Name: 同時光遺伝学的変調と電気的神経記録のためのオプトロードアレイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: 学ぶ光遺伝学的刺激と電気的神経記録を同時に行うLEDベースのオプトロードシステム。マイクロレンズアレイで光結合効率を高め、チャネルロドプシン-2発現トランスジェニックマウスを用いた神経応答の研究に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、韓国国立研究財団(NRF)を通じたConvergent Technology R&D Program for Human Augmentationの支援を受け、科学情報化部(NRF-2019M3C1B8090805)が資金提供し、韓国政府(MSIT)が資金提供する韓国国立研究財団(NRF)助成金(No. 2019R1A2C1088909)の支援を受けました。韓国大田(テジョン)のKAIST生物科学科にあるイ・スンヒ氏の研究室には、トランスジェニックマウスを提供してくださったことに感謝します。

動物の世話と外科的処置は、梨花女子大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました(番号20-029)。
1. オプトロードアレイの作製(図1、図2)
<ol><li>マイクロレンズアレイに光ファイバを取り付けます。<ol>
<li>光ファイバのパッシベーションコーティングを除去し、精密光ファイバクリーバーを用いて長さ5mmの小片に切断する。</li>
		<li>光ファイバを透明なUVレジンに浸し、マイクロレンズアレイ上に光ファイバを配置します。</li>
		<li>UVランプを用いて樹脂を硬化させる。</li>
		<li>エポキシを使用してマイクロレンズアレイを3Dプリントされたハウジングに取り付けます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>パーフルオロアルコキシ(PFA)コーティングされたタングステン線を整列させます。<ol>
<li>長さ30mmのPFAタングステン線4本と銀線1本を5ピン、1.27mmピッチのメスコネクタにはんだ付けします。参照電極として銀線を使用してください。</li>
		<li>1.27 mmピッチのメスコネクタをヘッドステージプリアンプに接続します。</li>
		<li>タングステン電極の微調整を助けるために、タングステンワイヤを穴(図1B)を介してシリコンに慎重に通します。</li>
		<li>整列したタングステン線を光ファイバ長より1mm短く切断する。</li>
		<li>エポキシを使用してコネクタを 3D プリントされたハウジングに接続します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>LEDの配置<ol>
<li>LEDを3Dプリントされたハウジングに配置します。</li>
		<li>パルス幅変調(PWM)を生成する駆動回路にLEDを接続します。 メモ:PWMパルスはマイクロコントローラによって生成されます。</li>
		<li>LED駆動回路によって誘起されるノイズを考慮して、記録電極がLED駆動回路から50mm離れていることを確認してください。</li>
		<li>フォトダイオードを用いて光ファイバ先端の端部の光強度を測定する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>タングステン電極と光ファイバをアルコールに15分間浸漬する。次いで、システムを滅菌D.I水に浸漬し、エチレンオキシドガスで滅菌する。</li>
</ol>2. 移植手術(図3、図4)
注:手術中は滅菌技術に従わなければなりません。
<ol><li>特定のタイプのニューロン細胞において光感受性オプシンタンパク質を発現するように遺伝子改変されたトランスジェニック動物を準備する。 注:Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII陽性ニューロンでチャネルロドプシン-2(ChR2)を発現する生後2ヶ月の雄のトランスジェニックマウス(CaMKIIα::ChR2マウス)を本研究で使用した41。</li>
	<li>ケタミン - キシラジンカクテル - ケタミン(100mg / kg)とキシラジン(10mg / kg)の混合物 - 腹腔内投与によりマウスを麻酔する。<ol>
<li>30分ごとに麻酔をかけられた動物を、ひげの動きと足のピンチに対する反応を監視してチェックしてください。</li>
		<li>追加の麻酔が必要な場合は、ケタミン - キシラジンカクテルを初期用量の半分で注射する。</li>
	</ol></li>
	<li>頭の皮膚を剃り、麻酔をかけられたマウスを定位フレームに入れます。 注:外科的皮膚準備とドレープ動物を行います。皮膚調製物は、脱毛に続いて抗菌剤による皮膚の洗浄を含む。<ol>
<li>定位フレーム内に頭を置き、イヤーバーをミータスに挿入します。</li>
		<li>マウスヘッドを定位フレームの中央に配置し、イヤーバーを緩めたり締めたりして、正確な位置決めを繰り返します。</li>
		<li>上側の切歯が前面内側の端に引っ掛かるように切歯バーを置きます。</li>
		<li>切歯バーの高さを設定するために切歯バーを調整し、鼻に対してノーズクランプを締め付けます。</li>
		<li>定位フレームに埋め込まれた熱加熱パッドを事前にオンにして、手術中、体温を37°Cに維持してください。</li>
		<li>熱プローブをマウスの直腸に入れ、恒常性調節を行います。 メモ:イヤーバーの配置は、鼻を軽くつかんで振って確認する必要があります。鼻を横方向に約4mm以上動かすことができる場合は、イヤーバーを再調整する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>乾燥を防ぐためにワセリン( 材料表を参照)で目を覆う。</li>
	<li>頭皮に1%のリドカインを注入する。鉗子で頭の皮膚を持ち上げ、注射スペースを確保し、頭皮の下にリドカインを注入する。</li>
	<li>メスと細かいはさみを使って矢状切開を行います。切開した皮膚をマイクロクランプで保持し、手術領域の視認性を広げます。 注:切開の長さは、頭頂間骨のブレグマおよび尾縁から&lt;1cm上である。</li>
	<li>綿棒を使用して骨膜を除去します。出血がある場合は、血管を密封するために牛肉を使用して頭蓋骨を焼灼する。</li>
	<li>頭蓋骨を生理食塩水で清掃し、マニピュレーターアームを使用して開頭部位に印を付けます:海馬前後部(AP)-1.8〜-2.8mm、内側側方(ML)0.5〜2.5mm、および背側腹(DV)-1〜-2mm。 メモ:マウスの頭蓋骨の厚さを考慮して、露出した脳領域から-1.2〜-2.2mmのオプトロードアレイを挿入します。海馬経路を考えると、CA3の錐体細胞は軸索をCA1に送る。したがって、光ファイバは記録電極よりも1mm長いため、光ファイバはCA3に配置され、記録電極はCA1に配置される。</li>
	<li>小脳の上に穴を開け、地面にネジを差し込みます。アースネジを精密ネジで深さ0.5mm、小脳の上部に達するまで入れます。 注:歯科用セメントの接着のために3次元表面を増加させるため、接地電極および支持構造として使用されるネジをしっかりと挿入して、移植の長期安定性を最大化してください。</li>
	<li>マークされた領域をドリルし、鉗子で頭蓋骨の一部を取り除きます。</li>
	<li>26Gの針先を時計回りに120°曲げ、針の面取り側を上向きに挿入して脳領域を露出させます。脳や血管を傷つけないように注意してください。</li>
	<li>露出した脳を生理食塩水できれいにして、骨粉や無関係な物質を洗い流します。</li>
	<li>マニピュレータアームにオプトロードアレイを固定し、露出した部分の近くに移動します。 メモ:デバイスを配置するときに、ブレグマからターゲット領域を再度計算すると、配置の精度が向上する可能性があります。</li>
	<li>オプトロードアレイをゆっくりと挿入し、アースネジをシステム42に取り付けられた銀線に接続する。 メモ:このプロセスでは、挿入中の微小運動による脳の損傷を防ぐために、揺れを最小限に抑えるために、アレイをマニピュレータアームにしっかりと固定する必要があります。挿入はゆっくりと行い、挿入後に押された可能性のある脳の腫れを説明するために10分間休ませなければならない。脳組織への1μm/s未満の挿入速度は、高品質の信号対雑音比および分離可能な単一ユニット42の数のために推奨される。</li>
	<li>出血がある場合は、乾いた綿棒で出血者に直接圧力をかけるか、焼灼を使用してください。出血が完全に止まるまで次のステップに進まないでください。</li>
	<li>露出した脳とデバイスの間にゲルフォームを挿入して、化学物質を脳との直接接触から保護します。 注:ゲルフォームはまた、止血を助け、脳を湿らせます。</li>
	<li>綿棒で頭蓋骨を拭いて水分をできるだけ取り除き、次の固定ステップに進みます。</li>
	<li>頭蓋骨に歯科用セメントを慎重に塗布して装置を固定し、ゲルフォームを覆う。歯科用セメントが完全に硬化する前に、歯科用セメントに取り付けられている場合は頭皮を分離してください。硬化した歯科用セメントを覆うために鉗子で切開した皮膚を引っ張り、頭皮を縫合する。次に、マニピュレータアームからデバイスを離します。 注:歯科用セメントが皮膚にくっつかず、頭蓋骨領域のみを覆っていることを確認してください。皮膚が成長すると、セメントを押しのけることができ、最終的には装置が脱落します。これは、長期的な in vivo 実験にとって重大な問題を引き起こすであろう。</li>
</ol>3. 回復とインプラントケア
<ol><li>マウスを定位フレームから取り出します。</li>
	<li>26G針を用いてカルプロフェン溶液を投与する。痛みを軽減するために、手術前に1回、午後の手術の場合は翌朝、手術後24時間で1回注射してください。 注:ボトル内の薬物濃度は50mg/mLで、4°Cで保存されています。 カルプロフェンは粘性があり、滅菌水で1:10に希釈する必要があります。無菌性が維持されている場合、溶液は最大4週間保存することができる。薬物の有効持続時間を維持するために、カルプロフェン溶液を12時間間隔で注入する。</li>
	<li>マウスを加熱パッドの上に置き、麻酔からうまく回復するかどうかを確認します。 注:動物は十分な意識を取り戻すまで放置されません。</li>
	<li>手術後7〜10日で縫合糸を除去します。</li>
	<li>動物が1週間回復するのを許してください。回復時間中に食物と水の摂取量を監視します。鎮痛剤を投与し、不快感や痛みの兆候を確認してください。 注:手術を受けた動物は、完全に回復するまで他の動物と一緒にいることはできません。<ol>
<li>回復期間中、毎日マウスの体重を量って体重の変化を確認します。年齢および性別が一致した対照動物と比較して20%の体重減少がある場合(セクション6を参照)、マウスを犠牲にする。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 光遺伝学的刺激と電気生理学的記録
<ol><li>マウスを麻酔し、麻酔をかけられたマウスを定位フレームに配置する。</li>
	<li>刺激パラメータを設定します。<ol>
<li>光パルスレシピを4%デューティサイクル、10Hz周波数43に設定します。神経記録中に2秒間(20パルス)の光刺激を設定します。</li>
		<li>50mAの電流を使用して、光ファイバ先端で3mW/mm2 の光強度を駆動します。フォトダイオードとパワーメータを用いて光パワーを測定し、光パワーを光ファイバファセット面積で除算します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プラスチックカバーを外し、ライトデリバリーシステムを含む上部に再利用可能なLEDと回路を取り付けます。</li>
	<li>ヘッドステージプリアンプを埋め込み型5ピンコネクタに接続します。</li>
	<li>ソフトウェアを開いて神経信号を記録します。</li>
	<li>ソフトウェア・フィルターをセットアップします。0.1 ~ 20 kHz のバンドパスフィルタと 60 Hz のノッチフィルタを使用します。アンプのサンプリングレートを 20 kHz に設定します。</li>
	<li>記録する前に、ニューラルスパイク信号が検出されたかどうかを確認します。 メモ: ニューラル信号が小さすぎるため、ノイズキャンセレーションは重要です。ノイズレベルが高すぎると、神経信号がノイズによって覆い隠され、見えなくなる可能性があります。適切な接地と電磁波シールドを使用して、ノイズを低減します。</li>
	<li>信号チェックの後、ベースライン記録のために光刺激なしで神経信号を記録します。</li>
	<li>LEDライトを照射し、同時にニューロン応答を記録します(図5 と 図6)。 注:刺激を受けたら、次の刺激実験は、前の刺激によって誘発されたニューロン活動が次の実験に影響を与えないように、少なくとも5分の間隔の後に行わなければならない。</li>
</ol>5. データ解析
<ol><li>MATLABプログラムを使用して集録したデータをロードします。</li>
	<li>スパイクソートアルゴリズム「Wave-Clus」44,45を使用して単一の神経活動を取得します。各チャンネルのスパイクをEq(1)45のように振幅スレッショルドで検出します。 しきい値 = 5 ×中央値 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63460/63460eq01.jpg"> (1) ここで、x はバンドパスフィルタ処理された信号です。<ol>
<li>「Wave-Clus」をインストールするには、 資料表のダウンロードリンクを参照してください。</li>
		<li>グラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) を開くには、MATLAB のコマンド プロンプトで wave_clus と入力します。</li>
		<li>スパイク検出用に準備されたファイル拡張子に Get_spikes('filename.ext') 関数と入力します。次に、スパイクソートのために Do_clustering('filename_spikes.mat') を実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>光刺激の前、最中、および後にソートされたスパイクを特定の時間ビンでカウントします。分析には 0.2 秒と 2 秒の時間ビンを使用します。</li>
	<li>各録音チャンネルからのスパイク数をプロットします。 注:平均の標準誤差(SEM)を用いて、8回の繰り返し実験の結果からデータを算出し、プロットした。</li>
</ol>6. 安楽死
<ol><li>全ての実験の後、二酸化炭素(CO2)吸入によりマウスを屠殺する。</li>
	<li>チャンバーを予備充電せずに、CO2 の供給および/または漏れのない透明な安楽死チャンバーにマウスを置きます。</li>
	<li>CO2ガスをオンにし、毎分安楽死室の空気の体積の30〜50%の割合で空気を置換する。 注:流量計をCO2 ガスボンベに接続して、空気置換率が1分間に安楽死チャンバの容積の30〜50%になるようにする必要があります。</li>
	<li>屠殺されたマウスの呼吸不足を監視し、目の色を変えた。 注:安楽死の予想時間は通常10〜15分以内です。</li>
	<li>死の兆候を観察した後、安楽死室からマウスを取り外します。</li>
	<li>安楽死手順を完了するには、呼吸停止と心停止を確認して死亡を確認します。</li>
</ol>

著者らは、開示する利益相反はありません。

光遺伝学的刺激と電気生理学的記録を同時に行うためのシステムの実現可能性を検証した(図6)。光刺激中の大きなスパイクは、光刺激と同時に発生する光電アーチファクトです(図6A)。これは、赤色の破線の長方形の波形のズーム表示で明らかです(図6A)。図6Aに示すように、記録された波形から光電気アーチファクトが明確に選別され、海馬信号経路の光遺伝学刺激によって誘導される神経細胞応答が明確に同定された。図6B、Cはスパイクの数を示し、刺激効果を明瞭に示す。図6Aは、図6B、Cのヒストグラムを得るために用いられる波形の1つであり、記録結果は8回の繰り返し記録セッションから...

神経活動の記録と制御は、脳がニューラルネットワークや細胞レベルでどのように機能するかを理解するために不可欠です。従来の電気生理学的記録方法は、マイクロピペットを用いたパッチクランプ1,2,3,4およびマイクロニューラル電極5,6,7,8を用いた細胞外記録を含む。神経調節法として、電気刺激は、神経細胞の直接的または間接的な脱分極を介して焦点脳領域を直接刺激するために頻繁に使用されてきた。しかし、電気的方法は、電流があらゆる方向に広がるため、記録または刺激のための神経細胞型を区別することができない。
新興技術として、光遺伝学は、神経系がどのように機能するかを理解する上で新しい時代を先導しました 9,10,11,12,13,14,15,16.光遺伝学的技術の本質は、遺伝子組み換え細胞によって発現される光感受性オプシンタンパク質の活性を制御するために光を使用することである。したがって、光遺伝学は、複雑な神経回路14、17における遺伝的に選択された細胞の洗練された調節またはモニタリングを可能にする。光遺伝学的アプローチのより広範な使用は、光学的神経調節を直接確認するために同時神経記録を必要としてきた。したがって、光制御および記録機能を備えた統合デバイスは、16、18、19、20、21、22、23、24、25と非常に貴重であろう。
従来のレーザーベースの光遺伝学的刺激には限界があり、これはかさばる高価な光送達システム26、27、28、29、30を必要とする。したがって、いくつかの研究グループは、光送達システム31、32、33、34のサイズを最小限に抑えるためにμLEDベースのシリコンプローブを採用した。しかし、LEDのエネルギー変換効率が低いため、μLEDとの直接接触による熱脳損傷のリスクがあります。光ファイバ、SU-8、および酸窒化ケイ素(SiON)などの光導波路は、熱的損傷を避けるために適用されている30、35、36、37、38、39。しかし、この戦略には、光源と導波路間の結合効率が低いという欠点もあります。
マイクロレンズアレイは、LEDと光ファイバ40との間の光結合効率を高めるために予め導入した。オプトロードシステムは、マイクロスケール40での光刺激および電気記録のためのマイクロエレクトロメカニカルシステム(MEMS)技術に基づいて開発された。LEDと光ファイバ間のマイクロレンズアレイにより、光効率が3.13dB向上しました。 図1に示すように、2x2光ファイバアレイが4x4マイクロレンズアレイ上に整列され、LEDがマイクロレンズアレイの下方に配置される。脳の損傷を軽減するために、4x4の代わりに2x2光ファイバが取り付けられています。タングステン電極アレイは、電気生理学的記録用のシリコンビアホールを使用して、オプトロードアレイに隣接して配置される(図1B)。
システムは、上部の使い捨て部品と取り外し可能な下部部品で構成されています。光ファイバアレイ、マイクロレンズアレイ、タングステン電極アレイを含む上部の使い捨て部品は、 in vivo 実験のために脳に永久に移植されるように設計されています。下部にはLED光源と外部電源ラインが含まれており、簡単に取り外し可能で、別の動物実験に再利用できます。取り外し可能な部分を取り外すと、取り付け可能なプラスチックカバーが使い捨て部品を保護します。
このシステムの実現可能性は、Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII陽性ニューロン(CaMKIIα::ChR2マウス)においてチャネルロドプシン-2(ChR2)を発現するトランスジェニックマウスの脳への移植によって検証される。記録電極は、ニューロンの光刺激中に個々のニューロンからの神経活動を記録するために使用された。

<table><tbody><tr><td>5ピンコネクタ</td><td>NW3</td><td>HD127K</td><td>1.27 mm (.050") ピッチ</td></tr><tr><td>Bovie</td><td>Fine Science Tools(F.S.T)</td><td>18010-00</td><td>高温焼灼キット</td></tr><tr><td>データ収集ソフトウェア</td><td>Intan Technologies, LLC</td><td>USB インターフェースボードソフトウェア</td><td>RHD USB インターフェースボードと連携</td></tr><tr><td>Dental</td><td>Cement Lang Dental Manufacturing Company, Inc.</td><td>1223CLR</td><td>ジェット義歯修理パッケージでジェット液と粉末を使用</td></tr><tr>デジタル<td>マニピュレーターアーム</td><td>Stoelting Co.</td><td>51904/51906</td><td>左、右各デジタルマニピュレーターアーム、3軸、アドオン</td></tr><tr><td>ゲルフォーム</td><td>Cutanplast</td><td>標準(70 * 50 * 10 mm)</td><td>止血効果のある滅菌再吸収性ゼラチンスポンジ</td></tr><tr><td>Headstage Preamplifier</td><td>Intan Technologies, LLC</td><td></td> #C3314 <td>RHD 16チャンネルレコーディング Headstages</td></tr><tr><td>Heating Pad</td><td>Stoelting Co.</td><td>53800R</td><td>Stoelting げっ歯類ウォーマー X1 ラット加熱パッド</td></tr><tr><td>付き LED</td><td>OSLON</td><td>GB CS8PM1.13</td><td>&lambda; typ. 470 nm, 視野角 80 °C, 順方向電圧 2.85 V</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks, Inc.</td><td>R2019a</td><td></td></tr><tr><td>マイクロクランプ</td><td>SURGIWAY</td><td>12-1002-04</td><td>ストレートタイプ Serre-fine DIEFFENBACH droite 3.5 cm</td></tr><tr><td>光ファイバー</td><td>Thorlabs, Inc.</td><td>FT200UMT</td><td>0.39 NA、&Oslash; 200 &micro;mの中心のマルチモード光ファイバー、300のための高い OH - 1200 nm</td></tr><tr><td>PFA上塗を施してあるタングステン</td><td>ワイヤーA-Mシステム</td><td>注文された</td><td>棒のタイプ、およびOslash; 101.6 &mu;m (.004")</td></tr><tr><td>フォトダイオード</td><td>Thorlabs</td><td>S121C</td><td></td></tr><tr><td>パワーメーター</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>精密クリー</td><td>バーFITEL</td><td>S326</td><td>ファイバースライサーツール</td></tr><tr><td>プリズム</td><td>GraphPad</td><td>5.01バージョン</td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>フェザー&trade;</td><td>#20</td><td>メスの刃、長さ 100mm メス ハンドル</td></tr><tr><td>ネジ</td><td>NASA 韓国</td><td>ステンレス鋼</td><td>直径: 1.2 mm、長さ: 3 mm</td></tr><tr><td>銀線</td><td>ニラコ コーポレーション</td><td>AG-401265</td><td>&Oslash; 200 &micro;m</td></tr><tr><td>Stereotaxic Fxrame</td><td>Stoelting Co.</td><td>51500D</td><td>デジタル新標準定位固定装置、ラットおよびマウス</td></tr><tr><td>縫合</td>糸<td>ETHICON</td><td>W9106</td><td>縫合糸サイズ:4-0、長さ:75 cm、線径:4-0</td></tr>ワ<tr><td>セリン</td><td>ユニリーバPLC</td><td>オリジナル</td><td>100%純粋なワセリン</td></tr><tr><td>Wave_Clus</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table> https://github.com/csn-le/wave_clus

同時光遺伝学的変調と電気的神経記録のためのオプトロードアレイ

Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording

過去10年間、光遺伝学は、選択的神経調節またはモニタリングの独自の能力のために、神経シグナル伝達の調査に不可欠なツールとなっています。特定のタイプのニューロン細胞をオプシンタンパク質を発現するように遺伝子改変することができるので、オプトジェネティクスは、選択されたニューロンの光刺激または阻害を可能にする。光遺伝学のための光学系にはいくつかの技術的進歩がありました。最近、光送達のための光導波路と電気生理学的記録を組み合わせて、光遺伝学的刺激または阻害に対する神経応答を同時にモニターすることが提案されている。本研究では、マルチチャネル電極を埋め込んだ埋め込み型オプトロードアレイ(2x2光ファイバ)を開発しました。 
光源として発光ダイオード(LED)を用い、微細加工したマイクロレンズアレイを集積し、光ファイバの先端に十分な光パワーを与えた。オプトロードアレイシステムは、使い捨て部品と再利用可能な部分で構成されています。使い捨て部品には光ファイバと電極があり、再利用可能な部分には光制御と神経信号処理用のLEDと電子回路があります。移植可能なオプトロードアレイシステムの新規設計は、オプトロド移植手術、光遺伝学的光刺激、および電気生理学的神経記録の手順に加えて、添付のビデオで紹介されている。 in vivo 実験の結果は、マウスの海馬興奮性ニューロンからの光刺激によって誘発される時間ロックされた神経スパイクを首尾よく示した。

オプトロード系は、標的ニューロンを活性化するのに十分な光力を提供するために首尾よく作製される。タングステン電極の微細位置合わせは、孔を介して微細加工されたシリコンを介して達成される。測定された光強度は、50mAの電流を印加したときの光ファイバ先端で3.6mW/mm2 です。マイクロレンズは光効率を3.13dB向上させた。光結合を強化するマイクロレンズアレイのために、印加電流は、マイクロレンズアレイシステムなしで同じ光強度を達成するために必要な電流の約半分である。LEDはより多くの電流でより多くの熱を発生するので、デバイスの熱を下げるためにマイクロレンズアレイを使用することは明らかに有利である。4つの電極の平均インピーダンスは1kHzの周波数で71.39kΩであり、活動電位の検出には十分低い。さらに、オプトロードアレイは、使い捨ておよび再利用可能な部品で構成され、コストを削減し、移植の総重量を最小限に抑えます。使い捨て部品の重量は約0.58gです。
CaMKIIα::ChR2マウスを用いてChR2発現ニューロンを直接刺激し、 <strong class="xfi...

ここでは、光伝達用光ファイバと神経記録用電極アレイを用いたオプトロードシステムの製造方法について紹介する。チャネルロドプシン-2を発現するトランスジェニックマウスを用いた インビボ 実験は、同時光遺伝学的刺激および電気生理学的記録のためのシステムの実現可能性を示す。

During the last decade, optogenetics has become an essential tool for the investigation of neural signaling due to its unique capability of selective ...

このプロトコルには、同時に光遺伝学的刺激および電気生理学的記録のためのオプトロードシステム上での作製が含まれる。提案するLEDベースのシステムは、マイクロレンズアレイを介して光結合効率を高める。LED光源は、レーザー光源よりも簡単な照明設定を備えているため、システムはワイヤレスシステムに容易に適用できます。光遺伝学は、神経疾患の病態や治療機構を理解するための経路技術です。光遺伝学は、脊髄損傷、てんかん、パーキンソン病およびアルツハイマー病を治療するために適用することができる。当社のLEDベースのデバイスは、システムの複雑さ、費用対効果、低消費電力など、いくつかの利点を備えたワイヤレスシステムとしてさらに実装できます。まず、1.27mmピッチのメスコネクタをヘッドステージプリアンプに接続します。LEDを3Dプリントされたハウジングに配置します。フォトダイオードを用いて光ファイバ先端の端部の光強度を測定する。タングステン電極と光ファイバをアルコールに15分間浸漬し、風乾します。頭の皮膚を剃り、麻酔をかけられたマウスを定位フレームに入れます。定位フレーム内に頭を置き、イヤーバーをミータスに挿入します。定位フレームに埋め込まれた熱加熱パッドの電源を入れ、外科的処置を通して体温を摂氏37度に維持する。切開バーの高さを設定するための切開バーを調整し、鼻に対してノーズクランプを締め付けます。乾燥を防ぐためにワセリンで目を覆う。鉗子で頭の皮膚を持ち上げ、注射スペースを確保し、頭皮の下に1%リドカインを注入する。メスと細かいはさみを使って矢状切開を行います。切開した皮膚をマイクロクランプで保持し、手術領域の視認性を広げます。綿棒を使用して骨膜を除去します。出血がある場合は、血管を密封するためにウシを使って頭蓋骨を焼灼する。生理食塩水で頭蓋骨をきれいにし、マニピュレーターアームを使用して開頭部位に印を付けます。小脳の上に穴を開け、地面にネジを差し込みます。精密なネジを使用して、小脳の上部に達するまで0.5ミリメートルの深さのアースネジを置きます。マークされた領域をドリルし、鉗子で頭蓋骨の一部を取り除きます。26ゲージの針先を時計回りに120度の角度で曲げ、針の面取り側を上向きに挿入して脳領域を露出させます。マニピュレータアームにオプトロードアレイを固定し、露出した部分の近くに移動します。オプトロードアレイをゆっくりと挿入し、システムに取り付けられている銀線にアースネジを接続します。露出した脳とデバイスの間にゲルフォームを挿入して、化学物質を脳との直接接触から保護します。頭蓋骨に歯科用セメントを慎重に塗布して装置を固定し、ゲルフォームを覆う。歯科用セメントが完全に硬化する前に、歯科用セメントに取り付けられている場合は頭皮を分離します。硬化した歯科用セメントを覆うために鉗子で切開した皮膚を引っ張り、頭皮を縫合する。麻酔をかけられたマウスを定位フレームに置きます。光パルスレシピを10ヘルツ周波数で4%デューティサイクルに設定します。神経記録中に2秒間光刺激を設定します。プラスチックカバーを外し、再利用可能なLEDを回路に取り付けて、ライトデリバリーシステムの上部を取り付けます。ヘッドステージプリアンプを埋め込み型5ピンコネクタに接続します。ソフトウェアを開き、ソフトウェアフィルタを設定します。次に、アンプのサンプリングレートをクリックして設定します。次に、[帯域幅の変更] をクリックします。アンプの帯域幅を低く設定し、アンプの帯域幅を高く設定します。ソフトウェアDACハイパスフィルタを確認してください。スパイクスコープを開き、電圧スレッショルドを使用して神経信号をチェックします。「停止して記録」をクリックします。取得したデータをMATLABでロードし、生データを確認します。次に、wave clustアルゴリズムを含むスパイクソートコードを実行します。ラスタープロットでソートされたスパイクを確認します。次に、カウントスパイクをプロットし、光刺激中に誘発されたスパイクを確認します。この図は、中央に2秒間の光が当たる期間を含む、正確な条件で記録された波形全体を示しています。各光刺激パルスに続く誘発された個々の神経スパイクの数は、2秒および0.2秒の異なる時間ビンを有するベースラインと比較して有意に増加した。この図は、光刺激の前、最中、および後の各チャネルのスパイクヒストグラムを示しています。挿入図は、移植されたオプトロドアレイの位置を示す。さらに、ズームされたバージョンは、100ミリ秒のタイムビンを持つスパイクヒストグラムを示しています。青いバーは、応答を記録するために LED ライトが点灯していた期間を表します。LED駆動電流プロセスによるアーチファクトノイズを最小限に抑えるには、電気信号経路とLED回路の間に十分な距離を確保するようにシステムを設計する必要があります。提案されたLEDベースのオプトロードシステムは、光遺伝学的刺激を送達し、誘発された神経応答を記録することができるので、動物の行動に関連する様々な神経シグナル伝達を調査することができる。LEDオプトロードアレイは、自由に動く動物研究に使用できるワイヤレスオプトジェネティクスインターフェースと互換性があります。

optrode-array-for-simultaneous-optogenetic-modulation-electrical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

手順は脳波、筋電図、脳乳酸濃度が監視されながらoptogenetically大脳皮質錐体ニューロンの活動を操作するために記述されている。彼らは自発的睡眠/覚醒サイクルを受けながら、実験的な録音はケーブルつながマウスで実行されます。...

同時脳波、リアルタイム乳酸濃度の測定と齧歯類大脳皮質ニューロン活動のOptogeneticマニピュレーション

このビデオでは、ニューロン特異的な蛍光タンパク質を含むトランスジェニック脳切片の電気的活動を同時にイメージングし、記録する方法を概説しています。この手順では、脳スライスを曝気された人工脳脊髄液で灌流チャンバーに保持し、光源を使用して蛍光標識細胞を励起し、マルチチャネルプローブとパッチクランプで電気信号を記録する。...

脳切片中の神経細胞の光学的および電気生理学的同時モニタリング

このビデオは、内側前頭前野(mPFC)軸索を光遺伝学的に刺激し、LECの錐体ニューロンの応答を記録することにより、外側嗅内皮質(LEC)のシナプス効率を研究する手順を示しています。この方法は、パッチクランプ記録と光刺激によるシナプス活性化を組み合わせて、シナプスの可塑性を研究するものです。...

ラット脳切片におけるシナプスイベントの光遺伝学的刺激と電気生理学的記録

遺伝学と光学系を組み合わせた神経科学のツールの最近の開発は、空間的および時間解像度の前例のないレベルの神経回路の活動を制御することができ、「光遺伝学」と呼ばれる。ここでは、前頭前皮質及びsubicular錐体ニューロンの遺伝的に定義されたサブセットのoptogenetic操作で、生体内の記録に統合するためのプロトコルを提供する。...

個々の錐体細胞のハイフィデリティOptogenetic制御法<em&gt;インビボ</em

異なる電極コーティングは、電気化学的、化学的および機械的特性の変化を介して神経記録性能に影響を与える。 in vitroでの電極の比較は、しかし、生体内反応の比較は、通常、電極/神経距離と動物間の変動によって複雑に、比較的簡単です。この記事では、神経記録電極を比較する堅牢な方法を提供する。...

神経電位電極の体系的電気化学的および電気生理学的評価方法

Optogeneticsは、行動神経科学の実験で使用するための強力なツールとなっています。このプロトコルは、レーザーシステムの設計とセットアップのステップバイステップガイドを提供し、ほとんどのげっ歯類の行動試験パラダイムと互換性のある複数の同時in...

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

ここでは、麻酔をかけたマウス皮質の特定された抑制性介在ニューロンから安定した、十分に分離された単一ユニットの記録を得るための私たちの戦略について説明します。ChR2を発現するニューロンは、青色光に対する応答によって識別されます。この方法は、標準的な細胞外記録装置を使用し、カルシウムイメージングや視覚ガイドによるパッチ適用に代わる安価な方法として機能します。...

へのガイドインビボシングル単位記録

この作品は、特注ガラス optrode...

覚醒マウス ガラス Optrode を持つ神経型のオプトジェネティクス同定

私たちは、電極製造のためのシンプルで費用対効果の高いアプローチを開発し、自由に動くマウスで複数の領域にわたる信号の記録を行いました。光遺伝学と多領域電気生理学およびカルシウムシグナル記録を利用することで、発作キンドリングモデルにおける領域間のニューロン活動の解明が可能になりました。...

多領域In Vivo記録のための柔軟で便利な電気生理学的オプトロードを作成するための統合的手法

ここでは、ラットとマウスの高密度微小皮質電位法(μEcoG)記録のための2つのプロトコル(外科手術、移植、記録方法を含む)を紹介します。μECoG記録は、ラット聴覚皮質における層流ポリトロード記録、またはマウス体性感覚皮質における神経活動の光遺伝学的操作と組み合わせて行われます。...

げっ歯類における層流ポリトロードと光遺伝学とマイクロ皮質電図法の統合による皮質処理のマルチスケール研究

このプロトコルは、ウイルスの送達、視球体の着床、光血栓誘導、アストロサイトおよびニューロン活動の同時記録、アストロサイトのオプトジェネティック刺激を含む統合的な手法を提供します。この統合手法は、虚血性脳卒中の急性期から慢性期にわたり、アストロサイトとニューロンの関係を同時に調査することを目的としています。...

振る舞うマウスの神経細胞およびアストロサイト活動の光血栓性脳卒中モデリングおよび in vivo 光学記録のための統合手法

学ぶ光遺伝学的刺激と電気的神経記録を同時に行うLEDベースのオプトロードシステム。マイクロレンズアレイで光結合効率を高め、チャネルロドプシン-2発現トランスジェニックマウスを用いた神経応答の研究に応用可能です。

同時光遺伝学的変調と電気的神経記録のためのオプトロードアレイ

さらに動画を探す