Name: 初代ヒト鼻上皮細胞:精密医療の文脈におけるバイオバンキング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 学ぶ初代ヒト鼻上皮細胞の気液界面培養とバイオバンキング法。CFTR機能評価と嚢胞性線維症の個別化医療への応用を含む。

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私たちは、研究に参加してくれたすべての患者とその家族に暖かく感謝します。この研究は、フランス・ヴァンクレ・ラ・ムコビシドース協会からの助成金によって支援されました。フランス協会ABCF 2およびVertex Pharmaceuticals Innovation Awards。

すべての実験は、ヘルシンキ宣言と人間の研究倫理に関するHuriet-Serusclat法によって記述されたガイドラインと規制に従って行われました。
1. フラスコおよび異種培地の調製
<ol><li>表1に記載したように増幅、空気 - 液体、および凍結媒体を調製する。</li>
	<li>コラーゲン50mgを0.2%氷酢酸100mLに溶解してヒトコラーゲンIVの原液を調製する。マグネチックスターラーで少なくとも1時間混合し、溶液をフィルター滅菌する。光から保護されたガラス瓶に4°Cで最大6ヶ月間保管してください。</li>
	<li>原液を二重蒸留水で1:5に希釈してコラーゲンIVの作用溶液を調製する。4°Cで最大6ヶ月間保管してください。</li>
	<li>プラスチック細胞培養フラスコまたはトランスウェルフィルターをコラーゲン作業溶液でコーティングする。0.33 cm 2 トランスウェルフィルターに 100 μL、25 cm 2 フラスコに 500 μL、75cm 2 フラスコに 1 mL をフラスコの成長面全体に均等に分配します。 注:これは、フラスコを左右に静かに傾けることによって達成することができる。あるいは、フラスコのコーティングを容易にするために、増加した体積を使用することができ、そして、表面全体が均等に覆われるとき、コラーゲン溶液は、指示された体積のみを残すように吸引される。吸引されたコラーゲン溶液は、その後、直ちに次のフラスコをコーティングするために使用することができる(すなわち、3つの75cm2フラスコに対して、3mLのコラーゲン溶液を最初のフラスコに均等に分配し、2mLを吸引し、次いで次のフラスコに使用される、など)。</li>
	<li>細胞培養フラスコをインキュベーター内に最低2時間または一晩放置する。コラーゲンを徹底的に吸引し、フラスコをインキュベーター内またはフードの下で最低20分間または一晩乾燥させます。</li>
	<li>10mLのMg2+-およびCa2+フリーDPBSで洗浄し、インキュベーター内で乾燥させ、光から保護するためにアルミニウム箔に保存する。フラスコを室温(RT)で最大6ヶ月間保管する。</li>
</ol>2.鼻ブラッシング
注:参加者が急性感染症に罹患していない間に鼻ブラッシングが行われることを確認してください。CF患者が肺感染症を呈する場合は、患者の抗生物質を参照し、増幅培地に抗生物質を追加します。ヒト鼻上皮細胞を、前述のようにF508del/F508del患者から鼻ブラッシングによって収集した9。
<ol><li>患者に鼻を吹くように頼み、ナファゾリン溶液でキシロカイン5%に浸した綿網を使用して、両方の鼻孔の粘膜を局所麻酔する。</li>
	<li>細胞診ブラシを使用して、両方の鼻孔の内側壁と下甲介を優しくブラッシングします。ブラシを市販のフラッシング培地2mLで15mLチューブに浸します。細胞を切り離すために静かに振る。2番目の鼻孔でブラッシングを繰り返します。</li>
	<li>ペニシリン(100 U/mL)、ストレプトマイシン(100 μg/mL)、タゾシリン(10 μg/mL)、アンホテリシンB(2.5 μg/mL)、コリマイシン(16 μg/mL)の抗生物質をフラッシング培地に加えます。 注:鼻ブラッシングは、RTで拡張と培養のために専用ラボに出荷することができ、ブラッシング後72時間まで播種することができます。</li>
</ol>3. HNEの分離
注:HNEを細胞診ブラシから単離し、Mg2+-およびCa2+フリーDPBSで洗浄し、0.25%トリプシンで解離させ、前述のように25cm2プラスチックフラスコ上に播種した10。
<ol><li>ブラシを1000 μLのピペットコーンに繰り返し通し、2 mLのMg 2+-およびCa2+フリーDPBSですすいで、細胞診ブラシから細胞を剥離します。500 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てる。</li>
	<li>ペレットを0.25%トリプシンに8〜12分間再懸濁し、細胞を解離させる。5 mLの増幅培地を加えて酵素反応を停止した。</li>
	<li>500 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てる。ペレットを8mLの増幅培地に再懸濁し、25cm2のコラーゲンコーティングフラスコにシードする。37°Cおよび5%CO2で生育する。これはパッセージ 0 に対応します。</li>
	<li>翌日、培地を5mLの新鮮な増幅培地と交換し、細胞の付着、形態(細胞は凝集した石畳の外観を有するべきである)、および数について毎日細胞を監視する。 注:初期播種密度は、鼻ブラッシングの質および上皮細胞の割合によって異なる。新たに単離されたHNE細胞は、通常、3〜10日以内に80%〜90%のコンフルエンシーに達する。遅い増殖速度は、サンプル中の不十分な上皮細胞を示唆するものであり、廃棄されるべきである。</li>
</ol>4. ヒト鼻上皮細胞の増幅と継代
<ol><li>コラーゲンコートフラスコ上で37°Cおよび5%CO2で増幅培地中でヒト鼻上皮細胞を80%〜90%コンフルエントになるまで増殖させ、48〜72時間ごとに培地を交換する。25 cm 2 フラスコの場合は、5 mL の増幅培地を使用し、75 cm2 フラスコの場合は 10 mL を使用します。</li>
	<li>細胞が80%~90%のコンフルエントに達したら、10mLのMg2+-およびCa2+フリーDPBSで細胞を洗浄し、吸引し、廃棄する。</li>
	<li>25 cm 2フラスコに1 mLの0.25 %トリプシンを加え(または75 cm 2フラスコに2 mLのトリプシンを加え)、インキュベーター(37°C、5% CO2)に8〜12分間戻します。</li>
	<li>フラスコを手のひらでしっかりと叩いて、細胞が剥離するのを助けます。</li>
	<li>10 mLの増幅培地を加え、酵素反応を停止した。フラスコを激しくすすぎ、10mLピペットを使用してフラスコ表面上に増幅培地を引き上げて排出し、細胞をすすぎ、剥離する。</li>
	<li>500 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てる。</li>
	<li>ペレットを5〜10mLの増幅培地に再懸濁する。</li>
	<li>血球計数器を用いて細胞を計数する。 メモ: この時点で細胞を凍結できます (手順 5.1 ~ 5.3 を参照)。さらなる増幅が必要な場合は、コラーゲンコーティングフラスコに再シードします(25cm2フラスコを3つの75cm2フラスコに拡張することができますが、それ以上の希釈は推奨されません)。</li>
</ol>5. 初代鼻上皮細胞の凍結保存
注:バイオバンキングの前に継代1までHNE細胞を増殖させ、解凍時に細胞増殖を促進するのに十分な細胞を得る。しかしながら、バイオバンキングは、最初の通路0または通路2で可能である。以下の凍結保存ステップは、すべての通路に適合しています。
<ol><li>細胞計数後、500 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てる</li>
	<li>ペレットを濃縮凍結培地に再懸濁し(表1)、mLあたりおよびクライオバイアルあたり3 x 106〜5 x 106個の細胞を得た。</li>
	<li>-80°Cの適切な凍結凍結容器中で毎分〜1°Cで温度を下げることによって細胞をゆっくりと凍結する。 翌日、保存した試料を長期保存のために窒素保存容器に移す(本研究は17ヶ月保存に制限されている)。</li>
</ol>6. 凍結増幅HNE細胞の融解
<ol><li>ウォーターバスを37°Cに温めます。 表1 に記載のように増幅培地を調製し、培地を37°Cに加温した。</li>
	<li>窒素貯蔵タンクからクライオバイアルを取り出し、バイアル全体を水に浸さないように注意しながら、それらを水浴に素早く置きます。小さな凍った液滴だけが残っているときに、水浴からクライオバイアルを取り除きます。バイアルを70%のアルコールで拭き取り、乾拭き取り、フードの下に置きます。</li>
	<li>1 mL ピペットを用いて、解凍した細胞を空の 15 mL チューブに移す。</li>
	<li>滴下して、1mLの温かい増幅培地を加える。1分後、さらに1mLの増幅培地を加え、さらに1分間待ちます。</li>
	<li>10mLの増幅培地を加え、500 x gで2分間遠心分離する。</li>
	<li>上清を吸引して捨てる。細胞ペレットを、少なくとも1 x106 細胞/mLの細胞密度を達成するために必要な量の増幅培地に再懸濁する。</li>
	<li>増幅培地を入れたコラーゲンコートフラスコに細胞を播種する。<ol>
<li>クライオビアルに4 x106個 以上の細胞が含まれている場合は、75 cm2 フラスコに10 mLの増幅培地でシードします。</li>
		<li>クライオビアルに含まれる細胞が4 x106 個未満の場合は、5 mLの増幅培地中で、25 cm 2 フラスコに細胞をシードします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>37°C、5%CO2 でインキュベートし、次の2〜3日間にわたる細胞増殖を目視で観察した。</li>
	<li>次に、セクション4で詳述されているように細胞増幅を行う。 注:ステップ4.7で回収された細胞が少ない場合。(すなわち、膨張前の通路0で凍結する場合)、ステップ6.5。および 6.6.省略することができ、細胞は遠心分離なしで25cm2 コラーゲンコーティングフラスコに直接播種することができる。その後、ジメチルスルホキシド(DMSO)を除去するために翌日に培地を交換しなければならない。</li>
</ol>7. 気液界面におけるヒト鼻上皮細胞の分化
注:HNEは、前述のように気液界面で分化した10。
<ol><li>0.33cm2 のコラーゲンコーティング多孔質フィルターに330,000細胞/フィルターの密度で細胞を播種し、頂端側に300 μLの増幅培地、側底側に900 μLの気液培地を補充する。</li>
	<li>3日後、頂端培地を吸引し、気液培地中で3〜4週間気液界面で細胞を培養し、分化上皮を樹立した。48〜72時間ごとに基礎培地を交換してください。</li>
</ol>8. CFTR変調器
<ol><li>CFTRモジュレーターを含む空気 - 液体培地を調製する。VX-445、VX-661、およびVX-809を終濃度3μMで使用し、VX-770を100nMで使用してください。コレクタABBV-2222を終濃度1 μMで、ポテンショネータABBV-974を10 μMで使用してください。100% DMSOを使用して、すべてのCFTR変調器を溶解します。</li>
	<li>補正器培地と同量の100%DMSOを含む気液培地を調製する。</li>
	<li>気液界面で増殖した分極HNE細胞の側底側に薬物またはDMSOを含む培地を添加し、37°Cで5%CO2中で24 時間インキュベートする。</li>
	<li>24時間後、培地を吸引・廃棄し、ステップ8.1~8.2のように調製した新鮮な培地と交換し、さらに37°Cで5%CO2中で24 時間インキュベートする。</li>
</ol>9. 室内調査
<ol><li>前述のように、電圧クランプ条件下で短絡電流測定値(Isc)を測定します 9. 注:培養物の上皮経上皮電気抵抗(TEER)を箸電圧計で測定し、少なくとも200 Ω・cm2 に達した培養物のみを以下の実験で検討した。分極HNEセルのフィルタをUssingチャンバに取り付け、短絡電流測定(Isc)を電圧クランプ条件下で測定しました。</li>
</ol>10. 免疫細胞化学
<ol><li>前述のように免疫検出を行う9. 注:CFTR免疫検出は、抗CFTR C末端(24-1)モノクローナル抗体を用いて1/100希釈で一晩行った。ゾナ-オクルーデン-1(ZO-1)(1/500希釈)、α-チューブリン(1/300希釈)、Muc 5AC(1/250希釈)およびサイトケラチン8(1/250希釈)染色を、追加のフィルターで行った。PBS-Triton-X100で0.1%洗浄した後、Alexa 488または594に結合させたヤギ二次抗体を10%ヤギ血清(1/1000希釈)に30分間添加した。最終洗浄後、フィルターを支持体から切断し、DAPIを含むベクタシールドマウント培地を装着した。共焦点顕微鏡(63x/1.4オイル微分干渉コントラストλブルーPL APO対物レンズ)を使用して画像をキャプチャし、ImageJソフトウェアで分析しました。</li>
</ol>11. 統計分析
<ol><li>適切なソフトウェアを使用して統計分析を実行します。 注:統計分析は、S.A.Sソフトウェアを使用して実行しました。患者ごとおよび病態ごとに複数のHNEフィルターが得られたため、定量パラメータは患者ごとの中央値(SEM±)として表されました。比較(平均±SD)は、ウィルコクソン一致ペア符号付き順位検定または非対応t検定を用いて行った。</li>
</ol>

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<li>Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rock+Inhibitor+Y-27632+enables+feeder-free%2C+unlimited+expansion+of+Sus+scrofa+domesticus+swine+airway+stem+cells+to+facilitate+respiratory+research%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research.</a> Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).</li>
<li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+multiple+class+II+CFTR+mutations+by+elexacaftor%2Btezacaftor%2Bivacaftor+mediated+in+part+by+the+dual+activities+of+elexacaftor+as+both+corrector+and+potentiator%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator.</a> The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774(2021).</li>
<li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum%2Ffeeder-free+single+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).</li>
<li>Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+primary+cultures+of+human+bronchial+epithelial+cells+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+for+the+pre-clinical+testing+of+CFTR+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators.</a> Methods in Molecular Biology. 741, Clifton, N.J. 39-54 (2011).</li>
<li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+pre-clinical+modulators+developed+for+F508del-CFTR+have+the+potential+to+be+effective+for+ORKAMBI+resistant+processing+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).</li>
</ol>

著者らは、この出版物または科学ビデオ制作に関連する競合する金銭的利益を報告していない。

個別化医療の文脈でCFTR活性を測定するためのヒト気管支上皮(HBE)細胞の代理として患者由来の鼻上皮細胞を使用することが、HNEが培養物9、11における細胞の特性を再現することとして提案されている。HBE細胞培養に対するHNEの強力な利点は、それらが簡単かつ非侵襲的にサンプリングされることです。HNE細胞培養における短絡電流測定は、上皮を横切るCFTR依存性Cl− 輸送の評価を可能にし、これは、様々な遺伝子型を有する患者の鼻電位差によって評価されるCFTR インビボ 活性と有意に相関することが示された9。VX−809処置時のHNE細胞におけるCFTR活性のレスキューはまた、ルマカフトル−イバカフトル処置F508delホモ接合型患者における臨床転帰FEV1 の改善にも有意に相関した12。
重要なことに、この研究...

嚢胞性線維症(CF)は、上皮1,2の頂端表面に位置するアニオンチャネルであるCFTRタンパク質の不在または機能不全をもたらす嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)遺伝子の変異に起因する常染色体劣性障害である。CFTR療法における最近の進歩は、疾患の予後を改善し、CFTR矯正剤とCFTR増強剤を組み合わせた最後の承認薬は、最も頻繁な変異p.Phe508del変異(F508del)を有するCF患者の肺機能および生活の質の大幅な改善をもたらした3,4。この有望な治療の進歩にもかかわらず、CF患者の約10%は、これらのCFTRモジュレーターによって救出できない変異を有するため、不適格である。これらの患者にとって、特定の変異について最も効率的な組み合わせを見つけるために、他の薬物または薬物の組み合わせをテストする必要があり、個別化療法の重要性を強調しています。
ヒト鼻上皮(HNE)細胞は、簡単で非侵襲的な鼻ブラッシングによって収集が容易であり、CFTR機能の指標としてのサイクリックAMP媒介塩化物(Cl−)輸送の定量を可能にする。HNE細胞はヒト気道の正確なモデルをもたらすが、その寿命は培養において限られている。培養技術の最適化のおかげで、患者由来の初代HNE細胞をRho関連キナーゼ阻害剤(ROCKi)で条件付きで再プログラムし、増幅し、微多孔性フィルター5,6上の気液界面(ALI)条件下で擬似層状上皮に分化させることができる5,6。HNE培養のための多数の培養プロトコールが存在し(市販、無血清、「自家製」、「フィーダー細胞との共培養など)、培地および培養条件の選択は、増殖、細胞集団の分化および上皮機能に影響を与えることが記載されている7、8。ここでのプロトコルは、CFTR機能アッセイのためにALIで分化される多数のHNE細胞を首尾よく得ることを可能にする、単純化されたフィーダーフリーのROCKi増幅法を提示する。
我々は、分化したHNE細胞において、CFTRモジュレーターによる48時間治療がCFTR依存性Cl- 電流の電気生理学的補正を誘導するのに十分であり、 インビトロで 観察される補正が患者の臨床的改善と相関し得ることを実証した9。したがって、HNE細胞は、基礎的なCF研究だけでなく、患者固有のCFTRモジュレーター試験を伴う前臨床試験にも適切なモデルである。個別化治療のこの文脈において、プロトコールの目標は、我々の条件で増殖したCF患者由来の凍結保存HNE細胞がCFTR補正研究のための適切なモデルであり、新鮮および凍結融解細胞からのCFTR依存性Cl- 輸送を比較する場合、同様の結果が期待できることを検証することであった。この研究はまた、二重療法および三重療法を使用する場合の異なるCFTRモジュレーターの有効性を評価した。

<table><tbody><tr><td>ABBV-2222</td><td>Selleckchem</td><td>S8535</td><td></td></tr><tr><td>ABBV-974</td><td>Selleckchem</td><td>S8698</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 ヤギ二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594 ヤギ二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシンB</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 15290026</td><td></td></tr><tr><td>抗α-チューブリン抗体</td><td>アブカム</td><td>ab80779</td><td></td></tr><tr><td>抗CFTRモノクローナル抗体 (24-1)</td><td>R&Dシステム</td><td>MAB25031</td><td></td></tr><tr><td>抗サイトケラチン8抗体</td><td>Progen</td><td>61038</td><td></td></tr><tr><td>抗Muc5AC抗体</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-20118</td><td></td></tr><tr><td>抗ZO-1抗体</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-10804</td><td></td></tr><tr><td>シプロフロキサシン</td><td></td>(ネ<td>ッカー病院薬局</td><td></td>提供</tr>) <tr><td>コリマイシン</td><td>サノフィ</td>(<td>ネッカー提供)病院 薬局</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン IV型</td><td>Sigma-Aldrich メルク</td><td>C-7521</td><td></td></tr><tr><td>細胞診ブラシ</td><td>研究室 GYNEAS</td><td>02.104</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich メルク</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>エピネフリン</td><td>Sigma-アルドリッチ メルク</td><td>E4375</td><td></td></tr><tr><td>F12-栄養混合物</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 11765054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 10270106</td><td></td></tr><tr><td>Ferticult</td><td>Fertipro NV</td><td>FLUSH020</td><td></td></tr><tr><td>フラスコ 25</td><td>Thermo Scientific</td><td>156.367</td><td></td></tr><tr><td>フラスコ 75</td><td>Thermo Scientific</td><td>156.499</td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>VWR</td><td>20104.298</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich メルク</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>Sigma-Aldrich メルク</td><td>SLCJ0893</td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>Sigma-Aldrich メルク</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>Mg2+ および Ca2+フリー DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ライフ</td><td>テクノロジーズ 15140130</td><td></td></tr><tr><td>タゾシリン</td><td>マイラン</td><td>ネッカー病院提供 薬局</td><td></td></tr><tr><td>トランズウェルフィルター</td><td>シグマ・アルドリッチ メルク</td><td>CLS3470-48EA</td><td></td></tr><tr><td>トリトン-X100</td><td>シグマ・アルドリッチ メルク</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン 0.25%</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>ベクタシールド 封入剤 DAPI</td><td>付き ベクターラボラトリーズ</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>VX-445</td><td>Selleckchem</td><td>S8851</td><td></td></tr><tr><td>VX-661</td><td>Selleckchem</td><td>S7059</td><td></td></tr><tr><td>VX-770</td><td>Selleckchem</td><td>S1144</td><td></td></tr><tr><td>VX-809</td><td>Selleckchem</td><td>S1565</td><td></td></tr><tr><td>キシロカインナファゾリン 5%</td><td>アスペンフランス</td><td>ネッカー病院薬局</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleckchem</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

初代ヒト鼻上皮細胞:精密医療の文脈におけるバイオバンキング

Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

ヒト鼻上皮(HNE)細胞は、簡単で非侵襲的な鼻ブラッシングによって収集が容易である。患者由来の初代HNE細胞を増幅し、気液界面条件下で擬似層状上皮に分化させて、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)機能の指標として環状AMP媒介塩化物(Cl-)輸送を定量化することができる。鼻ブラッシングの質や凍結保存時の細胞密度などの重要なステップを効率的に行えば、HNE細胞をバイオバンク化することに成功することができます。さらに、短絡電流研究は、凍結融解がHNE細胞の電気生理学的特性およびCFTR変調器に対する応答を有意に変化させないことを実証している。本試験で用いた培養条件では、クライオバイアルあたり2 x106 細胞未満が凍結されると、故障率が非常に高い。クライオバイアルあたり少なくとも3 x106 セルを凍結することをお勧めします。我々は、CFTR補正器とCFTR増強剤を組み合わせた二重療法が、F508delホモ接合型HNE細胞におけるCFTR活性に対して同等の補正有効性を有することを示す。トリプルセラピーVX-445 + VX-661 + VX-770は、二重療法VX-809 + VX-770と比較してCFTR活性の補正を有意に増加させた。HNE細胞におけるCFTR活性の測定は、CFTRモジュレーター療法を導くのに有用な有望な前臨床バイオマーカーである。

気液界面で培養された新鮮なHNE細胞は、免疫染色によって評価されるように、分極および分化した呼吸器上皮の典型的な特徴を示す(図1)。HNE細胞は、繊毛化(陽性α-チューブリン染色)および非繊毛粘液産生杯細胞(陽性Muc5Ac免疫染色)からなる擬似重層化呼吸器上皮の in vivo 状況を模倣する上皮細胞の不均一な層(陽性ケラチン8免疫染色)に再分化する。全体的な上皮はタイトジャンクションを提示する(ZO-1、帯-オクルデン-1染色によって評価される)。強力な頂端CFTR染色は野生型(WT)HNE細胞で見られ、F508del/F508del HNEでは頂端表面と細胞質の両方でCFTR染色の減少が観察されます。
試料は、拡大に成功しただけでなく、気液界面で3週間後に擬似層状上皮に分化することに成功し、200 Ω・cm2を超えるTEERを提示し、短絡電流測定が可能になったため、肯定的な結果が得られたと考えました。短絡電流測定によるCFTR関連のCl- 分泌アッセイを行...

ここでは、空気-液体界面での初代ヒト鼻上皮(HNE)細胞の単離、増幅、分化、および増幅HNEの凍結と融解に成功することを可能にするバイオバンキングプロトコルについて説明します。このプロトコルは、分化したHNE細胞の電気生理学的特性と、異なるモジュレーター処理時のCFTR関連の塩化物分泌補正を分析します。

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...

このプロトコルは、初代鼻上皮細胞を増幅、分化、および凍結保存するための重要なステップを強調しています。我々の培養条件では、初代鼻上皮細胞が肺上皮を模倣する。これにより、新鮮な細胞またはバイオバンク細胞からの患者由来の培養および個別化医療研究が可能になります。患者由来の鼻上皮培養物は、CFTR活性を評価し、新しい治療法に対する患者の個々の応答を評価することによって嚢胞性線維症治療を支援するために使用することができる。手順を実演するのは、私の研究室のエンジニアであるAurelie Hattonです。開始するには、鼻上皮またはHNE細胞を、10ミリリットルの増幅培地中で増殖させる。75平方センチメートルのコラーゲンコーティングフラスコで摂氏37度と二酸化炭素5%で、80〜90%のコンフルエントに達するまでインキュベートする。培地を48~72時間ごとに交換してください。その後、10ミリリットルのマグネシウムおよびカルシウムを含まないDPBSで細胞を洗浄する。生理食塩水を吸引して捨てる。2ミリリットルの0.25%トリプシンを加える前に、フラスコをインキュベーターに8〜12分間戻した。後で、細胞の剥離を助けるために手のひらでフラスコをしっかりと叩きます。10ミリリットルの増幅培地を加え、酵素反応を停止させた。10ミリリットルのピペットを用いてフラスコを激しくすすぎ、フラスコ表面上に増幅培地を引き上げて排出し、細胞をすすぎ、剥離し、細胞を15ミリリットルのチューブに集める。細胞懸濁液を500倍Gで摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を捨てる。ペレットを5〜10ミリリットルの増幅培地に再懸濁する。その後、血球計数器で細胞を数えます。細胞計数後、細胞を摂氏4度で5分間、500倍Gで遠心分離し、上清を捨てる。次いで、ペレットを濃縮凍結培地に再懸濁し、クライオバイアルに入れて1ミリリットルあたり10〜6個の細胞を3〜5回得た。マイナス80°Cの適切なクライオフリーズ容器内で、毎分約1°Cの温度を下げて細胞をゆっくりと凍結します。翌日、保存した試料を窒素保存容器に移し、長期保存する。新しく調製した増幅培地を摂氏37度に設定した水浴中で温める。窒素貯蔵タンクからクライオバイアルを取り出し、バイアル全体を水に浸さないように注意しながら、それらを水浴に素早く置きます。小さな凍った液滴だけが残っているときに、クライオバイアルを水浴から取り出します。バイアルを70%のアルコールで拭き取り、ボンネットの下に置きます。1ミリリットルのピペットを用いて、解凍した細胞を15ミリリットルのチューブに移す。次いで、1ミリリットルの温かい増幅媒体を滴下して加える。1分後、さらに1ミリリットルの増幅培地を加え、1分間待ちます。10ミリリットルの増幅培地を加え、500倍Gで摂氏4度で2分間遠心分離する。上清を吸引して捨てる。1ミリリットル当たり6個の細胞に対して10倍の細胞密度を達成するために必要な容量の増幅培地にペレットを再懸濁する。増幅培地を入れた25平方センチメートルのコラーゲンコーティングフラスコに細胞を播種した後、細胞を摂氏37度および5%二酸化炭素でインキュベートする。先に実証したように細胞増幅を行う前に、2〜3日間にわたって細胞増殖を目視で観察する。0.33平方センチメートルのコラーゲンコーティング多孔質フィルター上に、フィルターあたり10〜5番目の細胞を3.3倍の密度で細胞を播種し、頂端側に300マイクロリットルの増幅培地、側底側に900マイクロリットルの空気液体培地を補充する。3日後、頂端培地を吸引し、気液培地中で3~4週間、気液界面で細胞を培養し、分化上皮を樹立する。48〜72時間ごとに基礎培地を交換してください。気液界面で培養された新鮮なHNE細胞は、分極および分化した呼吸器上皮の典型的な特徴を示した。78個のHNE細胞サンプルにおいて、フラッシング培地中での輸送の直後および1〜7日後に播種した鼻ブラッシングにおける成功率を比較した。成功した培養物の初期平均パーセンテージは82%であり、0〜5日間に播種されたサンプルでは87%に達した。新鮮な条件下での分化に成功したサンプルの83%は、凍結保存されたサンプルでも成功しました。同様に、新鮮な条件下での鑑別に失敗したサンプルでは、71%が凍結融解条件下でも失敗しました。また、クライオバイアルあたり10~6個の細胞を2~3回の間で凍結したサンプルの50%は融解時に増殖に失敗し、6個の細胞に対して10~10個の2回以下では80%に達した。DMSO処理HNE細胞におけるフォルスコリンに応答した短絡電流変化およびCFTR阻害剤172に応答した短絡電流変化については、新鮮または凍結融解HNEの間に有意差は認められなかった。治療後、両方の細胞型は、フォルスコリンに応答した短絡電流変化の増加およびCFTR阻害剤172に応答した短絡電流変化の減少を伴う有意な補正を示した。CFTR機能二重療法の矯正応答は、DMSO処理されたHNE細胞と比較して、フォルスコリンに応答し、CFTR阻害剤172に応答して短絡電流変化がVX−809+VX−770、およびVX−661+VX−770の両方によって有意に改善されたと評価された。6人のF508delホモ接合型患者からのHNEにおける3つの異なるCFTRモジュレーター療法が比較された。CFTR補正器とポテンショネータとを組み合わせて使用する場合、頂点およびCFTR変調器の両方を、フォルスコリンに応答した短絡電流変化およびCFTR阻害剤172に応答した短絡電流変化を同程度に補正する。HNE細胞を凍結する場合、解凍時に良好な結果が得られる可能性を高めるためには、クライオバイアルあたり少なくとも300万個の細胞を有することが重要です。HNE細胞におけるCFTR活性は、嚢胞性線維症における個別化療法を評価および調整するための良好な予測モデルであることが示されている。

primary-human-nasal-epithelial-cells-biobanking-context-precision

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、ラットおよびヒトの鼻腔から嗅粘膜をbiopsyingための方法を説明します。これらの生検は、脳疾患の分子異常を識別したり、脳の外傷/疾患の動物モデルの細胞移植に利用することができる多能性成体幹細胞を単離するどちらにも使用できます。...

げっ歯類やヒトから鼻嗅覚幹細胞を単離する

ヒトボランティアの表面掻き取り、生検により得られた鼻上皮細胞は、組織培養インサートに展開され、転送される。コンフルエントに達したら、細胞は、繊毛および非繊毛細胞の培養物を得、空気液体界面で成長させる。差別化された鼻の上皮細胞培養物は、呼吸器粘膜を研究するための実行可能な実験モデルを提供する。...

エア·液界面での人間の鼻上皮細胞の培養

この出版物は、子供からの鼻上皮粘膜のサンプリングと培養を成功させ、これらの細胞を人工多能性幹細胞(iPSC)に再プログラミングする方法を示しています。...

子供からプライマリ鼻上皮細胞を培養し、人工多能性幹細胞に再プログラム

皮膚腫瘍は、しばしば、モース顕微鏡手術後に捨てられる。臨床支援スタッフが、臨床操作を妨害することなく、下流の実験室用途のための皮膚腫瘍（ 例えば、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、および黒色腫）試料を効果的に処理および保存することを可能にするプロトコールがここに記載される。...

クリニックベースのバイオリポジトリの設立

ここで人間の鼻粘膜上皮細胞の三次元回転楕円体文化を生成する手法について述べる。回転楕円体は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ (CFTR) ドライブに刺激される-依存イオンと液分泌、「CFTR...

個別の嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ研究のひと鼻腔上皮細胞スフェロイドの生成

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ヒト鼻上皮オルガノイドの培養とイメージング

このプロトコルでは、鼻上皮細胞の収集、拡張、器官型気道上皮細胞モデルへの分化、および生細胞イメージングとカスタムビルドスクリプトによる繊毛拍動頻度の定量化について説明します。...

繊毛拍動頻度の定量化のための初代ヒト鼻上皮細胞モデルの収集、拡大、および分化

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バイオバンキングのための切除肺組織からの気管支上皮細胞の単離と高分化気液界面培養の樹立

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初代ヒト鼻上皮細胞:精密医療の文脈におけるバイオバンキング

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