Name: 植物寄生線虫Ditylenchus dipsaciの培養とスクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学ぶ植物寄生線虫Ditylenchus dipsaciの培養と中規模化学スクリーニングによる新規殺線虫剤の探索法。顕微鏡評価と生物活性アッセイで農作物保護に貢献する化合物を同定します。

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著者らは、 Ditylenchus dipsaci 文化を提供し、培養方法に関するアドバイスを提供してくれたQing Yu博士(農業および農業食品カナダ)を認めている。ベンジャミン・ミミー博士(農業・アグリフード・カナダ)とナタリー・ドーフィネ(農業・アグリフード・カナダ)が植物寄生性線虫の 体外 培養に関するアドバイスを依頼。アンドリュー・バーンズ博士とショーン・ハリントン博士が、このプロジェクトと原稿に関する有益な提案を募集しています。JKはNSERCのアレクサンダー・グラハム・ベル・カナダ大学院奨学生です。PJRはCIHRプロジェクト助成金(313296)によってサポートされています。PJRは、化学遺伝学のカナダ研究委員長(ティア1)です。

本研究に使用した D. dipsaci 株G-137は、プリンスエドワード郡のフィッシュレイク4品種ニンニクから採取され、カナダ農業・農業食品局から提供された。新鮮な培養を開始する場合は、接種方法15についてPoirierらに相談してください。
1. ディプサシ菌の培養
<ol><li>以前に報告された作業15に従って媒体およびプレートを準備する。<ol>
<li>500 mL の栄養寒天 (NA) 培地に 23 g/L の NA ( 材料表を参照) と超純水を加えて準備します。滅菌技術を使用して、25 mL のオートクレーブ処理済み NA 培地を 20 枚の使い捨てペトリ皿 (直径 100 mm x 深さ 15 mm) に注ぎます。寒天を室温(22°C)で固化させ、蓋をして約2時間放置し、後で使用するために取っておきます。</li>
		<li>最小有機物を含む3.2 g/LのGA基礎培地、20 g/Lのスクロース、15 g/Lの寒天、および蒸留水を含む500 mLのガンボーグB-5(GA)培地を調製する( 材料表を参照)。滅菌技術を使用して、50mLのオートクレーブ処理されたGA培地を10個の使い捨てペトリ皿(直径100mm×深さ25mm)に注ぎます。寒天を室温(22°C)で固化させ、蓋をして約5時間放置し、スプラウトが移るまで滅菌バッグに室温で直立して保存する。 メモ:汚染が発生した場合に備えて、余分なメディアプレートが作られています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>前作15から修正した方法に従って種子殺菌を行う。<ol>
<li>オートクレーブ1本、攪拌子付き2Lビーカー、鉗子2個、ガラスシャーレ、及び蒸留水1L。200 mLの95%EtOH溶液および200 mLの15%市販の漂白剤溶液を調製する。</li>
		<li>エンドウ豆の種子を使用してください( 材料表を参照)。ラボベンチのブンゼンバーナーの炎の近くにある攪拌棒で滅菌された2 Lビーカーに150個の種子を注ぎます。</li>
		<li>ビーカー内の種子に200mLの95%EtOHを加え、攪拌プレート上で5分間激しく攪拌し、次いで廃容器中のEtOHを注ぐ。</li>
		<li>ビーカーに漂白剤溶液を注ぎ、種子を完全に浸します。攪拌板上で20分間激しく攪拌し、その後、廃液容器に漂白剤を注ぎます。</li>
		<li>ビーカーに蒸留水を注ぎ、種子を浸し、攪拌プレート上で20分間激しく攪拌する。水洗を3回繰り返し、各洗浄後に蒸留水を注ぐ。最終的な水洗浄の後、滅菌した種子をガラスのペトリ皿に注ぐ。</li>
		<li>汚染をチェックするには、滅菌した鉗子を使用して、層状洪水フード内の各10 cm NAプレート(ステップ1.1.1で準備)に6つの種子を移します。プレートの円周の周りに種子を配置します(ふっくらした種子が最も効果的です)。プレートを実験室ラッピングフィルムで個々に包み、暗所で26°Cで3日間インキュベートした。 注:必要以上に多くの種子を播種すると、汚染されていない種子を選択的に使用することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>以下の手順でスプラウト転写を行います。<ol>
<li>層流フードで、滅菌した鉗子を使用して、各GAプレート(ステップ1.1.2で調製)に2つの汚染されていない種子をプレートします。実験室のラッピングフィルムでプレートを個別に包み、種子が発芽できるように室温で7〜10日間インキュベートする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>前作15から改変した方法に従ってin vitro飼育を行う。<ol>
<li>50 mLの20 g/Lスクロース溶液を調製する。フィルター滅菌スクロース溶液と脇に置いておきます。</li>
		<li>層流フード内で、根組織を含む寒天片(〜2cm3)を既存の培養プレートから切り出す。エンドウ豆の苗木を含む新しいGAプレート上に500μLのスクロース溶液をピペットし、スクロースの上に寒天立方体を置く。プレートを実験室ラッピングフィルムで個別に包み、室温(〜22°C)でアルミホイルで裏打ちされた箱で培養物を維持する。</li>
		<li>継代培養線虫は、8〜9週間ごとに新鮮なGAプレート上で培養物を維持した。線虫は〜8週間後に抽出する準備ができています。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ディプサチ菌の抽出と採取
<ol><li>以下の手順に従って D. dipsaci の抽出を行う。<ol>
<li>オートクレーブに50 mLビーカー、80 mm漏斗、150 mL蒸留水、およびコーヒーフィルター。漏斗をビーカーに入れ、滅菌コーヒーフィルターで漏斗を並べます。</li>
		<li>層流フード内で、滅菌メスを用いて寒天と根組織を1cm3 に切断する。寒天キューブをコーヒーフィルターで裏打ちされた漏斗に移し、寒天に蒸留水をゆっくりと注ぎ、コーヒーフィルターを湿らせます。</li>
		<li>コーヒーフィルターで裏打ちされた漏斗をビーカーから取り外し、コーヒーフィルターで裏打ちされた漏斗を交換したら、水位がフィルターの底に触れるまでビーカーに蒸留水を満たします。</li>
		<li>コーヒーフィルターで裏打ちされた漏斗とビーカーをアルミホイルで覆います。マウスがコーヒーフィルターを通って収集ビーカーに移動できるように、ベンチトップに一晩(16時間)放置します。 注:線虫培養プレートは、解剖顕微鏡で調べたところ、虫が寒天に這い込んだときに抽出する準備ができています。典型的には、プレートは、その最初の接種後6〜8週間で抽出の準備ができている。</li>
	</ol>
</li>
	<li>D. dipsaciの収集を行う。 注:翌日、 D. dipsaci ワームはビーカーの底に定着します。<ol>
<li>コーヒーフィルターで裏打ちされた漏斗を取り出し、上部の40mLの水を収集ビーカーから吸引する。落ち着いたワームを混乱させないようにしてください。10 mL プラスチック血清学的ピペットを使用して、残りの液体を 15 mL 円錐遠心管に集めます。 注: このコレクションは、アッセイで直接使用できます。24時間以内に使用しない場合は4°Cで置きます。ワームは4°Cで3日間放置することができ、移動性に目に見える影響はありません。漏斗を取り除くと、収集ビーカー内のワームが乱れる可能性があります。集める前に底に落ち着かせてください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. インビトロ 低分子スクリーン
<ol><li>アッセイプレートを以下の手順に従って調製する。<ol>
<li>オートクレーブ処理した蒸留水を滅菌トラフに注ぎ、多チャンネルピペットを使用して、トラフから40 μLの蒸留水を平底96ウェルプレートの各ウェルに分配します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ピン留めツールを準備し、化学物質を追加する<ol>
<li>ラボベンチのブンゼンバーナー炎の近くにピナートレイ( 材料表を参照)を設置します。連続するピナートレイに以下を加える:25mLのピン洗浄液、35mLの50%DMSO(水中)、45mLの蒸留水、55mLの70%EtOH、および65mLの95%EtOH。各トレイの前に吸い取り紙を1枚置きます</li>
		<li>洗浄液のピンを噛み締め、溶液中のピンを上下に3回(3倍)動かして、ピン留めツールを清掃します。このプロトコルでは、「3x」と「10x」は、溶液中でピナーをそれぞれ3回または10回動かすことと定義されています。吸い取り紙のピンを拭き取ります。この手順をもう一度繰り返します。<ol>
<li>次に、ピン3xを蒸留水ですすぎ、続いてピンを吸い取った。この手順をもう一度繰り返します。</li>
			<li>最後に、ピン3xを95%EtOHですすぎ、続いてピンを吸い取ります。もう一度繰り返します。ピナーに火をつけ、エタノールを蒸発させます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>96ウェル化学品ストックプレートから化学品をアッセイプレートに3xピン留めしてアッセイプレートに加え、次いでピン10Xをアッセイプレートに移す。洗浄液の前にある紙に吸い込みます。</li>
		<li>プレート間のピン留めツールを以下の順序で洗浄し、その間にブロッティング紙上でブロッティング:50%DMSOで3倍(1回)、蒸留水中で3倍(1回)、75%EtOHで3倍(1回)、95%EtOHで3倍(2回)。ピナーに火をつけ、エタノールを蒸発させます。</li>
		<li>すべてのピン留めが完了したら、手順 3.2.2 を繰り返します。 注:スクリーニングは、最終濃度60μMで実施した。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ワームの追加<ol>
<li>最初に再懸濁し、次に低保持チップを使用して5 μLを観察のためにスライドにピペッティングすることによって、コレクションからの線虫の数を数えます。解剖顕微鏡を用いて5μL中の線虫の数を計数する。<ol>
<li>滅菌蒸留水を使用して濃度を2ワーム/μLに調整します。マルチチャンネルピペットおよびトラフを用いて、96ウェルプレートの各ウェルに10μL(〜20匹のワーム)を加える。 注:約15,000個の D. dipsaci 線虫は、記載された培養および収集方法を用いて培養プレートあたりに収集されるであろう。ウェルあたり20個のワームが使用されるのは、数が少ないため、モバイルワームと不動ワームの明確な視覚化と説明が容易になるためです。</li>
		</ol>
</li>
		<li>プレートを実験室のラッピングフィルムで密封し、湿ったペーパータオルで包みます。箱に入れ、200rpmに設定した20°C振とう培養器内の粘着性パッドに貼り付けた。プレートの動きを最小限に抑えるために、湿ったペーパータオルを追加して、プレートが箱の中で安定していることを確認してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. データの収集と分析
<ol><li>5日目のプレートを解剖顕微鏡で観察する。DMSO溶媒対照および薬物処理ウェル中の D. dipsaci の移動数および総数をカウントする。<ol>
<li>ワームが比較的不動である場合は、2μLの1 M NaOHを最終濃度40 mMにウェルに追加して、運動19,20を刺激する。 注:NaOHを追加した後、ワームは即座に移動し、5分以内に表示する必要があります。モバイルワームの数とワームの総数は、モバイルワームの割合を計算するために使用されます。アッセイの長さは、スクリーンの目的に応じて変化し得る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>モバイルワームの割合を計算します。 D. dipsaci スクリーンでは、再現性よく0%のモバイルワームを産出した井戸は、強いヒットとして分類されます。 注:解剖顕微鏡のステージ上でプレートを長時間暴露することは、光源がプレートを加熱し、バイオアッセイに可変的な影響を誘発する可能性があるため、回避される。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは利益相反がないと宣言しています。

重要なステップ プロトコルのシンプルさにもかかわらず、プロトコルには、成功の可能性を最大化するためにさらに注意すべき重要なステップがあります。第一に、種子を過剰に漂白すると、種子の成長が妨げられる可能性があります。したがって、漂白液中の種子の時間を20分以下に制限することが必須である。第二に、Storelliらによって以前に述べたように、線虫の見かけの健康状態は、4°C16で保存すると経時的に減少する。それらの収集の直後に線虫を使用することは、最適なスクリーニング条件が達成され得るというさらなる自信を提供する。長期間の保管が必要な場合は、チューブの蓋が酸素交換を可能にするためにきつくないことを確認してください。第三に、エンドウ豆がNAプレート上で提案された時間だけ成長することを確実にすることで、実験者はどの種子が汚染されているかを判断することができます。第四に、線虫を追加する前にGAプレート上のエンドウ豆を過剰に成長させることは、感染を弱め、線虫の収量を減少させる。最後に、制御が困難な多くの要因がスクリーニング結果に影響を与える可能性があります。したがって、結果の再現性を確保するためには、異なる日に、理想的には異なる培養プレートから収集されたPPNを使用して、複数の独立した複製スクリーニングを実行することが不可欠です。
方法の制限 プロトコルの制限は、少年から成虫までの範囲の収集されたワームの発達段階を同期させることに失敗することです。したがって、どの画面でも明らかになる強いヒットは、複数の段階で効果的である可能性があります。ただし、このプロトコルでは、効果的なステージ固有のヒットを見落とすリスクが高まります。第2の考慮事項は、 インビトロ スクリーニングが殺線虫剤発見パイプラインにおける第1ステップと考えるべきであることである。土壌ベースのアッセイは、ヒットの翻訳可能性をテストするためのパイプラインへの優れた追加です。
プロトコルの重要性と応用 本明細書に記載されるプロトコルは、単純で容易に複製可能である。さらに、このプロトコルは、わずかな変更を加えるだけで、Pratylenchus penetransを含む研究室の他のPPNに首尾よく適用されました。世界の食料安全保障を確保するためには、新規かつ安全なPPN管理措置の開発が不可欠である。これは、現在許容されている多種多様な化学殺線虫剤13,14に対して一般的に耐性があるD. dipsaciのような種に特に当てはまる。したがって、ここで概説したプロトコルは、地球規模で人間の健康に重要な貢献をする可能性を秘めています。

植物寄生性線虫(PPN)は、世界の食糧生産の12.3%の損失の原因であると推定され、年間推定1,570億ドルの損害を引き起こします1,2,3。残念なことに、効果的な化学殺線虫剤が禁止されているか、人間の安全と環境上の懸念のためにエスカレートする制限に直面しているため、PPNを制御する能力は低下しています。これは主に、前世代の農薬4の線虫選択性が低いためです。過去25年間で、6つの新しい化学殺線虫剤が試験的に導入または市場に導入されました5。これらのうちの1つは既にヨーロッパで禁止されており、もう1つは人間のヒース6,7への影響について調査されている間に中止されました。したがって、PPNに対して高度に選択的な新しい殺線虫剤の差し迫った必要性がある。
茎と球根の線虫であるDitylenchus dipsaci(D. dipsaci)は、経済的に影響力のあるPPN4.D. dipsaciは、30の生物学的人種にわたって約500種の植物種に感染し、ライ麦、オート麦、ニンニク、タマネギ、ネギなどの最も農業的に重要な作物のいくつかをターゲットにしています8,9。例えば、D. dipsaciは最近、オンタリオ州とケベック州のニンニク畑を鞭打ち、最大90%の損失をもたらしました10,11。その地理的分布はほぼ遍在しており、南北アメリカ大陸(カリフォルニアとフロリダを含む)、ヨーロッパ、アジアの大部分(中国を含む)、オセアニア9が含まれます。D. dipsaciは、葉または創傷およびレンチセル上の気孔に入る遊走性内寄生生物であり、そこで酵素を放出して細胞壁12を破壊する。作物に対するD. dipsaciの影響を悪化させると、PPNによって引き起こされる損傷は、植物を二次感染11に感受性にする。残念なことに、D. dipsaciは、他の線虫株と比較して現在の殺線虫に対して高い耐性レベルを示す13、14。
このプロトコールは、D. dipsaciの培養、および小分子候補殺線虫剤の大規模スクリーンにおけるその使用を記載している。簡単に述べると、D. dipsaci個体群は、滅菌ガンボーグB−5(GA)培地15で培養されたエンドウ豆植物上で維持および拡大される。GA培地で種子の芽を育てる前に、種子を一連の洗浄によって滅菌し、汚染をチェックするために栄養寒天(NA)に播種しなければならない。種子の滅菌は、存在する可能性のある細菌および真菌の汚染物質を検出するために不可欠です。汚染されていない種子はGAプレートに移され、そこで種子の芽が感染に備えて成長します。種子スプラウトを含むGAプレートを、根組織を含む寒天片を新鮮なプレートに移すことによって、前の培養プレートからの線虫に感染させる。6〜8週間後、線虫はGA培地から抽出され、コーヒーフィルターで裏打ちされた漏斗を通して収集ビーカーに濾過される。線虫は、適切な数が収集されたら、様々なバイオアッセイにおいて使用することができる。このプロトコールに記載された技術は、培養プレートあたり約15,000 D. dipsaciを生成する。D. dipsaciを栽培するための代替プロトコールが公開されている16,17.
以前の研究18に基づくインビトロ小分子スクリーニングアッセイもまた、本明細書に記載されている。ワームの健康の代理として、小分子曝露の5日後にウェルあたり20匹の線虫の移動性が検査される。ワームの移動性をよりよく視覚化するために、生きたワームの動きを増加させるためにNaOHが加えられる19、20。このプロトコルは、中スループットスクリーニングを可能にし、小分子の殺線虫の可能性を評価するための貴重なデータを提供します。異なる線虫収集技術が使用される場合16、17、本明細書に記載される小分子スクリーニング方法論は、それにもかかわらず実施され得る。

<table><tbody><tr><td>15 mL チューブ</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>2 鉗子</td><td>Almedic</td><td>7747-A10-108</td><td></td></tr><tr><td>2L ビーカー</td><td>Pyrex</td><td>CLS10002L</td><td></td></tr><tr><td>50mL ビーカー</td><td>Pyrex</td><td>CLS100050</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルプレート</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td></td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>Alcan Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>細菌寒天</td><td>BioShop</td><td>AGR001.5</td><td></td></tr><tr><td>コーヒーフィルター</td><td>無名ブランド</td><td>716</td><td></td></tr><tr><td>商業用漂白剤6%</td><td>Lavo Pro 6</td><td>DIN102358107</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てペトリ皿(10cm x 1.5cm)</td><td>フィッシャーブランド</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てペトリ皿(10cm x 2.5cm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z358762</td><td></td></tr><tr><td>解剖スコープ</td><td>ライカ</td><td>ライカMZ75</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ファンネル</td><td>VWR</td><td>414004-270</td><td></td></tr><tr><td>Gamborg B5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5893-10L</td><td></td></tr><tr><td>ガラスシャーレ</td><td>VWR</td><td>75845-546</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td>MAGNA</td><td>60-1200</td><td></td></tr><tr><td>リントフリーあぶらとり紙</td><td>V&P Scientific</td><td>VP 522-100</td><td></td></tr><tr><td>ローリテンションピペットチップ (200uL)</td><td>LABFORCE</td><td>1159M44</td><td></td></tr><tr><td>マルチチャネルピペット</td><td>エッペンドルフ研究プラス</td><td>3125000036</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>栄養寒天</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70148-100G</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>エンドウ豆の種子</td><td>オンタリオ種子会社</td><td>D-1995-250G</td><td></td></tr><tr><td>ピンクリーニングソリューション</td><td>V&Pサイエンティフィック</td><td>VP110A</td><td></td></tr><tr><td>ピナーV</td><td>&P Scientific</td><td>VP381N</td><td></td></tr><tr><td>ピナー リンス トレイ</td><td>V&P Scientific</td><td>VP 421</td><td></td></tr><tr><td>試薬リザーバー 蓋付き マルチチャンネルピペット用</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR703459</td><td></td></tr><tr><td>振盪インキュベーター</td><td>ニューブランズウィック サイエンティフィ</td>ック <td>I26</td><td></td></tr><tr><td>滅菌外科用ブレード</td><td>MAGNA</td><td>sb21-100-a</td><td></td></tr><tr><td>攪拌子</td><td>フィッシャーブランド</td><td>2109 -</td> 1451359<td></td></tr><tr><td>スクロー</td>ス <td>バイオショップ</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr></tbody></table>

植物寄生線虫ditylenchus dipsaciの培養とスクリーニング

Culturing and Screening the Plant Parasitic Nematode Ditylenchus dipsaci

植物寄生性線虫(PPN)は、毎年世界の食用作物の12%以上を破壊しており、これは年間約1570億ドル(USD)の損失に相当します。世界的な人口が増加し、耕作地が限られているため、PPNの侵入を制御することは食糧生産にとって非常に重要です。作物収量を最大化するという課題をさらに悪化させているのは、線虫の選択性の欠如による効果的な農薬に対する山積みの制限です。したがって、新しく安全な化学殺線虫剤の開発は、食料安全保障にとって不可欠です。このプロトコルでは、PPN種 Ditylenchus dipsaciの 培養および収集が実証される。 D. dipsaci は経済的に損傷を与え、現代のほとんどの殺線虫剤に対して比較的耐性があります。現在の研究はまた、新規小分子殺線虫剤のスクリーニングにおいてこれらの線虫を使用する方法を説明し、データ収集および分析方法論に関する報告を行う。実証されたパイプラインは、週に数千の化合物のスループットを提供し、 Pratylenchus penetransなどの他のPPN種での使用に容易に適合させることができる。本明細書に記載される技術は、新しい殺線虫剤を発見するために使用することができ、これは、次に、ますます飢餓に苦しむ世界を養うのを助けるためにPPNと安全に戦う高度に選択的な市販製品にさらに開発され得る。

独立した反復により、再現可能なヒットを明らかに 反復スクリーン間で予想される変動を説明するために、サンプル移動度の平均と変動を、最近のスクリーンの3つの代表的なプレートからプロットします(図1)。スクリーンの3回の複製を3つの異なる日に実施した。3つのプレートはすべて陰性(溶媒のみ)のコントロール(暗いバー)を有し、セット内のサンプルには確立された殺線虫剤が含まれていた。残りの化合物は、ロイ研究所で現在特徴付けられているカスタムライブラリからのものです。同じ分子を有するC. elegansを用いて行った同様のスクリーニング(SC、JK、PJR、未発表の結果)と比較して、D. dipsaciによるヒット率は有意に低く、多くの薬物プレートは活性を示さない(図1A)。いくつかのプレートは完全に再現可能なヒットを有する(図1B,C)が、他のプレートは活性が異なる(図1C)。スクリーニングされた他の種(図示せず)と比較して、D. dipsaciは、化合物に対するその応答においてより少ない変動性を示す。いずれにせよ、反復は再現可能なヒットの同定に必要であると考えられる。
殺線虫剤は、Ditylenchus dipsaciを固定化する能力が異なります D. dipsaciに対して試験された7つの特徴的殺線虫剤のうち、フルオピラムのみが本明細書に記載のアッセイにおいて堅牢な活性を示す(図1C)。これは、D. dipsaciが殺線虫剤13,14に対して耐性があることを示す以前の研究と一致している。フルオピラムは、線虫選択的に電子輸送鎖の複合体IIを阻害し、Rotylenchulus reniformisおよびMeloidogyne incognita 4,21,22を含む様々なPPNを制御するために使用される市販の殺線虫剤である。フルオピラムおよび試験した濃度で活性を欠いた殺線虫剤の1つ(オキサミル)23を、D. dipsaciによる用量反応分析を通じてより詳細に調査した。フルオピラムは、9.3μM(8.2〜10.5μMの間の95%信頼区間を有する)のEC50でD. dipsaci移動度に明らかな用量依存効果を誘導する(図2A、B)。この結果は、Storelliら、202013から公開されたインビトロ結果に基づいて予想される。オキサミルは、120μMの濃度(p = 0.3632、不対t検定)まで移動度に有意な影響を及ぼさない(図2C、D)。
水酸化ナトリウムはアッセイ感度を向上させます 液体培養18におけるC. elegansのほぼ連続的な遊泳活動とは対照的に、D. dipsaci動物は劇的に移動性が低い。これは、培養16における寄生性線虫の間では珍しいことではない。「安静時」ワームと病気のワームを区別するために、アッセイエンドポイントで40mMのNaOHを使用して、有能な個体の動きを刺激します(図3)19,20。この技術は、ネガティブコントロールウェル内のすべてのワームが移動し、スクリーン内の偽陽性の背景が非常に低いことを考えると、ワームを固定化する小分子の明確な同定を可能にする。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63438/63438fig01v2.jpg"> 図1:画面出力の例D. dipsaciを用いた3つの生物学的複製(白丸)を、図示の3つのプレートのそれぞれにおいて小分子(60μM)に対して実施した。3つのプレートすべてに、DMSO溶媒のみのコントロール(暗いバー)の0.6%があります。溶媒コントロールまたは既知の殺線虫剤で特に断りのない限り、3つのプレートのウェルには、ベンダーから購入した比較的特徴のない薬物様化合物が含まれています(Burns et al., 2015参照)18。(A)小分子ライブラリーからの96ウェルプレートは、D. dipsaciに対して観察可能な生理活性を有する任意の分子を欠いている。(B)小分子ライブラリーからの96ウェルプレートは、D. dipsaci移動度を再現性よく破壊する単一分子を有する。(c)特徴とする殺線虫剤フルオピラム(fluo)、イプロジオン(ipro)、アバメクチン(abam)、フルエンスルホン(flue)、チオキサザフェン(tiox)、オキサミル(oxam)、およびwact-11を含有する96ウェル薬物プレート。誤差範囲は平均の標準誤差を表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63438/63438fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63438/63438fig02.jpg"> 図2:移動度アッセイを用いた陽性および陰性の結果 の例。 (A)NaOHの添加前5日後に増加した濃度のフルオピラムへの D.ディプサシ の曝露後の末端表現型の例。(B)示された濃度のフルオピラムへの曝露の5日後の D. dipsaci の動きの用量反応分析。(C、D)オキサミル以外はA、Bと同じである。各グラフは、2つの別々の日に行われた試験を示しており、毎日3回の反復が行われています。各グラフのY軸は、ウェル内の動物の総数に対する移動動物数として計算された各ウェルにおけるワームの移動分率を示す。両方のグラフの誤差バーは、平均の標準誤差を表します。スケール バーは 1 mm を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63438/63438fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63438/63438fig03.jpg"> 図3:40mMのNaOHを添加した後のディプサシの移動度。共培養の5日後の溶媒のみの対照(A)、チオキサザフェン(B)、またはフルオピラム(C)の存在下でのD. dipsaciサンプルへのNaOH添加の効果。スケール バーは 1 mm を表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63438/63438fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

本プロトコールは、 Ditylenchus dipsaciを培養、収集、およびスクリーニングするための信頼性が高く簡単な方法を記載しています。

植物寄生線虫Ditylenchus dipsaciの培養とスクリーニング

Plant-parasitic nematodes (PPNs) destroy over 12% of global food crops every year, which equates to roughly 157 billion dollars (USD) lost annually. With ...

このプロトコルは、培養技術と中スループットの化学スクリーンによって、Ditylenchus dipsaciと戦うための新規殺線虫剤の発見を可能にします。この技術の単純さにより、殺線虫剤の可能性を有する化合物を同定するために、週に数千の化合物をスクリーニングすることができる。この技術は、作物の植物寄生性線虫を殺すための新しい化合物を同定することができ、したがって、世界の食糧供給を増加させることができる。まず、500ミリリットルの栄養寒天、またはNA培地を、1リットルあたり23グラムのNAおよび超純水で調製する。滅菌技術を使用して、25ミリリットルのオートクレーブ処理されたNA培地を直径100ミリメートル、深さ15ミリメートルの使い捨てペトリ皿20個に注ぎます。最小限の有機物を含むGA基礎培地1リットルあたり3.2グラム、スクロース1リットルあたり20グラム、寒天1リットルあたり15グラム、および蒸留水を含む500ミリリットルのガンボーB5またはGA培地を準備する。滅菌技術を使用して、50ミリリットルのオートクレーブ処理されたGA培地を10個の使い捨てペトリ皿に注ぎます。種子の滅菌を行うには、ラボベンチのブンゼンバーナー炎の近くにある攪拌棒を備えた滅菌された2リットルのビーカーに150個のエンドウ豆の種子を注ぎます。種子に200ミリリットルの95%エタノールを加え、攪拌プレート上で5分間激しく攪拌する。その後、エタノールを廃容器に注ぐ。ビーカーに漂白剤溶液を注ぎ、種子を完全に浸します。攪拌板上で20分間激しく攪拌する。その後、漂白剤を廃棄物容器に注ぎます。ビーカーに蒸留水を注ぎ、種子を浸し、攪拌板上で20分間激しく攪拌する。最終的な水洗浄の後、滅菌した種子をガラスのペトリ皿に注ぐ。汚染をチェックするには、滅菌した鉗子を使用して、層流フード内の各10センチメートルのNAプレートに6つの種子を移します。種を皿の円周の周りに配置します。プレートを実験室のラッピングフィルムで個別に包み、摂氏26度で3日間暗闇の中でインキュベートします。層流フード内で、滅菌された鉗子で各GAプレート上の2つの汚染されていない種子をプレートする。種子が発芽できるように、室温で7〜10日間インキュベートする。50ミリリットル/リットルの20グラムのスクロース溶液を調製する。フィルター滅菌スクロース溶液を脇に置いておきます。層流フード内で、既存の培養プレートから根組織を含む寒天片を切り取る。エンドウ豆の苗木を有する新しいGAプレート上に500マイクロリットルのスクロース溶液をピペットし、スクロースの上に寒天立方体を置く。室温でアルミホイルを敷いた箱に培養物を維持する。培養を維持するために、線虫を8〜9週間ごとに新鮮なGAプレート上で継代培養する。線虫は約8週間後に抽出する準備ができています。層流フードで、寒天と根の組織を滅菌メスで1センチメートルの立方体に切ります。寒天キューブをコーヒーフィルターで裏打ちされた漏斗に移し、寒天に蒸留水をゆっくりと注ぎ、コーヒーフィルターを湿らせます。コーヒーフィルターで裏打ちされた漏斗をビーカーから取り外し、コーヒーフィルターで裏打ちされた漏斗を交換したら、水位がフィルターの底に触れるまでビーカーに蒸留水を満たします。コーヒーフィルターで裏打ちされた漏斗とビーカーをアルミホイルで覆います。ワームを回収するには、コーヒーフィルターで裏打ちされた漏斗を取り除き、落ち着いたワームを混乱させないように、収集ビーカーから上部の40ミリリットルの水を吸引します。残りの液体を10ミリリットルのプラスチック血清学的ピペットで15ミリリットルの円錐遠心管に集めます。アッセイプレートを調製するために、オートクレーブ蒸留水を滅菌トラフに注ぎ、トラフから40マイクロリットルの蒸留水をマルチチャンネルピペットで平底96ウェルプレートの各ウェルに分配する。96ウェルの化学品ストックプレートから化学薬品を、化学プレートに3回固定してアッセイプレートに加えます。次いで、ピンをアッセイプレートに10回移す。洗浄液の前にある紙に吸い込みます。コレクションからの線虫の数を数えるために、まず、コレクションを再懸濁し、次いで低保持チップを使用して5マイクロリットルの溶液をスライド上にピペットする。解剖顕微鏡を用いて5マイクロリットル中の線虫の数を計数する。次に、滅菌蒸留水を使用してマイクロリットルあたり2匹のワームに濃度を調整します。次に、マルチチャンネルピペットとトラフで96ウェルプレートの各ウェルに10マイクロリットルのサンプルを加えます。湿らせたペーパータオルで皿を包み,箱に入れます。次に、プレートの動きを最小限に抑えて安定させるために湿らせたペーパータオルを追加し、200RPMに設定された摂氏20度の振とうインキュベーター内の粘着性のあるパッドに貼り付けます。5日目のプレートを解剖顕微鏡で観察する。DMSO溶媒対照および薬物処理ウェル中の移動性および総D.dipsaciの数をカウントする。ワームが動かない場合は、2マイクロリットルの1モルの水酸化ナトリウムを最終濃度40ミリモルにウェルに追加して動きを刺激します。モバイルワームの割合を計算します。D.dipsaciスクリーンでは、再現性よく0%のモバイルワームを産出した井戸は、強いヒットとして分類されます。3つの異なる薬物プレートを60マイクロモルの濃度でスクリーニングし、各薬物プレートは3つの生物学的複製を有する。3つのプレートすべてに、DMSO溶媒のみの対照の6%が含まれていた。小分子ライブラリーからの薬物を含む多くのプレートは、D.dipsaciに対して観察可能な生理活性を有する分子を欠いていた。いくつかのプレートは完全に再現可能なヒットを有し、特徴的な殺線虫剤を含む他のプレートはそれらの活性が異なっていた。誤差範囲は平均の標準誤差を表します。ここで、フルオピラムはアッセイにおいて堅牢な活性を示した。フルオピラムは、9.3-マイクロモルのEC50でD.dipsaci移動度に対する明らかな用量依存性効果を誘導した。オキサミルは、120マイクロモル濃度まで移動度に有意な影響を及ぼさなかった。オキサミルは、120マイクロモルの濃度まで移動度に有意な影響を及ぼさなかった。水酸化ナトリウムの添加により、不動ワームを検出する際のアッセイ感度が向上しました。40ミリモルの水酸化ナトリウムをアッセイエンドポイントとして使用して、有能な個体の動きを刺激し、したがって、安静時ワームと病気のワームを区別する。このプロトコルは、D.dipsaciおよび他の種に対する新規な作用機序を有する化合物の同定を可能にした。

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植物寄生線虫Ditylenchus dipsaciの培養とスクリーニング

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