比色細胞ベースのアッセイを用いてAAVに対する中和抗体を検出するためのステップバイステップ法

AAVを中和する既存の抗体は、AAV遺伝子治療の進歩に対する障壁となる。このアッセイは、AAVに対する中和抗体を検出するためのスクリーニングツールである。主な利点は、費用対効果が高く、時間効率が高く、セットアップが簡単で、技術的なスキル、ラボ機器、試薬が最小限で済むことです。

HT1080細胞を1日目にプレーティングを開始するには、予め加温した完全DMEM培地中で細胞を1ミリリットル当たり1 x 10~5番目の細胞の濃度に希釈します。次いで、1ウェル当たり100マイクロリットルの細胞を透明な96ウェル平底プレートに播種し、1ウェル当たり4番目の細胞に1 x 10の濃度にする。プレートを摂氏37度で5%の二酸化炭素と共に一晩16〜22時間インキュベートする。

2日目に、予め加温された完全DMEMを使用して、1.5ミリリットルの微量遠心チューブで目的の血清サンプルの段階希釈を生成する。希釈血清サンプルを含む各チューブに、マイクロリットルのウイルス作業溶液あたり6つのウイルスゲノムに66マイクロリットルの7.5x10を加える。ウイルス血清希釈液をピペッティングで混合し、ウイルス血清混合物を含むチューブを摂氏37度のインキュベーターに5%二酸化炭素で30分間置き、潜在的な中和が起こるようにします。

30分後、1ウェルあたり1x10〜4番目の細胞を含む96ウェルプレート上の各ウェルに100マイクロリットルのウイルス血清混合物をピペットし、次いでプレートをホイルで包み、5%二酸化炭素と共に摂氏37度のインキュベーター内に一晩16〜24時間置く。3日目に、接着細胞を破壊することなくヒュームフード真空を使用して96ウェルプレートのウェルから培地を吸引し、各ウェルに50マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドを加える。プレートを箔で包んだ後、室温で10分間放置する。

その後、室温で200マイクロリットルのPBSで細胞を洗浄し、2回吸引する。2回目の洗浄後、200マイクロリットルの予め加温したPBSを各ウェルにピペットし、プレートをホイルで包み込み、続いて摂氏65度で90分間インキュベートして内因性アルカリホスファターゼ活性を変性させ、続いて、新たに調製した溶解BCIP/NBTを各ウェルに50マイクロリットルでインキュベートした後、ラッププレートを室温で2〜24時間インキュベートする。その後、光学顕微鏡カメラで4倍の対物レンズを使用して各ウェルの写真を撮影し、すべてのアッセイで同じ露出、ホワイトバランス、および光設定の一貫した使用を保証します。

ImageJ でイメージを分析するには、ファイルを選択して「開く」をクリックします。カラー画像の場合は、「画像」、「種類」、および「8 ビット」タブを順番に選択して、グレースケールに変換します。次に、[画像]タブに移動し、[調整としきい値]を選択して、すべての色付きの領域が色と赤になるまでしきい値を変更しますが、背景はそうではありません。

[測定値の分析と設定]をクリックし、[面積]、[面積の割合]、[しきい値に制限]、[表示ラベル]のチェックボックスをオンにしてから、特定のウェルの信号読み取り値を決定する OK.To にヒットする前に、[分析と測定]をクリックして、ポップアップウィンドウの面積のパーセント列に信号の読み取り値を表示します。この研究は、ウイルスゲノムの濃度の範囲で細胞内にAAV6-hPLAPレポーター遺伝子を添加することによって最適なウイルス投与量を確立した。15, 000の感染の多様性は、36%のプレート着色を与え、最適なウイルス投与量として選択された。

代表的な分析は、着色と感染の多様性との間の相関関係を表示する。着色とウイルス濃度との間の線形相関に影響を及ぼさなかった最も高い試験濃度が得られた。対数10希釈時のアデノアソシエイトウイルスまたはAAV6に対する抗AAV6モノクローナル抗体に対する中和活性の研究は、1ミリリットル当たり10ナノグラムの濃度でのAAV6形質導入またはTI50の50%阻害を示した。

中和抗体またはNAbアッセイにおいて、AAV中和の程度は、1/2〜1/80の範囲のTI50力価値を有するナイーブサンプル集団内で変化した。アッセイ結果は、AAV投与前のAAV阻害TI50力価値が1/4〜1/80の範囲であることを示した。AAV投与後、TI50力価は1/2000から1/32,000を超えるまで増加し、AAV投与前と投与後との間の力価値に明確な対照を示した。

ウェルの写真を撮影するときは、アッセイ全体を通して一貫して同じ顕微鏡設定を使用し、写真がウェルの中央で直接撮影されていることを確認することが重要です。