Name: フェルスター共鳴エネルギー伝達マッピング:全球構造特徴を解明する新しい方法論 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 学ぶFRETマッピング法でタンパク質のリガンド結合部位と構造変化を同定し、溶液中での動的挙動を解析する手法。生体分子システムの構造変化モニタリングに有用です。

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この研究は、米国国立衛生研究所助成金R15GM135904(IMに授与)および国立衛生研究所助成金GM110552(DBOに授与)によって支援されました。

著者らには開示するものは何もありません。

FRETマッピング方法論を用いて、我々はSecAタンパク質上のシグナル配列結合部位を同定した。重要なことに、複合体の3次元結晶構造の存在は、我々の研究を大いに促進した。このマッピング手法の強みは、既存の構造を使用してラベル付けする場所を特定できることにあります。この方法論を使用して 3-D 構造を決定することはできません。しかしながら、構造要素56の決定、既存の構造49の精緻化、結合部位位置2、32の決定、または動的運動57の解明は、すべてこの方法の可能な応用である。
SecYEG-SecA-PhoA複合体では、3つの標識部位が推定結合部位の周囲に三角形を形成している(図1)。この三角形の頂点から同じ残基までの複数の距離測定値を採用することで、GPSナビゲーション方...

タンパク質については、3次元(3次元)構造知識とともにダイナミクスを解明することで、生体分子系の構造と機能の関係の理解を深めることができます。X線結晶学や極低温電子顕微鏡などの構造的方法は、静的構造を捉え、生体分子結合やダイナミクスの側面を解明するために複数の構造の決定を必要とすることが多い1。この記事では、結合部位や結合相互作用など、静的な方法ではキャプチャしにくい可能性のあるグローバル構造要素をマッピングするためのソリューションベースの方法について説明します。この方法論の有力な候補系は、X線結晶学、NMR分光法、または他の構造法によって3次元構造が以前に決定されたものである。この場合、タンパク質一般分泌経路の中心プレーヤーであるSecA-SecYEG複合体のX線結晶構造を利用して、膜2を横切るプレタンパク質の輸送の前にフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)を用いてシグナルペプチド結合部位の位置をマッピングする。遺伝子改変による生体系の操作と3次元構造に関する我々の知識を組み合わせることで、チャネル 3への挿入直前のシグナル配列と早期成熟領域の立体構造の決定が可能となった。
FRETは、空間4,5を通る距離依存的な方法で、ある分子(ドナー)から別の分子(アクセプター)へのエネルギーの放射線のない移動を含む。この転送の効率は、ドナーの減少またはアクセプター蛍光強度の増加のいずれかによってモニターされます。エネルギー移動の効率は、次のように記述できます。
E = R 0 6/(R0 6 + R 6)
ここで、R0値は、転送が50%効率的である距離である6。この技術は、以前に分子定規として記載されており、ドナー - アクセプター色素4,7,8,9の同一性に応じて、2.5〜12nmの範囲の距離を決定するのに有効である。ドナーの蛍光強度および寿命は、アクセプターの有無にかかわらず、転写効率の決定を可能にし、その結果、距離5,8である。この技術の利用可能性、方法の感度、および使いやすさにより、FRETは、単一分子蛍光分光法および共焦点顕微鏡6などの分野でも幅広い用途を見出しました。緑色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質の出現により、細胞内動態の観察および生細胞イメージングが比較的容易になった10,11。このような多くのFRETアプリケーションについては、この仮想問題で詳しく説明します。
この研究では、構造の詳細を決定するための距離値を得るためにFRET測定を使用することに特に焦点を合わせています。これまで、FRET測定は、タンパク質12、13、14に結合したときのDNA分子の立体構造、タンパク質の内部動態、およびタンパク質結合相互作用15、16、17を決定するために効果的に使用されてきた。この方法の利点は、比較的少量の材料を含むソリューション中で柔軟で動的な構造要素を決定する能力にあります。重要なことに、この方法は、既存の構造情報と組み合わせて使用する場合に特に効果的であり、3次元構造決定の手段として使用することはできません。この方法は、作業がしばしば計算シミュレーションと組み合わされた既存の構造情報に基づいて構築されている場合、構造の最良の洞察と洗練を提供する18,19。ここでは、定常状態および時間分解FRET測定から得られた距離を使用して、SecA-SecYEG複合体の既存の結晶学的構造上の結合部位を、一般分泌経路3の主要なタンパク質上に位置が知られていなかった。
一般分泌経路は、原核生物から真核生物、古細菌まで高度に保存された系であり、細胞内の機能的位置への膜を横切ってまたは膜内へのタンパク質の輸送を媒介する。我々の研究で使用された生物である大腸菌などのグラム陰性菌の場合、タンパク質は内膜を横切ってペリプラズムに挿入または転座する。細菌のSecYチャネル複合体(トランスロコンと呼ばれる)は、他のタンパク質と協調して、新たに合成されたタンパク質を転座させ、これは、典型的にはN末端に位置するシグナル配列を介して細胞内のその正しい位置に向けられる20,21。ペリプラズムに結合したタンパク質の場合、ATPase SecAタンパク質はリボソームの出口トンネルと会合し、約100残基が翻訳された後のプレタンパク質と会合する22。SecBシャペロンタンパク質とともに、プレタンパク質を折り畳まれていない状態に維持する。SecAは、SecYEGトランスロコンに結合し、そしてATP加水分解の多くのサイクルを経て、膜を横切るタンパク質輸送を促進する23、24。
SecAは、細胞質ゾルおよび膜結合形態で存在するマルチドメインタンパク質である。細胞質ゾル中のホモ二量体タンパク質であるSecAは、プレタンパク質結合または架橋ドメイン25、2つのヌクレオチド結合ドメイン、ヘリカルウィングドメイン、ヘリカルスキャフォールドドメイン、および2つのヘリックスフィンガー(THF)26、27、28、29からなる(図1)。SecA-SecYEG複合体の以前の結晶学的研究において、THFの位置は、それがタンパク質転座に積極的に関与していることを示唆し、その後のシグナルペプチドとの架橋実験は、タンパク質転座におけるこの領域の重要性をさらに確立した30,31。FRETマッピング方法論を用いた以前の研究では、外因性シグナルペプチドがSecA2,32のこの領域に結合することが実証された。SecYEGチャネルへの挿入前のプレタンパク質のシグナル配列と初期成熟領域の立体構造と位置を完全に理解するために、初期成熟領域のシグナル配列と残基がSer-Glyリンカーを介してSecAに結合したタンパク質キメラを作成した(図1)。この生物学的に生存可能な構築物を用いて、プレタンパク質のシグナル配列および早期成熟領域が並行してTHFに結合することをさらに実証した2。続いて、FRETマッピング方法論を用いて、下記3のようにSecYEG存在下におけるシグナル配列および初期成熟領域の立体構造および位置を解明した。
SecA-SecYEG複合体33,34,35の3次元構造と結合部位の可能な位置に関する知識により、個々のFRET距離の交点が結合部位の位置を特定する場所にドナー-アクセプター標識を慎重に配置することができました。これらのFRETマッピング測定は、プレタンパク質のシグナル配列および早期成熟領域が、先端がSecEGチャネルの口に位置するヘアピンを形成することを明らかにし、ヘアピン構造がチャネル挿入前にテンプレート化されることを実証した。

<table><tbody><tr><td>490 nm LEDレーザー</td><td>堀場製作所</td><td>1684-LED</td><td></td></tr><tr><td>アレクサフロー 647 C2 マレイミド//DIBO アルキン</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A20347</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>ディフコ</td><td>DF0812</td><td></td></tr><tr><td>アレクサフロー 488 C5 マレイミド/DIBO アルキン</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A10254</td><td></td></tr><tr><td>アレクサフロー 488 DIBO アルキン</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ S10904</td><td></td></tr><tr><td>アレクサフロー647 DIBOアルキン</td><td>ライフ</td><td>テクノロジーS10906</td><td></td></tr><tr><td>アミコンウルトラ&shy;4 遠心フィルター (50kDa MWCO)</td> <td>シグマ</td><td>UFC805008</td><td></td></tr><tr><td>ドデシルマルトシド (DDM)</td> <td>アナトレース</td><td>D310<</td><td></td></tr><tr><td>em>大腸菌 アルカリホスファターゼシグナルペプチド SP22</td><td>生体分子 中西部</td><td>N/A</td><td>合成カスタムアイテム</td></tr><tr><td>拡張シグナルペプチド SP41</td><td>生体分子 中西部</td><td>N/A</td><td>合成カスタムアイテム</td></tr><tr><td>FluorEssence</td><td>堀場</td><td>バージョン 2.4</td><td>Fluoromax4 分光蛍光光度計用スペクトル取得プログラム</td></tr><tr><td>Fluoromax 4 分光蛍光度計</td><td>堀場</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GlobalsWE</td><td>Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine</td><td></td><td>時間分解崩壊のスペクトル分析プログラム</td></tr><tr><td>H&shy;4&shy;アジド&shy;ふぅふぅ;OH</td><td>BACHEM</td><td>4020250.0001</td><td></td></tr><tr><td>LB (Miller) Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9723</td><td></td></tr><tr><td>Ludox HS-40 コロイダルシリカ (H2O 中の 40 wt.% 懸濁液)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>420816</td><td>希釈は、適切な散乱溶液を作るために必要です</td></tr><tr><td>PTI Felix GX</td><td>堀場バージョン</td><td>4.1.0.4096</td><td>PTI タイムマスター機器</td></tr><tr><td>PTI タイムマスター機器</td><td>堀場</td><td>製作所 NA</td><td></td></tr><tr><td>Pymol 分子グラフィックス プログラム</td><td>Schrodinger</td><td>バージョン 2.4</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>Thermo Scientific</td><td>NESLAB RTE 10</td><td></td></tr></tbody></table>

フェルスター共鳴エネルギー伝達マッピング:全球構造特徴を解明する新しい方法論

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

Förster共鳴エネルギー移動(FRET)は、 インビトロ および細胞内の生体分子間および生体分子間の距離を首尾よく測定するために使用される確立された蛍光ベースの方法です。FRETにおいて、蛍光強度または寿命の変化によって測定されるエネルギー移動の効率は、2つの蛍光分子または標識間の距離に関する。距離からのダイナミクスと立体構造変化の決定は、この方法の生物学的システムへの応用の一例にすぎません。特定の条件下では、この方法論は、ダイナミクス、柔軟性、および結合表面への適応に関する情報を提供することにより、既存のX線結晶構造に追加し、強化することができる。我々は、結合部位または二量体サブユニットの配向の同定を通じて、構造特性を解明するためのFRETおよび関連する距離決定の使用について記述する。標識部位の賢明な選択、および多くの場合、複数の標識戦略の採用を通じて、タンパク質-DNA複合体およびSecA-SecEGタンパク質転座システムにおけるグローバルな構造特性を決定するために、これらのマッピング法を首尾よく適用しました。SecA-SecYEGシステムでは、FRETマッピング法を使用して、プレタンパク質結合部位を同定し、結合したシグナル配列領域の局所立体構造を決定しました。この研究は、適切な標識部位の同定、非天然アミノ酸残基を含む可能な標識の議論、標識手順、測定の実施方法、およびデータの解釈を含む、FRETマッピング研究を実施するためのステップを概説する。

この研究は、SecYEGチャネルへのプレタンパク質の挿入前に、SecA上のプレタンパク質結合部位の位置を決定することに焦点を当てた。結合部位をマッピングするために、プレタンパク質の異なる領域と、SecAおよびSecYEGタンパク質上の3つの異なる位置との間でFRET実験を行った(図1A−D)。得られた距離とSecA、SecYEG、およびプレタンパク質の三次元構造から、プレタンパク質結合部位の位置を予測した。これらの測定を行うために3つの別個の実体(SecA、SecYEG、およびプレタンパク質)を使用するのではなく、Gly-Serリンカー2,3の組み込み後に遺伝子改変を介してPhoAシグナル配列をSecAに結合させた。色素による容易な標識のために、PhoAプレタンパク質中の残基2、22、35、および45にCys残基またはアンバー変異を導入した(図1E</s...

この研究は、標識部位の選択、色素の選択、取得、およびデータ分析を含むFRETマッピングの方法論を詳述している。この方法論は、タンパク質系における結合部位、立体構造変化、および動的運動を決定するのに有効であり、既存の3D構造情報と組み合わせて実行される場合に最も有用である。

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) is an established fluorescence-based method used to successfully measure distances in and between ...

我々は、リガンド結合部位、サブユニット配向、リガンド結合に関連する立体構造変化、およびタンパク質の動的運動の同定および特性評価を可能にするFRETマッピング方法論を開発しました。この技術の利点は、溶液中で行うことができ、分子が自由に動き回ることができることである。この技術によって測定される距離は、生物学的システムに適しています。FRETは、多くのシステムに広く適用できます。マッピングは、あらゆる生体分子系における構造的および動的変化のモニタリングを強化し、3次元構造情報が存在する場合に特に有効である。タンパク質を精製した後、最も難しい部分は、高効率で標識し、遊離色素を除去することです。実験のために、それはできるだけ少ない自由な染料を持つのを助けます。開始するには、懲罰的結合部位の25〜75オングストローム以内、およびタンパク質の比較的静的な領域における標識部位を選択する。距離は、使用する特定のFRET色素対を決定する。互いに比較的異なるタンパク質領域内の標識部位を見つけます。したがって、サイトは三角形の頂点を記述し、懲罰的な結合部位は中央に位置しています。R0値を測定するために、所望のキュベットサイズおよび体積に応じて、全タンパク質の同じ濃度で2つのタンパク質サンプルを調製する。1つはドナー色素のみで標識されたタンパク質で、もう1つはアクセプター色素のみで標識されたタンパク質です。分光蛍光光度計を使用している場合は、蛍光光度計をオンにし、FluorEssenceソフトウェアでスペクトル取得および分析プログラムを開きます。赤いMをクリックしてコンピュータを装置に接続し、発光スペクトルを選択します。[実験の収集] メニュー項目を使用して、励起波長、発光スキャンの範囲、温度、サンプルの位置の変更など、スキャン パラメーターを入力します。原稿に記載されているようにRTCと最適化された機器設定をクリックし、色素の吸収最大に設定された励起波長を使用してピーク時の蛍光発光を監視します。ドナー標識タンパク質サンプルをサンプルホルダーに入れ、実行をクリックしてドナー色素のみで標識されたタンパク質の発光スキャンを生成し、色素吸収最大でサンプルを励起し、発光ピークをスキャンする。ピークの終わりを過ぎて 25 ~ 50 ナノメートルでスキャンを延長して、スキャンのベースラインを確立します。テキスト原稿に記載されているように、異なる濃度のサンプルに対して吸収および蛍光測定を行うことにより、ドナーのみのタンパク質の量子収率を測定する。ドナーのみのタンパク質、アクセプターのみのタンパク質、およびドナー-アクセプタータンパク質のサンプルを同じ濃度で調製します。ドナーのみのスキャンを取得し、蛍光発光スペクトルを生成する。ドナー色素吸収極大で溶液を励起し、ドナーおよびアクセプター発光ピークをスキャンする。サンプルをアクセプターのみのタンパク質に交換するか、またはサンプルを変更してアクセプターのみのタンパク質を含むキュベットに位置を変更します。アクセプター色素のみで標識されたタンパク質の発光スキャンを取得します。ドナー励起波長で試料を励起する。サンプルをドナーアクセプタータンパク質サンプルに交換するか、サンプルを変更して、ドナーアクセプター標識タンパク質を含むキュベットに位置を変更します。同じ設定を使用してドナー - アクセプタータンパク質サンプルの発光スキャンを取得します。すべてのスペクトルについて、スキャンの終了時に測定されたバックグラウンドカウントを差し引いてバックグラウンド蛍光を補正します。PyMOLなどの3Dグラフィカル表示プログラムを使用して、スクリプトからコマンドウィンドウに適切な距離情報を直接入力することにより、距離を構造にマッピングします。測定された距離ごとにシェルを生成し、関連する誤差を生成します。異なるシェルの交点を通る位置をマップします。シグナルペプチド結合部位を、SecAおよびSecEG上の3つの異なる位置、およびシグナルペプチド上の4つの異なる位置を用いてマッピングした。前タンパク質の異なる領域と、SecAおよびSecYEGタンパク質上の3つの異なる位置との間のFRET実験は、前タンパク質結合部位および配向をマッピングする。シグナルペプチドの懲罰的結合部位は、以前に2らせんフィンガーとして同定されており、SecA C末端尾部は、2ヘリックスフィンガーに平行な配向を示唆していた。SecA37と、PhoA2と、PhoA22との間の定常状態FRETスペクトルが得られた。ドナー強度の低下は、PhoA22から伝達されるエネルギーが大きいことを示した。SecA37から遠く離れた場所にあるPhoA2サイトに対して。時間分解蛍光減衰スペクトルは、ドナー-アクセプター複合体が、1つの距離に関連するエネルギー移動と一致するより短い均質な減衰を有することを実証した。SecA PhoA2残基と三角測量部位との間に構築されたFRET距離シェルは、各シェルが緑色で示されている仮定された結合部位である2らせんフィンガーと交差することを実証した。交差する領域は、各FRETシェルよりも小さく、ヘリカル足場からの大きな寄与を含む。PhoA2残基と標識部位との間に決定されたシェルのFRET距離は、SecYEGチャネルの2らせん指および口の先端に近い位置に位置するより小さな領域を記述する。この交差領域は、PhoA2からの2らせん指の反対側の端に位置する。考慮すべき重要なことは、関心領域を三角測量し、各部位の量子収率を測定し、すべての遊離色素を除去するための標識部位の適切な選択を含む。この方法は、NMRやX線結晶構造解析などの方法で得られた構造情報と一致します。FRETの結果を構造的なコンテキストに入れると、既存の情報を強化できます。

frster-resonance-energy-transfer-mapping-new-methodology-to-elucidate

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