Name: ハイコンテンツスクリーニングおよび分析アプリケーションのためのスフェロイドの大規模生産のための堅牢な方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 学ぶ多細胞腫瘍スフェロイドの大量生産法。マルチウェルプレートで数百個のスフェロイドを作製し、共焦点顕微鏡で形態学的解析を行います。個別細胞情報の抽出や薬物スクリーニング、RNA干渉研究への応用が可能です。

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著者らは、アイルランド科学財団(SFI)(16/RI/3745)からJCSへのインフラ研究助成金の支援を認めている。UCD細胞スクリーニング研究所での研究は、UCD科学大学によって支援されています。ASCは、アイルランド研究評議会(IRC)のアイルランド政府大学院奨学金(GOIPG/2019/68)から資金提供を受けています。著者らはまた、ラボのすべてのメンバーの意見と有益な議論に感謝します。図 1 のアートワークは、BioRender で生成されたものです。

1. 細胞培養
<ol><li>メディアの準備<ol>
<li>細胞株の種類に応じて特定の細胞培養培地を調製する。細胞維持のためのすべての培地に10%の胎児ウシ血清(FBS)が含まれていることを確認してください。 注:異なる細胞株は異なる培地を使用する。HT−29結腸癌細胞(ATCC HTB−38)は、マッコイズ5A+10%FBS中で増殖される。HepG2肝細胞癌細胞(ATCC HB-8065)は、最小必須培地+ 1%L-グルタミン+ 10%FBSで増殖させる。H358気管支肺胞癌細胞(ATCC CRL-5807)をRPMI 1640培地+1%L-グルタミン+10%FBS中で増殖させる。L-グルタミンおよびFBSを含むすべての培地は、完全培地と呼ばれる。細胞をスフェロイドとして増殖させるようにプレーティングする場合、ECM地下材料の着色を避けるために、10%FBSを含むフェノールレッドフリー培地が必要であり、その結果、イメージングプロセス中にアーチファクトが発生する可能性があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>継代培養細胞<ol>
<li>細胞が約80%コンフルエントになったら、2mLのトリプシン-EDTA(0.25%(w/v)トリプシン/0.53mM EDTA)で短時間洗浄します。トリプシン-EDTAを吸引し、3mLの新鮮なトリプシン-EDTAを加え、37°Cで3〜5分間インキュベートする。</li>
		<li>細胞が細胞培養皿から剥離したら、7mLの新鮮な完全培地を加える。</li>
		<li>新しい10cm細胞培養皿に1mLの細胞懸濁液をピペットし、9mLの新鮮な完全培地を加えて、細胞の1:10希釈液を得た。</li>
		<li>細胞を5%CO2の加湿インキュベーター内で37°Cで培養する。</li>
		<li>細胞株に応じて3〜5日ごとに細胞を継代培養する。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 回転楕円体の生成
<ol><li>96ウェルプレートをECM地下室材料でコーティングする<ol>
<li>ECMの地下室の材料を氷の上で一晩解凍する。</li>
		<li>ECM地下室材料を冷フェノールレッドフリー無血清培地で希釈し、-20°Cに保持した予めチルドチップを使用する。 注:ECM地下材料の最終濃度は、使用される細胞株に依存する。HT-29 および H358 細胞の場合は、4 mg·mL-1 の ECM 地下室材料を使用します。HepG2細胞の場合、4mg・mL-1 の還元成長因子ECM地下材料を使用する。</li>
		<li>ECM地下材料/培地溶液15 μLを96ウェルイメージングプレートにピペットで注入します。 注:大規模な回転楕円体生産の場合、ECM地下室材料を含むチップとリザーバが冷却されている限り、このステップは8チャンネルピペットと96チャンネルピペッティングヘッドの両方で実行できます。</li>
		<li>プレートを4°Cで91 x g で20分間遠心分離します。</li>
		<li>プレートを37°Cで30分以内にインキュベートする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>継代培養および細胞のカウント<ol>
<li>プレートインキュベーション期間中、細胞をトリプシン-EDTAでインキュベートし、10%FBSを含む完全培地に再懸濁する。</li>
		<li>細胞懸濁液10 μLを血球計数計数チャンバーにピペットで入れた。チャンバーの4象限内の細胞数をカウントする。</li>
		<li>4象限内の平均細胞数を決定することによって、細胞懸濁液内の細胞数を計算する。 メモ: 自動セルカウントデバイスを使用してセルをカウントすることもできます。</li>
		<li>細胞を135 x g で室温(RT)で4分間遠心分離する。</li>
		<li>細胞がペレット化されたら、上清を吸引し、フェノールレッドを含まない完全培地に細胞を再懸濁して、mLあたり1 x 106 細胞の濃度を得る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ECM地下材料コーティングプレートに細胞をシードする<ol>
<li>フェノールレッドを含まない完全培地で細胞を希釈する。 注:播種される細胞の密度は、使用される細胞株に依存する。HT-29およびHepG2細胞の場合、ウェルあたり3 x 104 細胞を播種する。H358細胞の場合、1ウェルあたり4 x 104 細胞を播種する。</li>
		<li>細胞を1ウェルあたり35μLの総容量で播種する。必ず円を描くようにドロップワイズで追加してください。 注:大規模な回転楕円体生産の場合、ピペッティング円運動を達成できる限り、このステップは8チャンネルピペットで実行できます。</li>
		<li>細胞を5%CO2で加湿したインキュベーター内で37°Cで1時間インキュベートする。</li>
		<li>フェノールレッドを含まない完全培地中のECM地下材料の溶液を調製し、これはウェル中の2%ECM地下材料の最終濃度をもたらす。これを達成するために、1ウェルあたり23.8μLのフェノールレッドフリー完全培地に1.2μLのECM地下材料を添加し、1ウェルあたり60μLの最終容量をもたらす。</li>
		<li>細胞を5%CO2で加湿インキュベーター内で37°Cでインキュベートする。</li>
		<li>翌日、培地を100μLの新鮮なフェノールレッドフリー完全培地と交換する。</li>
		<li>2日ごとに培地を100μLの新鮮なフェノールレッドフリー完全培地と交換してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. スフェロイドの免疫蛍光染色
注:このプロトコルは、Nürnberg et al., 202015から適応されています。これらの適応は、主に、このプロトコルに記載されている回転楕円体がNürnbergらの研究15 で使用されているものよりも小さく、したがって、より短いインキュベーション時間を促進するという事実に基づいている。たとえば、ブロック時間は 2 時間から 1 時間に短縮されます。さらに、このプロトコルはスフェロイドのハイスループット生産のために設計されているため、すべての処理ステップはスフェロイドが培養されるウェルで行われ、個々のスフェロイドをチューブに移す必要はありません。
<ol><li>固定と染色に必要なすべての溶液とバッファーを準備する<ol>
<li>水200mLあたり1PBS錠剤を加えてリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を調製する。PBSをオートクレーブする。</li>
		<li>パラホルムアルデヒド(PFA)をステップ3.1.3-3.1.4に従って調製する。</li>
		<li>加熱攪拌機を使用して、400mLのPBSをヒュームフード内で60〜70°Cに加熱する。攪拌しながらPFAを15g加える。PFA が溶解したら、50 μL の 1 M CaCl2 および 50 μL の 1 M MgCl2 を追加します。</li>
		<li>100mLのPBSを加えて、500mLの最終容量を作る。NaOHを使用してPFAをpH7.4に平衡化します。PFAを滅菌真空フィルター(孔径0.22 μm)でろ過し、アリコートし、-20°Cで保存した。</li>
		<li>50 mLのPBSに3.75 gのグリシンを加えて1 Mグリシン原液を調製した。4°Cで保存してください。</li>
		<li>2.4 mLのPBSに100 μLのTriton X-100、1 mLのジメチルスルホキシド(DMSO)および1.5 mLの1 Mグリシンを加えて、5 mLの透過処理バッファーを調製する。4°Cで2週間以内に保管してください。</li>
		<li>4.9 mLのPBSに100 μLのTriton X-100、0.5 mLのDMSOおよび0.05 gのウシ血清アルブミン(BSA)を加えて、5 mLのブロッキングバッファーを調製する。ブロッキングバッファーを 1.5 mL チューブにアリコートし、-20 °C で保存します。</li>
		<li>4.74 mL の PBS に 10 μL のポリソルベート 20、0.05 g の BSA、および 250 μL の DMSO を加えて、5 mL の抗体インキュベーションバッファーを調製します。抗体インキュベーションバッファーを 1.5 mL チューブにアリコートし、-20 °C で保存します。 注:ここで説明するプロトコルでは、スフェロイドは96ウェルプレートの内部60ウェルにのみ組み立てられますが、プレートの96ウェルすべてで調製できます。内側の60個のウェルにスフェロイドのみを準備する理由は、一部の高開口数対物レンズは、一部のプレートタイプの「スカート」のために外側のウェル全体を物理的に撮像することができないためです。上記の容量は、スフェロイドを含む60ウェルの調製に十分である。</li>
	</ol></li>
	<li>回転楕円体の修正と透過<ol>
<li>回転楕円体から媒体を慎重に取り除き、ECM地下材料層が乱れていないことを確認します。</li>
		<li>スフェロイドを70 μLのPBSで2回、毎回3分間洗浄します。</li>
		<li>スフェロイドを70 μLの3%PFAで37°Cで1時間固定します。</li>
		<li>スフェロイドを70 μLのPBSで2回、毎回3分間洗浄します。</li>
		<li>70 μLの0.5 Mグリシン溶液で37°Cで30分間クエンチする。</li>
		<li>70 μLの透過処理バッファーを使用して、RT で 30 分間スフェロイドを透過処理します。</li>
		<li>スフェロイドを70 μLのPBSで2回、毎回3分間洗浄します。</li>
		<li>スフェロイドを70 μLのブロッキングバッファー中で37°Cで1時間インキュベートします。 メモ: スフェロイドが固定されると、その後のすべての処理ステップは、8 チャンネルピペットまたは 96 ウェルピペッティングヘッド (使用可能な場合) を使用して実行できます。これにより、イメージング前の回転楕円体調製の速度が増加する。</li>
	</ol></li>
	<li>一次抗体および二次抗体を用いたスフェロイドの免疫染色<ol>
<li>一次抗体を抗体インキュベーションバッファー中の適切な希釈液に希釈し、各ウェルに70 μLを加えます。スフェロイドを一次抗体と共に一晩インキュベートする。 注:希釈率は、使用される特異的抗体に依存する。ここに示す例では、リソソームを1:500の希釈率を用いてマウス抗LAMP1抗体で免疫染色している。</li>
		<li>翌日、スフェロイドを70 μLのPBSで5回、毎回3分間洗浄する。</li>
		<li>二次抗体を1:500の希釈で希釈し、蛍光結合ファロイジンを1:500に、およびヘキスト33342(1mg mL-1 ストックから)を抗体インキュベーションバッファーで1:5000で希釈し、各ウェルに70μLを加える。一晩インキュベートする。 注:抗体の希釈率は、使用される特異的抗体に依存する。高い光安定性と高輝度を示す高度に交差吸着された二次抗体が推奨されます。</li>
		<li>翌日、スフェロイドを70 μLのPBSで5回、毎回3分間洗浄する。 メモ: プレートは、回転楕円体がPBSで覆われたままである限り、イメージングの前にRTで最大2週間保存できます。</li>
	</ol></li>
</ol>4. 回転楕円体の画像取得と解析
<ol><li>画像取得<ol>
<li>スフェロイドを含む96ウェルプレートを共焦点ハイコンテントスクリーニング顕微鏡に挿入する。</li>
		<li>使用する蛍光色素を励起する適切なレーザーを選択します。</li>
		<li>クロストークを避けるために、チャンネルを順番に取得します。</li>
		<li>適切な対物レンズを使用して回転楕円体をイメージします。 注: 水没水目標がある場合は、その使用をお勧めします。たとえば、20x/1.0 NA の対物レンズでは、約 77 の視野で井戸全体を画像化できます。63x/1.15 NA の対物レンズは、約 826 の視野で井戸全体を画像化できます。</li>
		<li>画像〜30〜40スライス、回転楕円体の深さに応じて、各スライスは前のものから1.5μmの間隔で撮影された。</li>
	</ol>
</li>
	<li>画像解析<ol>
<li>回転楕円体の形態学的解析については、手順4.2.2~4.2.6に従ってください。</li>
		<li>蛍光共役ファロイジン染色に基づいてスフェロイドをセグメント化する。</li>
		<li>ヘキスト33342染色に基づいて核をセグメント化する。</li>
		<li>細胞質に存在する残留ヘキスト33342染色によって各細胞の細胞質をセグメント化する。</li>
		<li>体積、表面積、真球度、スフェロイドあたりの核の数など、スフェロイドのさまざまな形態学的特性を計算します。 メモ:この情報は、選択した画像解析ソフトウェアに組み込まれているさまざまなアルゴリズムを使用して抽出されます。</li>
		<li>さらに画像を処理して、75,000 μm3 未満および 900,000 μm3 より大きいスフェロイドを除去します。 注: これらの値は、複数の回転楕円体の融合の結果として発生した可能性のある非常に小さなセルアセンブリと大きなアセンブリの除去を可能にするための提案です。回転楕円体は、このステップで異なるサイズのクラスに分類することもできます。</li>
		<li>スフェロイド内の単一細胞を分析するには、手順 4.2.8 ~ 4.2.12 に従います。</li>
		<li>蛍光共役ファロイジン染色に基づいてスフェロイドをセグメント化する。</li>
		<li>ヘキスト33342染色に基づいて核をセグメント化する。</li>
		<li>細胞質に存在する残留ヘキスト33342染色によって各細胞の細胞質をセグメント化する。</li>
		<li>二次抗体染色に基づいてリソソームをセグメント化する。</li>
		<li>細胞あたりのリソソーム数、細胞体積、および細胞表面積を含む、各スフェロイド内の細胞の異なる形態学的特性を計算する。 メモ:この情報は、選択した画像解析ソフトウェアに組み込まれているさまざまなアルゴリズムを使用して抽出されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者らは、この研究に関連する競合する利益はないと宣言している。

ここで説明するアプローチは、HCSおよびHCAに適した方法でウェルあたり数百の回転楕円体を生成するためのプラットフォームを詳述する。ウェルあたり1つの回転楕円体のみの形成を可能にする平底および丸底ULAプレートの使用など、他の一般的な方法と比較して18,19、この方法は、スクリーニング形式で多数の回転楕円体から高解像度情報を抽出する機会を提供します。特に、この方法は、様々な腫瘍タイプを表す3つの異なる細胞株で実証されており、異なるモデルにおける様々な細胞プロセスを研究するためのその広範な適合性を強調している。この方法を使用して生成された回転楕円体は、サイズと形状に多少のばらつきを示しますが、HCAはサイズ(または関心のある他のパラメータ)によってそれらを簡単に分類できます。私たちの研究室では、このアプローチを使用して、スフェロイドサイズの関数としてのナノ粒子誘発毒性の研究に成功しました。重要なことに、スフェロイドの異なるサイズのクラスはすべて同じ井戸で研究することができ、すべてが同じ治療にさらされ、大規模な回転楕円体集団...

伝統的に、細胞ベースのアッセイは、固体基質上に成長する単層において行われており、これは効果的に2次元(2D)環境と考えることができる。しかし、2D細胞培養モデルは、いくつかの文脈では生理学的関連性を欠いており、細胞間で起こる複雑な相互作用の多くを再現できないことがますます認識されつつあります1。3次元(3D)細胞培養法は研究者の間で急速に普及しており、3D細胞モデルは、組織環境内の細胞が遭遇する生理学的条件をよりよく模倣する高い可能性を示しています2。採用されている3Dセルアセンブリにはいくつかの異なるタイプがありますが、最も一般的な2つのタイプは回転楕円体とオルガノイドです。スフェロイドは、多くの異なる細胞株から増殖させることができ、使用する細胞型およびそれらの組み立て方法に応じて様々な形状およびサイズを採用することができる3。さらに、スフェロイドは、癌細胞株から増殖させる場合、多細胞腫瘍スフェロイド(MCTS)と呼ばれることもあり、これらのモデルは、前臨床のインビトロ薬物送達および毒性研究に特に使用されることを見出している4,5。一方、オルガノイドは、私たちの体の組織や臓器をよりよく模倣することを目指しており、より複雑な形態学的配置を採用することができます。オルガノイドの産生は、成体幹細胞または多能性幹細胞の使用を含み、これは、目的の組織または器官に類似するように適切な細胞に再プログラムされ得る。これらは主に臓器の発達を調査し、疾患や宿主と病原体の相互作用をモデル化するために使用されます6。
3Dセルアセンブリを生成するために使用されるさまざまな方法があります。足場ベースの方法は、細胞が内部で付着または増殖することができる基質または支持体を提供する。これらの足場は、様々な形状を有することができ、様々な異なる材料から作製することができる。最も一般的なのは細胞外マトリックス(ECM)成分とヒドロゲルであり、それらは細胞の自然な細胞外環境に似せ、それによって生理学的相互作用を促進するように設計されています4,7。ECM地下材料は、エンゲルブレス・ホルム・スウォームマウス肉腫腫瘍から抽出され、ラミニン、IV型コラーゲン、およびペルレカン8を含むECM成分の豊富な混合物を含有することが示された。しかしながら、その有利な組成にもかかわらず、その使用には2つの主な課題、すなわちそのバッチ間の変動性および10°C以下および10°C以上の2つの異なる凝集状態を有する8,9がある。対照的に、ヒドロゲルは、その成分および剛性に関して柔軟であるという利点を有し、そしてそれらは、所望の特定の3D細胞集合体に合うようにカスタマイズすることができる7,10。足場ベースの方法は、オルガノイドの成長に不可欠であるが、回転楕円体にも広く使用されている。足場のない方法は、細胞が成長している表面に細胞が付着するのを防ぐことによって機能しますが、通常は回転楕円体アセンブリとのみ互換性があります。例としては、細胞をスフェロイドに凝集させる平底またはU底のいずれかを備えた超低接着(ULA)プレート、またはスピナー/回転フラスコ内の細胞の連続攪拌の使用が含まれます10。
多種多様な生物学的事象を研究するための3D細胞アセンブリの使用は、急速に人気を集めています。しかし、彼らの培養のために選択された方法が適切であり、下流分析の計画と互換性があることが不可欠です。例えば、ULAプレートを使用すると、高い一貫性の回転楕円体が生成されます。しかし、この方法はウェルあたり単一の回転楕円体の生産に制限されているため、スループットが制限されます。3D構造の蛍光イメージングが計画される際には、特に考慮が必要である。アセンブリが成長させる基板またはプレートは光学的に互換性がある必要があり、使用された可能性のある足場によって引き起こされる光散乱の影響を最小限に抑えるように注意する必要があります11。この特定の問題は、顕微鏡対物レンズの開口数が増加するにつれてより深刻になる。
おそらく、3D細胞モデルを使用することを選んだ主な理由の1つは、アセンブリ全体だけでなく、その中の個々のセルに関する体積イメージングデータを抽出することです。特にMCTSモデルは、治療薬が外部から中枢細胞にどのように移行するか(腫瘍内で必要なように)12の理解を深めるために非常に強力であることが証明され始めているため、異なる層の個々の細胞から知識を得ることが不可欠です。個々の細胞から定量的情報を抽出するイメージング技術は、ハイコンテンツ分析(HCA)と呼ばれ、スクリーニングの文脈において強力なアプローチです13。今日まで、HCAはほぼ独占的に単層培養に適用されてきましたが、このアプローチは幅広い細胞機能とプロセスを研究できる3D培養に適用する力を持っているという認識が高まっています14。多数の3Dアセンブリを解析でき、各構造全体からセルレベルのデータを提供できるという明確な利点があります。しかし、潜在的に厚い細胞集合体のイメージングに関連する課題、および生成される大規模なデータセットは、克服する必要があります。
この記事では、96ウェルフォーマットのMCTSの大規模生産のための堅牢な足場ベースの方法を紹介します。この方法は、各ウェルにおける数百の3D細胞集合体の製造を容易にする。3つの異なる細胞型について例を示し、肝臓、肺、および結腸の固形腫瘍モデルを表す。形成される回転楕円体は様々なサイズであり得るので、HCAは特定のサイズおよび/または形態の構造を選択するために使用される。この特徴は、観察された表現型を異なるサイズの回転楕円体間で比較することができるが、すべて同じウェル内で同じ方法で処理されるという追加の利点を提供する。このアプローチは高解像度イメージングと互換性があり、重要なことに、同じ細胞集合体から細胞レベルと細胞下レベルの両方の定量データを提供します。このスフェロイド生産方法は、ウェルごとに単一のスフェロイドを生成する方法よりもさらに利点があり、各ウェルで生産される多数のスフェロイドは、トランスクリプトームやプロテオームプロファイリングなどの他の下流分析に十分なバイオマスを提供する可能性があります。

<table><tbody><tr><td>0.05% トリプシン-EDTA (1x)、フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10050070</td><td></td></tr><tr><td>CellCarrier-96 ウルトラマイクロプレート、組織培養処理済み、黒色、蓋付き96ウェル</td><td>Perkin Elmer</td><td>6055302</td><td>これらのプレートは Phenoplates</td></tr> <tr><td>に改名されましたジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)、認定済み、EU 承認済み、南米原産、熱不活</td>化 <td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG (H+L) 高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン溶液, 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>10647032</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>このマトリゲル製剤は、BD Biosciences</td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reducedでも同じカタログ番号で見つけることができますMatrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>このマトリゲル製剤は、Corning</td></tr><tr><td>McCo's 5A medium</td><td>Gibco</td><td>26600023</td><td></td></tr><tr><td>McCo's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red</td><td>Hyclone</td><td>10358633</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>Gibco</td><td>21090022</td><td></td></tr> <tr><td>でも同じカタログ番号で販売されています最小必須培地(MEM)、グルタミンなし、フェノールレッドなし</td><td>Gibco</td><td>51200046</td><td></td></tr><tr><td>マウスモノクローナル抗LAMP1抗体(濃縮物)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>H4A3-a</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 計数チャンバー</td><td>Hirschmann</td><td>8100203</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon 組織培養皿、蓋付き、ポリスチレン、92 mm x 17 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software</td><td>Perkin Elmer</td><td>HCSHH14000000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbate 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 ミディアム、GlutaMAX サプリメント</td><td>ギブコ</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 ミディアム、グルタミン不使用、フェノールレッド無</td>し <td>ギブコ</td><td>11835063</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>ステリカップ 滅菌真空フィルターユニット</td><td>ミリポア</td><td>SCGVU05RE</td><td></td></tr></tbody></table>

ハイコンテンツスクリーニングおよび分析アプリケーションのためのスフェロイドの大規模生産のための堅牢な方法

A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications

ハイコンテントスクリーニング(HCS)およびハイコンテント分析(HCA)は、研究者が細胞から大規模な定量的表現型測定値を抽出する能力を提供する技術です。このアプローチは、細胞生物学における基本的な事象と応用事象の両方の幅広い理解を深めるのに強力であることが証明されています。今日まで、この技術の用途の大部分は単層で増殖した細胞の使用に依存してきましたが、そのようなモデルは組織で起こる相互作用やプロセスの多くを再現しないことがますます認識されています。そのため、スフェロイドやオルガノイドなどの3次元(3D)細胞アセンブリの開発と使用に出現しています。これらの3Dモデルは、がん生物学および薬物送達研究の文脈において特に強力であるが、HCSおよびHCAに適した再現可能な方法でのそれらの産生および解析は、多くの課題を提示する。ここで詳述するプロトコールは、多細胞腫瘍スフェロイド(MCTS)の生成のための方法を記載し、HCSおよびHCAと適合性のある様式で3つの異なる細胞株に適用できることを実証する。この方法は、ウェル当たり数百個のスフェロイドの産生を容易にし、スクリーニングレジームにおいて使用される場合、ウェル当たり数百個の構造からデータを得ることができ、全て同一の方法で処理され得るという特定の利点を提供する。また、高解像度蛍光イメージングのためにスフェロイドを処理する方法や、HCAがスフェロイドレベルと各スフェロイド内の個々の細胞の両方から定量的特徴を抽出する方法を詳述する例も提供されています。このプロトコルは、細胞生物学における幅広い重要な質問に答えるために容易に適用することができます。

このプロトコルでは、さまざまな腫瘍組織を表すために異なる細胞型を使用して、スフェロイドの形態で3D細胞培養アセンブリを作製する堅牢な方法が詳述されている。この方法では、ウェルあたり数百のスフェロイドを生成できるため、細胞ベースのアッセイを高含有量の方法で実行できます(図1)。このアプローチは、HT-29スフェロイド16 におけるナノ粒子の取り込みおよびHepG2スフェロイド17におけるナノ粒子誘発毒性を研究するために以前に使用されてきた。この方法は、光学品質プレートのウェル底部全体に足場材料の薄くて均一な分布を生成することに依存しています。細胞を各ウェルに播種し、さらに足場材料を、低濃度で、細胞上にオーバーレイとして添加する。これにより、スフェロイドの成長さえもサポートするベースが得られ、数百個のスフェロイドを96ウェルプレートの各ウェルで培養できることを意味します。低倍率の対物レンズを使用して、母集団全体の概要画像を生成します(図2</st...

このプロトコルは、大規模なハイコンテンツスクリーニングおよび分析に適した方法で3つの異なるタイプのスフェロイドを製造する方法を詳述する。さらに、回転楕円体および個々の細胞レベルでそれらをどのように分析できるかを示す例を提示する。

High-content screening (HCS) and high-content analysis (HCA) are technologies that provide researchers with the ability to extract large-scale ...

このプロトコルは、自動顕微鏡検査に適したマルチウェルプレートの各ウェルにおいて数百の多細胞腫瘍性スフェロイドを産生する方法を提供する。産生された回転楕円体は、異なるサイズのクラスに分類することができ、細胞内情報をすべての細胞から抽出することができる。この技術は、直接スクリーニングおよびRNA干渉研究に使用できる十分な血清を産生する。ECM地下室の材料を、マイナス20°Cに保たれた予めチルドチップを使用して、冷たいフェノールレッド無血清培地で希釈する。15マイクロリットルのECM地下材料と培地溶液を96ウェルイメージングプレートに賭ける。プレートを摂氏4度で91倍Gで20分間遠心分離する。プレートを摂氏37度で30分以内にインキュベートする。トリップと EDTA をセルに追加します。インキュベーションの終了時に細胞を摂氏37度でインキュベートし、10%FBSを含む完全培地に細胞を懸濁する。10マイクロリットルの細胞懸濁液をピペットで、血球計数計数器計数チャンバーに入れた。チャンバーの4象限内の細胞数をカウントする。セントラは、室温で4分間、135倍Gで細胞を見る。この細胞をペレット化して1つ、上清を吸引し、フェノールレッドを含まない完全培地に細胞を再懸濁して、1ミリリットルあたり10〜6個の細胞の濃度を得る。フェノールレッドを含まない完全培地で細胞を希釈する。細胞が1ウェルあたり35マイクロリットルの総容量で円運動で滴下されるのを見てください。細胞を5%の二酸化炭素で加湿したインキュベーター内で摂氏37度で1時間インキュベートする。1.2マイクロリットルのECM地下室材料で、ウェル当たり23.8マイクロリットルのフェノールレッドフリー完全培地まで、ウェル当たり60マイクロリットルの最終容量をもたらす。細胞を摂氏37度で、5%の二酸化炭素で加湿したインキュベーター内でインキュベートする。翌日、培地を100マイクロリットルの新鮮なフェノールレッドを含まない完全培地と交換する。スフェロイドを含む96ウェルプレートを、共焦点高含有量スクリーニング顕微鏡に挿入する。使用する床を励起するために適切なレーザーを選択します。クロストークを避けるためにチャンネルを順番に取得し、適切な目的を使用して回転楕円体を画像化します。スフェロイドの形態を分析するには、蛍光的に共役したFLoidと染色に基づいてスフェロイドをセグメント化します。16進数に基づいて核を3つ、3つ、3つ、4つ、2つの染色に基づいてセグメント化する。各細胞の細胞質を3、3、4、2の残留六角形によってセグメント化し、細胞質内に存在する染色剤とする。体積、表面積、真球度、スフェロイドごとの核の数など、スフェロイドのさまざまな形態学的特性を計算します。ロスはさらに、75立方マイクロメートルより小さく、900,000立方マイクロメートルより大きい回転楕円体を除去する画像を有する。スフェロイド内の単一細胞を分析するには、蛍光共役スフェロイド染色に基づいてスフェロイドをセグメント化します。16進数に基づいて核を3つ、3つ、3つ、4つ、2つの染色に基づいてセグメント化する。細胞質に存在する残留六角形の3つ、3つ、3つ、4つ、2つの染色によって各細胞の細胞質をセグメント化する。二次抗体染色に基づいてリソソームをセグメント化する。細胞あたりのリソソームの数、細胞体積および細胞表面積を含む、各スフェロイド内の細胞の異なる形態学的特性を計算する。この図は、異なる共焦点面での画像を含む、3つの異なるタイプの回転楕円体の概要をよく示しています。回転楕円体全体の体積図も表示されます。図はpHセグメンテーションプロセスを示し、パネルAは体積図におけるスフェロイド全体を示す。パネルBは、単一のスフェロイドのすべての細胞内の細胞質、核およびリソソームのセットセグメンテーションを表示する。細胞質および核は、16進数3、3、3、4、2染色に基づいてセグメント化される。そしてリソソームは、抗ラボ一抗体染色に基づいてセグメント化される。パネル C は、パネル B と同じセグメント化されていますが、3 つのプレーンなビューで示されています。回転楕円体レベルでの様々な形態学的測定が可能である。これらの測定には、スフェロイドあたりの核数の計算、ならびにこれらのpHのフェリシティ、体積、および表面積が含まれる。3つのスフェロイドタイプにおける各セルの典型的な体積。細胞当たりのリソソームの数と同様に、この図に示されている。SP生成開始時の初期セル着座密度を最適化することは、重要なステップです。この図は、あまりにも多くの細胞を加えることで、依然としてスフェロイド形成を可能にすることを示している。しかし、これは回転楕円体であれば融合を生じ得る。このようにして産生されるスフェロイドは、トランスクリプトームおよびプロテオミクス分析に供することができる。この技術は、薬物送達などのナノ粒子の取り込みを定量的に分析し、スフェロイド中の個々の細胞に対する毒性を評価するために使用される。

a-robust-method-for-large-scale-production-spheroids-for-high-content

Research

JoVE Journal

Biology

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マイクロウェルプレートを用いてサイズ制御の腫瘍球、多数の生産

我々は、明視野顕微鏡で画像化された三次元の腫瘍スフェロイドの大きさを測定するためのハイスループット画像解析ソフトウェアアプリケーションを提示する。このアプリケーションは、薬物スクリーニングにスフェロイドを使用したい研究者にとって有益であるスフェロイド、上の治療薬の効果を調べるために迅速かつ効果的な方法を提供します。...

腫瘍球の高スループット画像解析：自動的かつ正確にスフェロイドのサイズを測定するための使いやすいソフトウェアアプリケーション

水性二相システムを使用して、がん細胞スフェロイドをハイスループット96ウェルプレートフォーマットでロボット印刷するためのプロトコールが紹介されています。...

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前臨床試験からヒト試験に移行する新規薬物標的を特定することは、科学的な優先事項です。そのために、ここでは、遺伝子の枯渇ががん細胞株スフェロイドに与える影響を調べるための機能ゲノミクスアプローチについて説明します。これは、in...

癌細胞スフェロイド培養における潜在的に新規薬剤標的を同定するためのスクリーニング機能ゲノミクスを利用

ここでは、細胞凝集を通じて3D細胞スフェロイドを形成するための迅速で柔軟なプロトコルについて説明します。これは、複数の細胞タイプに容易に適応でき、細胞遊走、浸潤、アノイキスアッセイなどのさまざまなアプリケーションでの使用や、細胞-マトリックス相互作用のイメージングと定量化に適しています。...

3Dスフェロイド生産のための効率的で柔軟な細胞凝集法

さまざまな病気の徴候でもっと生理学的に関連するモデル開発およびに実装した創薬プログラムであります。ここで説明した新しいモデルのシステムは、回転楕円体を培養し、新しい抗がん剤を検索する高スループット 1536 ウェル プレート ベース...

創薬スクリーニングの高スループット三次元腫瘍回転楕円体の生成

本プロトコルは、3Dプリントされたスタンプ様デバイスを使用して、大規模かつ費用対効果の高い方法で組織スフェロイドを作製する技術を記載している。...

3Dプリントされたスタンプ状デバイス による 組織スフェロイドの生成

腫瘍スフェロイドは、腫瘍細胞と微小環境の相互作用および治療応答を評価するためにますます利用されつつある。本プロトコルは、迅速な光学的クリアリングを用いた3D腫瘍スフェロイドの半ハイスループットイメージングのための堅牢かつ簡単な方法を記載する。...

腫瘍スフェロイドの半ハイスループット分析のための迅速な光学的クリアリング

再現性の高いスフェロイドを増殖させるためのプロトコルと、画像キャプチャとプロテオミクスを用いた表現型特性評価について紹介します。...

機能的3Dスフェロイド細胞培養の半自動表現型解析(英語)

この記事では、3次元腫瘍スフェロイドを構築するための標準化された方法を示します。また、自動イメージングシステムを用いたスフェロイド観察と画像ベースの深層学習解析の戦略についても説明します。...

医薬品評価研究のための3D腫瘍スフェロイドの作製

ここでは、フォローアップのマルチパラメーター生細胞顕微鏡検査を実施するためのさまざまな多細胞スフェロイド形成方法について説明します。蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)、細胞自家蛍光、染色色素、およびナノ粒子を使用して、生きた三次元(3D)がんおよび幹細胞由来スフェロイドにおける細胞代謝、低酸素症、および細胞死の解析のためのアプローチを実証します。...

多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)

学ぶ多細胞腫瘍スフェロイドの大量生産法。マルチウェルプレートで数百個のスフェロイドを作製し、共焦点顕微鏡で形態学的解析を行います。個別細胞情報の抽出や薬物スクリーニング、RNA干渉研究への応用が可能です。

ハイコンテンツスクリーニングおよび分析アプリケーションのためのスフェロイドの大規模生産のための堅牢な方法

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