus</td><td>カタログ番号: MIR2300</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>MP Biomedicals</td><td>0219485591</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultra 遠心分離管</td><td>ベックマン・コールター</td><td>&nbsp;103319</td><td></td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% CO2インキュベータ</td>ー <td>サーモフィッシャーBD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aria III細胞選別機</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベックマン・コールター オプティマL-100K-超遠心分離</td><td>機 ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離</td><td>機 サーモマルチージ 3SR+</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDocイメージングシステム&nbsp;(Fluro Chem M system)</td><td>Fluro Chem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica AF600</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light Microscope</td><td>Zeiss Axiovert 40c</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

薬物耐性表現型を調節する因子を同定するためのプールされたshrnaライブラリースクリーニング

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

急性骨髄性白血病(AML)患者の耐性を回避し、生存率を改善する方法を解明するためには、後天性化学抵抗性の臨床的に関連するドライバーメカニズムを理解することが不可欠です。化学療法を生き延びた白血病細胞のごく一部は、化学療法的侮辱に耐えうるエピジェネティックな状態にある。化学療法へのさらなる曝露は、これらの薬物持続細胞が固定エピジェネティック状態を達成することを可能にし、これは遺伝子発現の変化をもたらし、これらの薬物耐性集団の増殖をもたらし、最終的には再発または難治性疾患をもたらす。したがって、薬剤耐性白血病細胞の生存を必要とするエピジェネティックな変調を同定することは極めて重要である。我々は、ヌクレオシド類似体シタラビン(AraC)に対する耐性を媒介するエピジェネティックモジュレーターを同定するためのプロトコルを、獲得シタラビン耐性AML細胞株におけるプールされたshRNAライブラリースクリーニングを用いて詳述する。このライブラリーは、407のヒトエピジェネティック因子を標的とする5,485のshRNAコンストラクトで構成されており、ハイスループットのエピジェネティック因子スクリーニングを可能にします。

スクリーニングワークフロー全体を図1Aに示します。MV4−11 AraC Rのインビトロ細胞傷害性(48時間)は、MV4−11 AraC R中のシタラビンに対するIC50がMV4−11 Pよりも高いことを明らかにした(図1B)。この細胞株を、シタラビン耐性の原因となるエピジェネティック因子をスクリーニングするためのモデルとして研究に使用した。
図2A は、hEF1α(ヒト伸長因子1α)、hCMV(ヒトサイトメガロウイルス)、SSFV(脾臓焦点形成ウイルス)の3つの異なるプロモーターを用いた線状化pZIPベクターマップを示し、UltramiR配列内にスクランブルされたshRNAを有する。 図2B は、ライブラリ実験で用いたpZIPベクターマップと、hEF1aプロモーターによって駆動される選択マーカ...

レンチウイルスshRNAのプールを用いたハイスループットRNA干渉(RNAi)スクリーニングは、悪性腫瘍における治療上重要な合成致死的標的を検出するためのツールとなり得る。我々は、急性骨髄性白血病(AML)におけるエピジェネティックなエフェクターを調査するために、プールされたshRNAスクリーニングアプローチを提供する。

薬物耐性表現型を調節する因子を同定するためのプールされたshRNAライブラリースクリーニング

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

以下のビデオの全体的な目標は、ネガティブセレクションスクリーニングを実施するためにプールされたshRNAエピジェネティックライブラリーの使用を実証することである。このスクリーニングにより、シーケンシングを通じて特定のエピジェネティックな標的を同定することができます。この手順は、AMLにおける後天性シタラビン耐性を媒介する原因となるエピジェネティック因子を同定するのに役立ち得るステップは以下の通りである。shRNAsの持続的かつ長期発現を得るための最も強力なプロモーターの選択。現在のプロトコールは、シタラビン耐性MV4-11細胞株におけるエピジェネティック因子shRNAライブラリーを用いたRNAiスクリーニングに焦点を当てている。この目的に使用されるプロモーターは、ヒトEF−1アルファ、ヒトCMV、およびSFFVであり、緑色蛍光タンパク質を発現するプロモーターである。トリパンブルー排除法を用いて細胞数をとる。細胞を1mLあたり8マイクログラムのポリブレンを含む10%RPMI培地に懸濁する。6ウェルプレートのウェルあたり1.5mlの培地に100万個の細胞を3連で播種する。濃縮レンチウイルスの異なるボリュームを追加します。例えば、レンチウイルスは、例えば、10、20、および40マイクロリットルを、各ウェルに対するレンチウイルスの力価に依存する。プレートを静かに回転させて内容物を混ぜます。920g、摂氏37度で90分間遠心分離による製菌を行う。直ちにプレートを二酸化炭素インキュベーター内でインキュベートする。48時間の終わりにGFPを観察し、72時間の終わりに同じものを定量化します。次に、フローチャートに示されている手順に従って、培養物全体で一貫したGFP発現を示すプロモーターを選択します。プールされたレンチウイルスヒトエピジェネティック因子shRNAライブラリーの調製。各プレートに8mlの10%DMFM培地を用いた3つの10センチメートル細胞培養皿において良好な増殖速度を有する低い継代数で293T細胞を培養した。細胞が60%のコンフルエントに達したら、新鮮な培地と完全に交換する。無血清培地、レンチウイルスパッケージングプラスミドPAX2、エンベローププラスミドpMD2を含む概説どおりにトランスフェクションミックスを準備します。G、ライブラリープラスミドをプールし、最後にトランスフェクション試薬とした。混合物をタップしてよく混合し、室温で15分間インキュベートする。トランスフェクション混合物を293T細胞に加え、プレートを旋回させて穏やかに混合する。プレートを二酸化炭素インキュベーター内でインキュベートする。24時間後に培地を交換してください。48時間後、蛍光顕微鏡でGFP発現をチェックし、293T細胞への高いトランスフェクション効率を確保しました。48、60、72時間後にウイルス上清を回収し、4度で保存し、ウイルスを回収した後の各時点で新鮮な培地8mlを加えます。プールされたウイルスを 0.4 ミクロンのフィルターでフィルター処理します。ウイルスの高力価を得るためには、プールされたウイルスを超遠心分離により濃縮する。濾過したウイルス上清を70本のTiチューブに移し、18,000gで2時間遠心分離した。予冷ローターを使用し、4度で遠心分離機を使用してください。遠心分離機からチューブを慎重に取り出し、上清を完全に取り除きます。マイクロピペットを用いてFBSおよび抗生物質を含まない400マイクロリットルのDMEMにペレットを穏やかに再懸濁し、氷上で1時間インキュベートする。ウイルスをアリコートし、マイナス80度で凍結する。図に示すように、ウイルスの濃度を計算します。レンチウイルスの形質導入効率の推定293T細胞を異なる体積の濃縮ウイルス(2、4、および8)で形質導入し、レンチウイルスの調製が成功したことを確認した。ウイルスを100倍に濃縮した値を標的細胞株で滴定実験を行った。1mlあたり8マイクログラムのポリブレンを含む1.5mlの10%RPMI培地中の100万個の標的細胞株を6ウェルプレートの1ウェルにシードする。4 つの異なるボリューム 1、1.5、2、2.5 マイクロリットルの 100X ウイルスを追加します。プレートを920gで37°Cで90分間遠心分離して製芽を行う。72時間後、GFP陽性細胞の割合をフローサイトメトリーにより測定する。ウイルスの量を決定し、30%の形質導入効率を得る。この低い形質導入効率は、細胞当たり単一のshRNA組み込みを確実にするためである。薬剤耐性細胞株におけるプールされたエピジェネティックshRNAライブラリーの形質導入。ウイルス組積物の数に基づいて、以下のように実験のために採取する細胞の数を計算する。16 ML の 10%RPMI 培地に 1,100 万個の細胞を再懸濁します。ポリブレンを1mlあたり8マイクログラム加えてよく混ぜ合わせ、必要な量のウイルスを加えて、前に計算したように30%の形質導入効率を得る。すべての細胞を6ウェルプレート上に、ウェルあたり1.5mlあたり100万個の細胞の密度で播種する。プレートを摂氏37度で920gで90分間遠心分離する。プレートを二酸化炭素インキュベーター内で一晩インキュベートする。24時間後、培地を交換し、形質導入細胞をT-75フラスコに移した。48時間後、蛍光顕微鏡下でGFPをチェックし、形質導入が成功したことを確認します。72時間後、フローサイトメトリーによりGFPを定量する。GFP陽性細胞の富化。形質導入細胞を1mlあたり50万の密度で5~7日間培養して増殖させ、高純度・低収率に設定したフローソーティング設定でフローソーティングを行う。選別した細胞を10%RPMI培地で培養する。72時間後、GFP陽性細胞の割合の選別後推定を行い、95%以上の選別効率を確保した。薬物耐性を媒介するエピジェネティック因子を同定するためのドロップアウトスクリーニング。shRNAライブラリー形質導入細胞を10%RPMIで最大5日間培養する。1000万個の細胞を二重に遠心分離する。上清を捨て、ペレットをマイナス80度で保管する。これらのサンプルは、エピジェネティックなshRNAライブラリーのベースラインリファレンスとして役立つでしょう。残りの形質導入細胞を複製として培養し、R1およびR2を、それぞれライブラリーの500X表現を提供する細胞数で維持する。重複の1つを薬物、10マイクロモルのシタラビンで治療し、もう1つを薬物治療なしで治療する。フラスコの培地を薬物の有無にかかわらず、72時間ごとに交換する。9日間の累積薬物曝露について培地交換を3回繰り返す。薬物治療の9日目以降、トリパンブルー排除法により細胞の生存率を確認する。残りの生細胞をスピンダウンし、滅菌PBSで洗浄し、室温で5分間280gで遠心分離する。上清を捨て、DNA抽出のためにペレットをマイナス80で保存する。PCRによる集積shRNAの増幅。形質導入されたベースライン細胞からDNAを抽出し、処理細胞および未処理細胞、続いて蛍光光度計を用いて濃度を確認し、図示のように必要なDNA量を計算し、サンプルを第1ラウンドのPCRに供した。PCR反応混合物をサーマルサイクラー条件とともに表2に示します。チューブあたり850ナノグラムのDNAを含む複数の反応をセットアップし、合計43の反応を行います。PCR産物をプールし、精製する。製品を50マイクロリットルの緩衝液で溶かして定量し、最後にマイナス20で保存します。第2ラウンドPCRの場合、リバースインデックスプライマーを使用し、試薬を表4に表します。ネガティブコントロールとともに、各サンプルの総反応容量50マイクロリットルで500ナノグラムの一次PCR産物を用いて4つの反応をセットアップする。2%TBEアガロースゲルを用いて電気泳動のために製品全体をロードし、1KB分子ラダーでバンドサイズを確認します。ゲル文書化システム上のPCR産物を視覚化します。特定のバンドを切除し、ゲル精製キットを用いて精製する。キットを用いた精製の計算を表3に提供する。各溶離液のおおよその濃度をマイクロリットルあたり約80〜90ナノグラムの溶出緩衝液の最終容量30マイクロリットルで溶出する。次世代シーケンシングとデータ分析。ゲル精製産物は、枯渇したshRNAニーズに対する読み取りカウントを得るために、次世代シーケンシングに供されます。アダプター・シーケンスをトリミングし、フィルターで取り込んだ読み取り値を参照シーケンスにアラインメントし、SAMtools を使用してファイルをロードしてアラインメント・サマリーを取得します。トリミングされた fastQ ファイルを CRISPRCloud2 にロードし、指示に従って分析を実行します。CRISPRCloud2 に用意されているリンクをクリックします。画面タイプを「サバイバル画面」画面および「ドロップアウト画面」として選択します。グループ数を設定し、各グループの名前を入力します。参照ライブラリを FASTA ファイル形式でアップロードします。アップロードされたデータは処理され、結果は指定されたURLで利用できます。代表的なデータ。この図は、シタラビン濃度の増加で処理されたMV4−11親および耐性細胞、0.1マイクロモル〜1,000マイクロモル、およびMTTアッセイによる生存率評価を示す。この図は、ヒトEF−1アルファ、ヒトCMV、およびSFFVプロモーターについて72時間の終わりにフローサイトメトリーによって定量されたGFPの代表的なフロープロットを示す。ヒトCMVは不均一なピークを示し、ヒトEF-1アルファおよびSFFVは単一の均質なピークを示す。この図は、MV4−11における3つの異なるプロモーター効率についての棒グラフを示す。SFFV駆動GFPは、長期培養においてGFPのサイレンシングを示した。hEF−1α駆動GFP細胞は、これらの細胞の選別後に持続的な発現を示した。左パネルは、蛍光顕微鏡下での48時間の終わりに293TでトランスフェクトされたプールされたshRNAライブラリーのトランスフェクション効率を示す。右側のパネルは、さまざまなウイルス体積(2、4、および8マイクロリットル)を有する293T細胞におけるプールウイルスの形質導入効率を示す。この図は、30%の形質導入効率を達成するために1、1.5、2、2.5マイクロリットルのような様々な体積のウイルスを有するMV4-11耐性細胞株における形質導入効率を表す。この図は、高純度かつ低収率の選別設定で30%の形質導入効率を有するGFP陽性細胞の選別を示す。図は、9日間の長期シタラビン曝露に対するGFP陽性選別細胞に対する薬物処理の概略図を示し、続いて生存率をチェックし、DNAについて細胞を採取する。この図は、PCRの第1および第2ラウンドで用いたプライマーの結合領域を示す。この図は、第1ラウンドPCRの終了時のPCR産物のバンドサイズ、397塩基対、および第2ラウンドPCR産物399塩基対を、ゲル溶出、精製し、NGSについて与えたものである。この図は、AMLにおけるシタラビン耐性を媒介する可能性のあるエピジェネティック因子を標的とする濃縮または枯渇shRNAの表現を示す。結論。このプロトコルは、必須遺伝子と非必須遺伝子の両方を体系的に調査するための標的ノックダウンスクリーニングの重要性を強調し、このアプローチを機能的プラットフォームとして使用し、薬剤耐性の原因となる標的の同定を可能にすることを実証する。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

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薬物耐性表現型を調節する因子を同定するためのプールされたshRNAライブラリースクリーニング

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