Name: 蚊やショウジョウバエに対する殺虫剤毒性を定量するための局所適用バイオアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 学ぶ、蚊やショウジョウバエを用いた局所適用バイオアッセイによる殺虫剤感受性の定量法。質量相対化半数致死量を算出し、抵抗性比較の精度を向上させる手法です。

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この研究は、米国国立科学財団からSHへのCAREER賞(受賞番号2047572)によって支援されました。我々は、ショウジョウバエの飼育と局所適用アッセイの準備におけるダミアン・リベラの支援、ウィスコンシン大学マディソン校のガネツキー博士のカントンSショウジョウバエ株の共有、ロックフェラー株の共有のための疾病管理予防センター、IICCアイソリン株の共有のための米国農務省医療農業獣医昆虫学センターに感謝する。 図 1 は、 BioRender.com を使用して作成されました。

著者らは利益相反がないと宣言しています。

蚊は、人間に伝染する病気のために毎年70万人以上の死亡の原因となっており、その半数以上がマラリアのみによるものです1。マラリアおよび他のベクター媒介性疾患の伝染に対する主な予防方法は、しばしば長持ちする殺虫剤ネットまたは屋内残留散布2の形態で殺虫剤を使用することである。しかし、殺虫剤耐性は、蚊および他の昆虫ベクター、ならびに農業害虫3,4の間で広まっている。レジスタンスを効果的に管理するためには、監視が非常に重要です5.そのためには、高精度で高スループットの抵抗検出方法が必要です。現在、蚊のための最も広範な殺虫剤耐性監視ツールは、WHOチューブ試験6およびCDCボトルバイオアッセイ7である。ショウジョウバエの場合、残留接触施用法(CDCボトルバイオアッセイに類似)は、一般的に使用される殺虫剤バイオアッセイ8、9、10である。しかしながら、これらの方法からのデータの変動性は典型的に高く、同じ実験室の蚊株の測定値は、CDCボトルアッセイで〜20〜70%、致死量以下の用量にさらされた場合のWHO管試験で0〜50%の範囲である11。このような変異は、ほとんどの実験室株における限られた遺伝的変異が、集団における限定的な殺虫剤感受性変動をもたらすと予想されるので驚くべきことである。それにもかかわらず、バイオアッセイ結果に観察された高レベルの変動が依然として存在する。
この変動の潜在的な原因は、表面を介した間接的な殺虫剤曝露、不均一な環境影響、同じ遺伝子型の個体間の正常な生物学的変動、および同じ集団の検体の質量の変動によるバイオアッセイ内の検体間の不均一な殺虫剤曝露の結果であり得る12.より高い再現性を有するあまり使用されない方法は、局所適用バイオアッセイである。このアッセイでは、殺虫剤を各昆虫13、14に直接塗布し、同じアッセイ内の異なる検体の不均一暴露の因子を除去する。しかし、この方法のスループットが遅いため、蚊の集団に対する殺虫剤感受性監視ツールとして日常的に使用されていません。この論文は、殺虫剤感受性の変化と相関するパラメータである昆虫塊の変動を補正しながら、よりスループットの高い曝露を可能にする局所適用バイオアッセイのための修正されたプロトコルを提示する12。可変殺虫剤曝露による死亡率データの騒音および質量関連変動の減少は、より正確な技術的耐性サーベイランスを可能にするであろう11,15。このようなデータは、表現型耐性を遺伝子マーカー、適応度パラメータ、および/またはベクター能力とより正確に関連付けるために使用することができる。さらに、このアッセイを他の昆虫種に容易に適応させることができることを実証するために、より小さな体の昆虫種であるショウジョウバエに対する局所適用バイオアッセイを使用する。
前述の残留接触用途の主な制限は、殺虫剤曝露が同じアッセイ内で検体ごとに異なる可能性があることである。CDCボトルバイオアッセイおよび接触法の場合、殺虫剤曝露は、同じアッセイの反復間で変化し得る。昆虫は、ガラス瓶の内側(CDCボトルバイオアッセイおよび接触法)または含浸紙(WHOチューブ試験)に分布する殺虫剤にさらされる。両面(ガラスおよび紙)における殺虫剤の濃度は、既知の遺伝子型の異なる種をスクリーニングすることによって既知であり、予め定められている。しかしながら、昆虫によって吸収される可能性があるために利用可能な量は、使用される表面、殺虫剤混合物成分、および殺虫剤が表面材料16、17にわたってどの程度均質に分布しているかによって大きく異なり得る。CDCボトルバイオアッセイでは、ボトルの内側の殺虫剤コーティングは、各実験室およびユーザーが採用する手順に依存する。WHOのチューブテストでは、殺虫剤処理された紙は集中的に生産されるため、ラボ全体で非常に均質である可能性が最も高いです。しかし、WHOチューブ試験では、暴露チューブは検体が非殺虫剤暴露金属メッシュ上に着陸して休むことを可能にし、各試験内の検体間で潜在的に不均一な殺虫剤曝露をもたらす。各方法で検体に拾い上げられ吸収された殺虫剤の実際の量は、まださらに調査する必要があります18.
さらに、CDCボトルバイオアッセイ、WHOチューブ試験、および接触法は、1つの所定の殺虫剤濃度のみを試験する閾値アッセイとして最も一般的に使用される。このアプローチは、抵抗の存在を正確に検出することができ、抵抗監視(特に抵抗が広がっている場合)にとって有益です。しかし、閾値アッセイでは耐性の強さを定量化できず、介入ツールの有効性をより予測できる可能性があります。これらの方法で複数の殺虫剤濃度を使用する場合、それらは強度アッセイとして使用することができる。CDCボトルバイオアッセイおよびWHOチューブ試験のための強度アッセイは、サーベイランス6、19におけるこのギャップに対処するために、所定の識別用量の5倍および10倍を試験することによって導入されている。耐性集団を区別するより大きな能力を提供する一方で、3〜5(予め決定された)投与量は、致死濃度を計算するための限られた分解能を提供する。さらに、様々なサイズの蚊がそのようなアッセイに使用される。しかし、単位質量当たりの有効線量はより小さな生物のそれよりもはるかに低いため、より大きな標本を殺すためにより高い線量を必要とする可能性があるため、質量を測定することは重要です12。質量相対化された致死量(昆虫質量あたりの殺虫剤の量)を計算することは、性別、集団、および遺伝子型間の昆虫質量の変動を考慮するため、より一般的な致死濃度(例えば、表面積あたりの殺虫剤の量)よりも有用な指標であろう。このようなデータは、実験室および現場における遺伝子型耐性と表現型耐性との間のギャップを埋めるのに役立ち、また、既知の平均質量の昆虫の集団を治療するために必要な適用濃度を計算する簡単な方法を提供する可能性がある。
検体の50%(LD 50)を殺す大量相対化致死量の使用には、他にもいくつかの利点があります。mg/kg(= ng/mg)単位の特定の化合物の毒性の評価は、ヒトおよび獣医の毒物学14において標準的であり、LD50 値は物質安全データシートに記載されています。致死的投与量はまた、特定の種に対する異なる化学物質間の毒性の直接比較、または異なる種20に対する同じ化学物質の毒性の直接比較、ならびに新規殺虫剤および化学物質13の高品質評価を可能にする。さらに、LD50 は、診断用量死亡率結果から導出されたものよりも有意義で正確な耐性比を提供することができ、これは集団中に存在する耐性レベルの過大評価をもたらし得る。したがって、このアッセイは、他のバイオアッセイに推奨されるよりも多くの検体に由来する大量相対化致死量に基づくより厳密な耐性モニタリングを提供することにより、日常的なサーベイランスプログラムに適しているであろう21。
局所適用方法は、耐性がすでに既知または疑われる場合の標準的な殺虫剤感受性バイオアッセイの代替として、蚊およびハエの殺虫剤感受性サーベイランスにおいて使用されてきた22,23、ならびに耐性プロファイルおよび殺虫剤固有毒性をより正確に評価するためのいくつかの害虫昆虫24におけるサーベイランス21.局所適用バイオアッセイでは、殺虫剤が各生物に適用され、殺虫剤曝露の変動が最小限に抑えられる。この論文は、殺虫剤曝露を短期間で多数の昆虫に適用し、昆虫塊22を防除することを可能にする、わずかに適応され改良された方法を提示する。良好なレベルの再現性を備えたこの高スループットの方法は、日常的な殺虫剤感受性監視のための有用な追加ツールとなり得る。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>Thomas Scientific</td><td>20A00L068</td><td>アセトンアリコート保存</td></tr><tr><td>1.5 mL スクリューキャップチューブ</td><td>Thomas Scientific</td><td>1182K23</td><td>殺虫剤希釈保存</td></tr><tr><td>15 mLコニカルチューブ</td><td>VWR</td><td>339651</td><td>殺虫剤希釈保存</td></tr><tr><td>20 mLガラスシンチレーションバイアル</td><td>Fisher Scientific</td><td>0334125D</td><td>ショウジョウバエ計量</td></tr><tr><td>25 &mu;L シリンジ</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>14815288</td><td>局所アプリケーター</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>AC423240040</td><td>ACS 99.6%, 4 L</td></tr><tr><td>Aedes aegypti (IICC 株)</td><td>USDA CMAVE</td><td>NA</td><td>殺虫剤耐性</td></tr><tr><td>ネッタイシマカ (ロックフェラー株)</td><td>CDC</td><td>NA</td><td>殺虫剤感受性</td></tr><tr><td>分析スケール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-557-409</td> 最大<td>0.1 mgの精度</td></tr><tr><td>吸引器</td><td>アマゾン</td><td>6.49986E+11</td><td>蚊収集装置</td></tr><tr><td>ベンチペーパー</td><td>VWR</td><td>89126-794</td><td>作業スペースの下</td></tr><tr><td>に置く 綿棒</td><td>アマゾン</td><td>B092S8JVQN</td><td>昆虫の選別に使用</td></tr><tr><td>脱脂綿ボール</td><td>アマゾン</td><td>B0769MKZWT</td><td>ショ糖溶液</td></tr><tr>に使用<td>ディスペンサー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>1482225</td><td>リピーター ピペッター</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster (Canton-S株)</td><td>ウィスコンシン大学マディソン</td><td>校 NA</td><td>殺虫剤の影響を受けやすい</td></tr><tr><td>細い先端のペイントブラシ</td><td>アマゾン</td><td>B07KT2X1BK</td><td>昆虫の選別に使用</td></tr><tr><td>ショウジョウバエストックボトル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>AS355</td><td>飼育と選別に使用ショウジョウバエ</td></tr><tr><td>ハンドヘルド CO2ディスペンサー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC1710679</td><td>昆虫を倒すために使用</td></tr> 保持<tr><td>カップ</td><td>アマゾン</td><td>B08DXG7V1S</td><td>透明なプラスチック</td></tr><tr><td>アイスパック</td><td>アマゾン</td><td>B08QDWMMW5</td><td>ショウジョウバエを倒すために使用</td></tr><tr><td>アイストレイ</td><td>アマゾン</td><td>9301085269</td><td>昆虫を倒すために使用</td></tr><tr><td>昆虫鉗子</td><td>アマゾン</td><td>B07B4767WR</td><td>昆虫鉗子</td></tr><tr><td>殺虫剤</td><td>Sigma-Aldrich Inc</td><td>45423-250MG</td><td>デルタメトリン</td></tr><tr><td>ラベリングステッカー</td><td>アマゾン</td><td>B07Q4X9GWX</td><td>3/4インチ カラードットステッカー</td></tr><tr><td>ラベリングテープ</td><td>アマゾン</td><td>B00X6A1GYK</td><td>ホワイトテープ</td></tr><tr><td>ネット</td><td>アマゾン</td><td>B07F2PHHWV</td><td>保持カップや昆虫を覆うために使用ハンドリングテント</td></tr><tr><td>シャーレ</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712H371</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>PVC Pipe</td><td>Lowe's</td><td>23971</td>昆虫<td>取り扱いテント材料</td></tr><tr><td>輪ゴム</td><td>アマゾン</td><td>B00006IBRU</td><td>カップにメッシュ/ネットを固定するための使用ス</td></tr><tr><td>クロース</td><td>アマゾン</td><td>B01J78INO0</td><td>グラニューレーテッド白砂糖</td></tr><tr><td>計量紙</td><td>VWR</td><td>12578-165</td><td>4 "x 4"</td></tr></tbody></table>

蚊やショウジョウバエに対する殺虫剤毒性を定量するための局所適用バイオアッセイ

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

公衆衛生および農業のための殺虫剤の継続的な使用は、広範な殺虫剤耐性および防除方法の妨げをもたらしている。蚊の個体群の殺虫剤耐性サーベイランスは、通常、疾病管理予防センター(CDC)のボトルバイオアッセイまたは世界保健機関(WHO)のチューブ検査を通じて行われます。しかしながら、これらの方法は、昆虫との可変殺虫剤接触、試験された比較的少数の生物、集団間の質量の広範な変動、および絶えず変化する環境条件のために、死亡率データに高度の変動をもたらし、変動する結果をもたらす可能性がある。この論文は、蚊とショウジョウバエの両方に対するハイスループット表現型バイオアッセイとして適応された局所適用バイオアッセイを提示し、殺虫剤濃度の範囲に沿って多数の昆虫を試験する。
このアッセイは、1)すべての生物との一貫した処理および殺虫剤接触を保証し、2)株と性別間の平均質量の違いを説明する非常に特異的な用量反応曲線を生成し(これは野外採取生物にとって特に重要である)、および3)統計的に厳密な中央値致死量(LD50)は、耐性比の比較に必要であり、幼虫駆除剤耐性サーベイランスにも使用される診断用量死亡率からの代替サーベイランスアプローチである。このアッセイは、蚊の集団を正確に表現型決定するための補完的なツールとなり、ショウジョウバエを使用して例示されるように、他の昆虫との使用に容易に適応可能である。我々は、このアッセイが、複数の昆虫種における遺伝子型と表現型殺虫剤耐性との間のギャップを埋めるのに役立つと主張する。

これらの代表的な結果は、 Ae. aegypti、Rockefeller(ROCK)、および既知のノックダウン耐性変異F1534CおよびV1016I(IICC遺伝子型)を有するフロリダからの単離された野外株の2つの異なる株を特徴とする。さらに、 ショウジョウバエメラノガスター (カントン:S株)が紹介されています。
図2および図3は、上記のプロトコールに従って試験された株および性別による各生物の用量応答を例示する。各系統内の雄蚊と雌蚊の線量反応曲線(ROCKではt=1.70、p = 0.098、IICCではt=0.64、p = 0.527)の間に差は認められなかったため、各蚊株内の男女のデータを共有した。ROCKおよびIICCの質量相対化LD50は、それぞれ0.008ng/mg(95%CI:0-0.104)および0.336ng/mg(95%CI:0.235-0.438)である。これらの値の95%CIは重複しておらず、株の用量応答が有意に異なることを示している。IICC株のRR(ROCK株に対する)は41.7であり、WHOによれば、これは高耐性であると考えられている5。広東-Sショウジョウバエの場合、質量相対化LD50は0.213ng/mg(95%CI:0-0.490)である。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig02.jpg"> 図2:局所適用バイオアッセイを用いた蚊の代表的なデータ。デルタメトリンおよび蚊を用いた上記のプロトコールに続く局所適用バイオアッセイからの代表的な用量反応データ:(A)雌のAe. aegypti ROCK(n=880)およびIICC(n=550)株、(B)雄のAe. aegypti ROCK(n=880)およびIICC(n=569)株。デルタメトリン試験濃度は0.00075ng/μL~9.68705ng/μLの範囲であり、平均蚊の質量(mg)あたりに適用されるデルタメトリンの用量(ng)はx軸に反映される。死亡率は、Y 軸上の比率として表示されます。各データ ポイント クラスターを通る黒い線は、ひずみと性別固有の線形回帰を表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig03.jpg"> 図3:局所適用バイオアッセイを用いたショウジョウバエの代表的なデータ。 デルタメトリンおよびショウジョウバエを用いた上記のプロトコールに続く局所適用バイオアッセイからの代表的な用量反応データ: D. melanogaster Canton-S株(n=1014)。デルタメトリン試験濃度は0.00499〜5.02876ng / μLの範囲であり、平均ショウジョウバエ質量(mg)あたりに適用されるデルタメトリンの用量(ng)はx軸に反映される。死亡率は、Y 軸上の比率として表示されます。黒い線は線形回帰を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図S1:ベンチトップ型昆虫取扱テント。 ベンチトップ昆虫処理テントは、局所適用アッセイ中に逃げる蚊やハエの捕獲を容易にするために使用されます。構造は A で閉じ、 Bで開く。この構造は、PVCパイプと細かいメッシュの生地で建てられました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure1.Final.V1.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図S2:シリンジおよびリピータアプリケータユニット。 昆虫の投与に使用されるシリンジおよびリピーターアプリケーターユニット。主要部品は、1)針、2)シリンジバレル、3)プランジャー、4)リピーター、5)リピーターボタンを含む。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure2.Final.V1.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:ランダム化スクリプト: 各実験のすべてのカップに対して偏りのないラベルを作成するランダム化スクリプト。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File1_Randomization.Script.Final.V1.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル2:死亡率スコアシート: 死亡率評価を支援するための死亡率スコアシート。シートはまた、殺虫剤施用の開始時刻および終了時刻などのプロトコルで参照されるように、記録する他のすべての重要な情報を記録する場所を含む。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File2_Mortality.Score.Sheet.Final.V1%20(1).docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル 3: 死亡率データの例:図 2 の作成に使用したデータ・ファイルの例。列見出しの説明は次のとおりです: "id" = 各データ ポイントの識別コード。「種」=種名(例えば、ヒトスジシマカ)。「殺虫剤」=局所的に適用される殺虫剤の名前(例えば、デルタメトリン);「株」=蚊の株の名前(例えば、ROCK);"date" = 開始日局所アプリケーション;「性別」=蚊の性別。「年齢」=蚊の年齢(若い= 3〜5日齢;年齢= 4週齢);"total.mosq" = バッチで計量された蚊の総数。「重量」=バッチ内のすべての蚊の重量(mg)。「濃度」=殺虫剤の濃度(μg/mL);「シリンジ」=シリンジの液滴容量(mL)。「用量」=各蚊に施用された殺虫剤有効成分の量(ng);「合計」=各カップ内の蚊の数。「死んだ」=各カップ内の死んだ蚊の数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File3_Example.Data.Final.V1%20(1).txt" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル4:R分析コード: Probit 分析を完了するために使用できる R コードの例 (プロトコルの手順 8 で説明)。代表的な結果 (補足サンプル データ ファイルからアクセス可能) は、この R コードで使用できます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File4.Final.V3%20(1).R" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

我々は、蚊およびショウジョウバエにおける殺虫剤感受性を測定するための局所適用バイオアッセイの方法論および重要性を説明する。提示されたアッセイはハイスループットであり、昆虫の質量を利用し、したがって濃度の代わりに質量相対化された致死量の計算を可能にし、他の同様の方法よりも変動性が低い可能性が高い。

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

表面接触ではなく昆虫に直接殺虫剤を塗布することにより、殺虫剤曝露の変動が最小限に抑えられ、これにより、蚊の個体群の感受性プロファイルをより正確に測定することができます。この技術の主な利点は、致死濃度ではなく殺虫剤の質量相対化致死量を計算できることであり、耐性比の比較が大幅に改善される。殺虫剤を適切に保管し、ツールを汚染しないように注意し、シリンジ部品が良好な状態であることを確認してください。これは、一貫した結果を得るのに役立ちます。まず、必要な殺虫剤溶液を冷凍庫から取り出します。直ちに溶液を渦巻きまたは5回反転させ、室温の耐光性容器に入れて殺虫剤を室温まで温めてから使用する。それぞれ0.5ミリリットルのアセトンを含む5本の微量遠心管をセットする。シリンジバレルを第1のチューブからのアセトンで完全に満たします。その後、プランジャーを素早く押し下げてアセトンを廃容器に排出し、さらに4回繰り返して、同じアセトンアリコートから合計5回のアセトン洗浄を完了します。次に、シリンジバレルを空気で完全に満たし、空気および潜在的なアセトン残党を廃容器に排出する。さらに2回繰り返して、空気で3回洗い流します。シリンジプランジャーと針の上部の間にバレル内にエアポケットを作り、プランジャーをバレル内に約5ミリメートル引き上げます。プラスチック製の保持カップに、盲目的死亡率評価のためのランダムなIDのラベルを付けます。吸入からの吸引によって駆動される吸引器を使用して、3〜5日齢の成虫の蚊の所望の数を吸引する。アスピレーターの先端をチューブに入れ、先端に綿を巻き付けます。静かに息を吐き出し、アスピレーターをタップして蚊を円錐形のチューブに移します。アスピレーターの先端を取り外したら、綿を使用してチューブを差し込み、蓋でキャップします。チューブ内の蚊を摂氏4度で最低10分間置くか、氷トレイの氷の下に埋めて、簡単にノックダウンします。ノックダウンされた蚊を昆虫処理テントに移す。氷の上に置かれたプラスチック製のトレイに蚊を慎重に傾け、一度に約50匹の蚊を注ぎ、それぞれがその下の冷たいトレイに触れ、ノックダウンされたままになるようにします。鉗子で脚や羽で優しく拾い上げて性別で蚊を分類し、その後、各性別を別々の保持カップに入れ、所望の数に達したら停止する。選別中は、怪我をしたり、特大小の蚊を取り除きます。蚊のカップの重さを記録するには、ペトリ皿を蓋にした空のカップを体重計の上に置き、体重計を風袋に入れます。蚊を容器に注ぎ、蓋を上に置きます。容器を体重計に置き、最終的な体重を蚊の数とともに記録します。標本のカップを直ちに氷の上に戻し、試料のすべてのカップが計量されるまで固定したままにします。準備した蚊を氷の上に置き、ランダムなIDでラベル付けされた5〜10個の別々のカップに分けます。ピンセットとハンドヘルドカウンターを使用して、カップあたり20〜25匹の蚊を達成します。フルーツハエを分類するには、二酸化炭素を使用してハエを7秒間麻酔します。ベンチペーパーで包まれたアイスパックにハエを注ぎます。先端の細かい絵筆を使用して、男性と女性を分離して数えます。ペイントブラシを使用して、選択したハエを優しく拾い上げ、清潔で空のストックボトルに入れます。雄と雌のフルーツハエを同じ数選択した後、ストックボトルに株名とフルーツフライの合計でラベルを付けます。フルーツハエのボトルを二酸化炭素を使って7秒間麻酔します。フルーツハエを計量紙に注ぎ、紙を漏斗として使用して、ランダムなIDでラベル付けされたタールバイアルにハエを導入します。スコアシートに試料の重量と数の合計を記録します。すぐにフルーツハエのバイアルを氷のトレイに入れ、蓋を上にしてハエが逃げるのを防ぎます。シリンジに適切な殺虫剤濃度をロードし、最も濃縮度の低い用量から始めて、生物の各グループで最も濃縮された用量に向かって作業する。氷の上のトレイの上に置かれた計量紙の上に標本を傾けます。清潔な殺虫剤を含まないペイントブラシまたは綿棒を使用して、互いに近接している標本を分離して、投薬のために各標本に簡単にアクセスできるようにします。注射器を使用して、殺虫剤溶液の1滴を蚊の場合は腹側胸部および腹部領域に、ショウジョウバエの場合は背部に塗布する。直ちに試料をラベルの付いたプラスチックカップに戻します。カップをネットと輪ゴムで覆います。このプロセスで検体が殺されたり、損傷したり、逃げたりした場合は、カップの更新された標本数に注意してください。完成したカップを保持トレイに入れます。最初のカップについては、投薬が完了した時刻を記録します。すべての検体が適切な殺虫剤濃度で投与されるまで、各カップの投与を繰り返し、すべての検体が投与された終了時間を記録します。濡れた綿球を介して各カップに10%スクロース溶液を提供し、所望の温度および湿度で蚊およびショウジョウバエを貯蔵する。殺虫剤曝露開始後24時間で検体死亡率を記録する。WHOが説明しているように、蚊が飛んで直立し、直立して保持できる場合は生きていると分類し、動けない、または運動失調であれば死んでいる。ショウジョウバエについても同じ死亡率評価に従ってください。バイオアッセイを実施した後、オスおよびメスのヒトスジシマカについてロックフェラーおよびIICC遺伝子型である2つの株を特徴とする用量反応データが得られた。ロックフェラーとIICCの質量相対化致死量の中央値は、それぞれ1ミリグラムあたり0.008ナノグラムと0.336ナノグラムであった。結果は、各系統内の雌蚊と雄蚊の用量反応曲線の間に差異を示さなかった。したがって、両性からのデータを結合して、致死量値の中央値を計算した。これら2つの株の致死量の中央値に対する95%信頼区間は重複していなかったので、これらの値は有意に異なると考えられた。さらに、耐性比を計算すると、IICC株は感受性ロックフェラー株よりも40倍以上耐性であった。ショウジョウバエ、ショウジョウバエのメラノガスター、Canton-S株の用量反応データも得られ、質量相対化致死量の中央値は1ミリグラムあたり0.213ナノグラムであることが判明した。一貫性は、特に殺虫剤を貯蔵および適用し、死亡率を評価する際に重要である。また、検体の取り扱いには、殺虫剤によって誘発されない危害や死を避けるように注意してください。この方法により、蚊の集団の技術的抵抗と、環境条件の耐衝撃性、または技術的抵抗が実用的な抵抗をどのように予測するかを正確に判断できるようになりました。

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