Name: 組織診断のためのマウス脳のリアルタイム、2色刺激ラマン散乱イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 学ぶ 2色刺激ラマン散乱顕微鏡法によるマウス脳組織のリアルタイムイメージング。ラベルフリーで迅速な組織診断が可能となり、神経科学研究や病理診断への応用が期待されます。

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この研究は、NIH R35 GM133435からD.F.までによって支持された。

<ol><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li>
<li>Cui, M., Zhang, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+intelligence+and+computational+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Artificial intelligence and computational pathology.</a> Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).</li>
<li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).</li>
<li>Orringer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+intraoperative+histology+of+unprocessed+surgical+specimens+via+fibre-laser-based+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0027(2017).</li>
<li>Ji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((label-free+detection+of+brain+tumors+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).</li>
<li>Hollon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+real-time+intraoperative+brain+tumor+diagnosis+using+stimulated+Raman+histology+and+deep+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks.</a> Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).</li>
<li>Shin, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraoperative+assessment+of+skull+base+tumors+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 20392(2019).</li>
<li>Lu, F. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+neurosurgical+pathology+with+stimulated+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging.</a> Cancer Research. 76 (12), 3451-3462 (2016).</li>
<li>Shin, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+chemical+imaging+of+breast+calcifications+in+association+with+neoplastic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes.</a> Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).</li>
<li>Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+imaging+with+stimulated+Raman+scattering+by+chirped+femtosecond+lasers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).</li>
<li>Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+microscale+temperature+imaging+by+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).</li>
<li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-rate+molecular+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li>
<li>Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+imaging+depth+limit+of+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).</li>
<li>Fu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+intracellular+distribution+of+tyrosine+kinase+inhibitors+in+living+cells+with+quantitative+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering.</a> Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+tracing+of+deuterium+for+imaging+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).</li>
<li>Tsai, P. S., et al. Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTsai%2C+PS+%22In+Vivo+Optical+Imaging+of+Brain%22">In Vivo Optical Imaging of Brain</a>. Frostig, R. D., et al. , CRC Press. 113-171 (2002).</li>
<li>Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+pathology+by+spectrally+sliced+femtosecond+stimulated+Raman+scattering+%28SRS%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy.</a> PLoS One. 12 (5), 0178750(2017).</li>
<li>Figueroa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadband+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+parabolic+fiber+amplifier+source%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source.</a> Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).</li>
<li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+rapidly+tunable+optical+parametric+oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator.</a> Optics Letters. 38, 145-147 (2013).</li>
<li>He, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-phase+stimulated+Raman+scattering+microscopy+for+real-time+two-color+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging.</a> Optica. 4 (1), 44-47 (2017).</li>
<li>Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-window+sparse+spectral+sampling+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).</li>
<li>Wei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+chemical+imaging+by+clearing-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).</li>
<li>Wright, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+for+enhanced+signal+in+CARS+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy.</a> Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).</li>
</ol>

著者らは、利益相反はないと宣言している。

このプロトコルで提示される2色SRSイメージング方式は、1色SRSイメージングの適切な実装にかかっています。単色SRSイメージングでは、重要なステップは空間アライメント、時間アライメント、変調深度、位相シフトです。2つのビームを空間的に結合することは、ダイクロイックミラーによって達成される。ビームをダイクロイックミラーに送る際の微調整には、いくつかのステアリングミラーが使用されています。ビームがダイクロイックミラーと組み合わされると、ミラーで結合ビーム経路を拾い上げて>1m離れた壁に向かって送り、結合ビームがIRカードと重なっているかどうかを確認することで、空間的アライメントを確認できます。顕微鏡による空間的アライメントに続いて、時間的オーバーラップは、空間的アライメントを維持する利点を有する再帰反射器ベースの遅延ステージで経路長を調整することによって行われる。1,040nmアームは、このプロトコルの遅延ビームです。遅延段に 2 つのビームが時間的に重なり合う範囲がない場合、時間的なオーバーラップは不可能です。その場合、時間的なオーバーラップが遅延スキャンの途中の範囲に近くなるように、遅延ステージ全体を別の場所に移動する必要がある場合が...

従来の組織診断は、染色プロトコルに続いて光学顕微鏡下での検査に依存していました。病理学者によって使用される1つの一般的な染色方法はH&E染色である:ヘマトキシリンは細胞核を紫がかった青色に染色し、エオジンは細胞外マトリックスおよび細胞質をピンク色に染色する。この単純な染色は、多くの組織診断タスク、特に癌診断のための病理学におけるゴールドスタンダードのままです。しかし、H&E組織病理学、特に術中設定で使用される凍結切片化技術には、依然として限界があります。染色手順は、組織の埋め込み、切片化、固定、および染色1を含む面倒なプロセスである。一般的な所要時間は 20 分以上です。凍結切片化中にH&Eを実行することは、マージン評価のために細胞の特徴または成長パターンを3Dで評価する必要があるため、複数の切片が一度に処理される場合、より困難になることがあります。さらに、術中の組織学的技術は、熟練した技術者および臨床医を必要とする。多くの病院における理事会認定病理学者の数の制限は、多くの場合、術中診療の制約である。このような制限は、デジタル病理学および人工知能ベースの診断2における急速な発展の関心によって緩和され得る。しかし、H&E染色の結果は技術者の経験に応じて変動するため、コンピュータベースの診断にはさらなる課題があります2。
これらの課題は、ラベルフリーの光学イメージング技術で対処できる可能性があります。そのような技術の1つはSRS顕微鏡法である。SRSは、同期パルスレーザー(ポンプとストークス)を使用して、分子振動を高効率で励起します3。最近の報告では、タンパク質および脂質のSRSイメージングが、無傷の新鮮な組織を有するH&Eと同等の画像(刺激ラマン組織学またはSRHとしても知られる)を生成することができ、これは組織処理の必要性をバイパスし、診断に必要な時間を大幅に短縮し、術中に適応させることを実証している4。さらに、SRS画像化は、2D画像が不十分な場合に診断のための追加情報を提供する3D画像を提供する5。SRHは偏りがなく、コンピュータベースの診断に容易に利用可能なデジタル画像を生成します。これは、術中のがん診断および腫瘍マージン分析、特に脳腫瘍6,7,8における可能な解決策として急速に浮上している。より最近では、組織の化学変化のSRSイメージングは、臨床医が異なる癌タイプまたはステージ9を層別化するのにさらに役立つ有用な診断情報を提供することも示唆されている。
組織診断アプリケーションにおけるその途方もない可能性にもかかわらず、SRSイメージングは、超高速レーザー、レーザー走査顕微鏡、および洗練された検出エレクトロニクスを含むイメージングプラットフォームに関連する複雑さのために、光学に特化した学術研究室にほとんど限られています。このプロトコルは、リアルタイムの2色SRSイメージングとマウス脳組織からの疑似H&E画像の生成のための一般的なフェムト秒レーザー光源の使用を実証する詳細なワークフローを提供します。プロトコルでは、次の手順について説明します。
アライメントとチャープの最適化 ほとんどのSRSイメージング方式では、励起源としてピコ秒レーザまたはフェムト秒レーザを使用します。フェムト秒レーザでは、レーザの帯域幅はラマン線幅よりもはるかに大きくなります。この制限を克服するために、スペクトル集束アプローチを用いて、フェムト秒レーザをピコ秒タイムスケールにチャープして、狭いスペクトル分解能10を達成する。最適なスペクトル分解能は、時間的チャープ(グループ遅延分散または単に分散とも呼ばれる)がポンプとストークスレーザに対して適切に一致している場合にのみ達成されます。ここでは、高分散ガラス棒を使用してレーザービームの分散を最適化するために必要なアライメント手順と手順を示します。
周波数校正 スペクトル集束SRSの利点は、ポンプとストークスレーザの間の時間遅延を変更することによって、ラマン励起を迅速に調整できることです。このような同調は、レーザー波長の同調と比較して、高速イメージングと信頼性の高いスペクトル取得を可能にします。ただし、励起周波数と時間遅延の線形関係には外部較正が必要です。既知のラマンピークを有する有機溶媒は、スペクトル集束SRSのためのラマン周波数を較正するために使用される。
リアルタイム、2 色イメージング 組織診断アプリケーションでは、大きな組織標本の解析に必要な時間を短縮するために、イメージング速度を上げることが重要です。脂質とタンパク質の同時2色SRSイメージングにより、レーザーや時間遅延を調整する必要がなくなり、イメージング速度が2倍以上向上します。これは、ロックインアンプ11による新規な直交変調技術およびデュアルチャネル復調を使用することによって達成される。このホワイトペーパーでは、直交変調とデュアルチャンネル画像集録のプロトコルについて説明します。
エピモードSRSイメージング 現在までに示されたSRS撮像の大部分は、伝送モードで行われている。エピモードイメージングは、組織12から後方散乱光子を検出する。病理学的用途では、外科標本は非常に大きくなり得る。透過モードイメージングの場合、組織切片化がしばしば必要であり、これは望ましくないことに余分な時間を必要とする。対照的に、エピモードイメージングは、無傷の外科標本で作業することができます。後方散乱光の収集にも同じ対物レンズを使用するため、透過イメージングに必要な高数値開口コンデンサーを揃える必要もありません。エピモードは、骨など、組織切片化が困難な場合の唯一の選択肢でもあります。これまで、脳組織の場合、エピモードイメージングは2mm13>の組織厚さに対して優れたイメージング品質を提供することを実証しました。このプロトコルは、偏光ビームスプリッタ(PBS)を使用して、組織によって偏光解除された散乱光子を収集します。カスタマイズされた検出器アセンブリ12の複雑さを犠牲にして、環状検出器を用いてより多くの光子を収集することができる。PBSアプローチは実装が簡単で(蛍光に似ています)、標準フォトダイオードはすでに伝送モード検出に使用されています。
擬似H&E画像生成 2色のSRS画像が収集されたら、H&E染色をシミュレートするために色を変更することができます。この論文は、病理学アプリケーションのために脂質およびタンパク質SRS画像を疑似H&E SRS画像に変換する手順を実証する。実験プロトコルは、高品質のSRS画像を生成するために必要な重要なステップを詳述しています。ここに示される手順は、組織診断に適用可能であるだけでなく、薬物画像化および代謝画像化14,15などの他の多くのハイパースペクトルSRS画像化用途にも適合させることができる。
一般的なシステム要件 このプロトコルのレーザシステムは、2本の同期フェムト秒レーザビームを出力できなければなりません。システムは理想的には、レーザービームの1つの広い波長チューニングのための光学パラメトリック発振器(OPO)を備えています。このプロトコルのセットアップでは、2つのレーザー(1,040 nmの固定ビーム1つと、680 ~ 1,300 nmの範囲のOPOベースの調整可能なビーム)を80 MHzの繰り返しレートで出力する市販のレーザーシステムInsight DS+を使用します。SRSイメージングには、大手顕微鏡メーカーまたは自家製のレーザー走査顕微鏡を使用できます。利用される顕微鏡は、市販の直立顕微鏡フレームの上に構築された直立レーザー走査顕微鏡です。レーザービームをスキャンするために、5mmガルボミラーのペアが使用されます。自家製のレーザー走査顕微鏡を採用することを選択したユーザについては、レーザ走査顕微鏡16の構築のために以前に公開されたプロトコルを参照されたい。

<table><tbody><tr><td>100 mm アクロマティックレンズ</td><td>THORLABS</td><td>AC254-100-B</td><td>ブロードバンド、650 - 1,050 nm、アクロマティックレンズ焦点距離、100 mm</td></tr><tr><td>20 MHz バンドパスフィルター</td><td>Minicircuits</td><td>BBP-21.4+</td><td>集中 LC バンドパスフィルター、19.2 - 23.6 MHz、50 & オメガ;</td></tr><tr><td>200 mm アクロマティックレンズ</td><td>THORLABS</td><td>AC254-200-B</td><td>ブロードバンド、650 - 1,050 nm、アクロマティックレンズ焦点距離、200 mm</td></tr><tr><td>アクロマティック半波長板</td><td>ユニオン オプティック</td><td>WPA2210-650-1100-M25.4</td><td>広帯域半波長板</td></tr><tr><td>アクロマティック 1/</td>4 波長板<td>ユニオン オプティック</td><td>WPA4210-650-1100-M25.4</td><td>ブロードバンド 1/4 波長板</td></tr><tr><td>ビームサンプラー</td><td>THORLABS</td><td>BSN11</td><td>10:90プレートビームスプリッター</td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー</td><td>THORLABS</td><td>DMSP1000</td><td>その他、中心波長が1,000nm前後のダイクロイックが使用可能です。</td></tr><tr><td>DMSO(ジメチルスルホキシド)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>472301</td><td>ラマンシフトのキャリブレーション用溶媒です。ラマンピークがわかっている他の溶媒も使用できます。</td></tr><tr><td>電気光学振幅変調器</td><td>THORLABS</td><td>EO-AM-NR-C1</td><td>直交変調とデュアルチャネルイメージングには、2つのEOMが必要です。より低い駆動電圧を使用できるように、共振バージョンをお勧めします。</td></tr><tr><td>偽のH&E Staining Script</td><td>Matlab</td><td></td><td>https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining</td></tr><tr><td>Fanout Buffer</td><td>PRL-414B</td><td>Pulse Research Lab</td><td>1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for the Generating the EOM Driving Frequency and the Reference to the Lock-in</td></tr><tr><td>Fast Photodiode</td><td>THORLABS</td><td>DET10A2</td><td>Si Detector, 1 ns Rise</td></tr><tr><td>Time Frequency Divider</td><td>PRL-220A</td><td>Pulse Research Lab</td><td>TTL周波数分周器(f / 2、f / 4、f / 8、f / 16)、レーザー出力から20MHzを生成するためのもの。</td></tr><tr><td>高分散ガラスロッド</td><td>ユニオンオプティック</td><td>CYLROD01</td><td>高分散 H-ZF52A ロッドレンズ 120 mm、SF11 ロッドレンズ 100 mm</td></tr><tr><td>Insight DS+</td><td>Newport</td><td></td><td>レーザーシステムは、2つの同期パルスレーザー(1, 040 nmの固定ビームと680-1,300 nmの範囲の1つのチューナブルビーム)を80 MHzの繰り返し周波数で出力できます。&nbsp;</td></tr><tr><td>ロックインアンプ</td><td>リキッドインスツルメン</td>ツ <td>Moku Lab</td><td>フォトダイオードからSRS信号を抽出するロックインアンプです。チューリッヒインストゥルメントHF2LIまたは同様の機器も使用できます。</td></tr><tr><td>ミラーTHORLABS</td><td></td><td>BB05-E03-10</td>広<td>帯域誘電体ミラー、750 - 1,100 nm。シルバーミラーも使用できます。</td></tr><tr><td>電動ディレイステージ</td><td>Zaber</td><td>X-DMQ12P-DE52</td><td>ディレイステージで、ポンプとストークスレーザーの時間的なオーバーラップを細かく制御します。他の電動ステージは機能するはずです。</td></tr><tr><td>油浸コンデンサ</td>ー<td>ニコン</td><td>CSC1003</td><td>1.4NA。NA>1.2の他のコンデンサーを使用できます。</td></tr><tr><td>オシロスコープ</td><td>Tektronix</td><td>TDS7054</td><td>400MHz以上のバンドwdithを備えた他のオシロスコープは機能します。</td></tr><tr><td>移相器</td><td>SigaTek</td><td>SF50A2</td><td>変調周波数の位相シフト用</td></tr><tr><td>フォトダイオード</td><td>浜松製作</td>所 <td>S3994-01</td><td>シリコンPINダイオード 大面積 (10 x 10 cm2)その他、大面積で低容量のダイオードも使用可能です。</td></tr><tr><td>偏光ビームスプリッター</td><td>ユニオンオプティック</td><td>PBS9025-620-1000</td><td>広帯域偏光ビームスプリッター</td></tr><tr><td>再放射屈折率データベース</td><td></td><td></td><td>refractiveindex.info</td></tr><tr><td>レトロリフレクター</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>34-408</td><td>BBAR 直角プリズム。他のプリズムまたは再帰反射器を使用できます。</td></tr><tr><td>RFパワーアンプ</td><td>Minicircuits</td><td>ZHL-1-2W +</td><td>ゲインブロック、5 - 500 MHz、50 &Omega;</td></tr><tr><td>スキャンミラー</td><td>ケンブリッジテクノロジー</td>ズ <td>6215H</td><td>銀コーティングを施した5mmミラーセットを使用しました</td></tr><tr><td>ScanImage</td><td>Vidrio</td><td>ScanImage Basic</td><td>レーザー走査型顕微鏡制御ソフトウェア</td></tr><tr><td>ショートパスフィルター</td><td>THORLABS</td><td>FESH1000</td><td>25.0mm プレミアムショートパスフィルター、カットオフ波長:1,000nm。ストークスを効率的に抑制するには、2つのフィルターが必要になる場合があります。</td></tr><tr><td>直立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>エクリプス FN1</td><td>他の顕微鏡フレームも使用できます。レーザー走査型顕微鏡が利用可能な場合は、直接使用できます。それ以外の場合は、ガルボスキャナーとスキャンレンズを顕微鏡に追加する必要がありました。</td></tr><tr><td>水浸対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td>多光子25倍対物レンズのNAは1.05です。他の同様の目的を使用することができます。</td></tr></tbody></table>

組織診断のためのマウス脳のリアルタイム、2色刺激ラマン散乱イメージング

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、組織診断のための強力な光学イメージング技術として浮上している。近年、2色SRSは、脳腫瘍の迅速かつ信頼性の高い診断を可能にするヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)と同等の画像を提供できることが示されている。このような能力により、刺激的な術中がん診断アプリケーションが可能になりました。組織の2色SRSイメージングは、ピコ秒またはフェムト秒レーザー光源のいずれかで行うことができます。フェムト秒レーザには、高速ハイパースペクトルイメージングやリアルタイムの2色SRSイメージングなど、柔軟なイメージングモードを可能にするという利点があります。チャープレーザーパルスによるスペクトル集束アプローチは、通常、高いスペクトル分解能を達成するためにフェムト秒レーザーで使用されます。 
直交変調とロックイン検出により、2色SRS集録を実現できます。パルスチャーピング、変調、および特性評価の複雑さは、この方法の広範な採用のボトルネックです。この記事では、スペクトル集束SRSとエピモードでのマウス脳組織のリアルタイム2色イメージングの実装と最適化を実証するための詳細なプロトコルを提供します。このプロトコルは、SRSの高速および分光イメージング機能を活用する幅広いSRSイメージングアプリケーションに使用できます。

スペクトル分解能の最適化: 材料を介した分散は、分散媒(長さおよび材料)および波長によって影響を受ける。分散ロッドの長さを変更すると、スペクトル分解能と信号サイズに影響します。これはギブアンドテイクの関係であり、アプリケーションに応じて異なる重み付けが可能です。ロッドは、ビームパルスを周波数が広く、時間が狭いことから、周波数が狭く、時間が広い状態に伸ばします。 図7は 、スペクトル分解能に対するロッドの長さの変化の影響を示しています。 図7Aは、 非常に低いスペクトル分解能を示しています。このセットアップにはガラスのチャーピングロッドがなく、DMSOからの2つのラマンピークはまったく解決されません。 図7B、Cでは、ガラスチャーピングロッドの数の増加が2つのピークを解決し始める。最後に、 図7D は、マッチングチャーピングが両方...

刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、強力で非破壊的でラベルフリーのイメージング技術です。新しい用途の1つは刺激ラマン組織学であり、タンパク質および脂質ラマン遷移における2色SRSイメージングを使用して、擬似ヘマトキシリンおよびエオジン画像を生成する。ここでは、組織診断のためのリアルタイムの2色SRSイメージングのためのプロトコルを実証します。

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

このプロトコルは、スペクトル集束SRS顕微鏡の実装と最適化、およびリアルタイム刺激ラマン組織学アプリケーションにどのように使用できるかを実証します。この技術の主な利点は、SRSが組織処理と染色を必要としないため、機器が適切に整列されるとサンプルを処理できる速度です。このプロトコルは、組織学だけでなく、他のSRSアプリケーションにも適用可能です。このような用途には、小分子、薬物、細胞、および組織が含まれる。まず、ポンプビーム用の無彩色レンズを1対設置し、レーザービームサイズを起点として2倍に拡大します。100 mm と 200 mm のレンズを互いに約 300 mm 離して配置します。次に、ポンプビームを両方のレンズの中心に合わせます。次に、2番目のレンズの後に鏡を置き、ビームを1メートル以上離れた壁に送ります。IRカードで鏡から壁までのビームをトレースし、ビームのサイズが変化するかどうかを確認します。ビームのサイズが距離の関数として変化する場合は、ビームをコリメートします。調整のためにいくつかのステアリングミラーとダイクロイックミラーを取り付けることによって、2つのレーザービームを結合する。ポンプとストークスの空間的オーバーラップを最適化するには、ダイクロイックミラーの後のビームを約1メートル離れた2つの異なる位置で監視します。ステアリングミラーとそれに続くダイクロイックミラーを繰り返し調整して、ストークスビームをポンプビームに合わせます。スキャンミラーが駐車位置にあるときにステアリングミラーのペアを調整して、結合ビームがレーザー走査顕微鏡のスキャンミラーの中央に送られることを確認します。集光器の後、焦点距離がそれぞれ100ミリメートルと30ミリメートルの別のレンズペアを使用して、透過ビームをフォトダイオードに中継し、両方のビームがフォトダイオード内に含まれていることを確認します。次に、変調されたストークスビームを遮断するために2つのローパスフィルタを取り付けます。ストークスビーム経路にビームサンプラーを配置してビームの10%をピックアップし、高速フォトダイオードに送信して80メガヘルツのパルス列を検出します。ファンアウトバッファの出力の1つを取り、バンドパスフィルタでフィルタリングして、20メガヘルツの正弦波を得ます。次に、RFアッテネータを使用して、出力ピークからピーク電圧までを約500ミリボルトに調整します。得られた出力を移相器に送信すると、電圧源でRF位相を微調整できます。この出力をRFパワーアンプに送信し、アンプの出力をEOMに接続します。ストークスビームのブロックを解除した後、ビーム経路にフォトダイオードを配置して、最初のEOMの変調深さを最適化します。EOM電圧と1/4波長板を調整して、変調深度が満足のいくものになるまで調整します。ダイクロイックミラーの後にフォトダイオードを配置し、レーザー光を検出します。最初にストークスビームをブロックしてから、オシロスコープのポンプパルスピークの1つにズームインします。垂直カーソルを置いて、このピークの時間的位置をオシロスコープでマークします。次に、ポンプビームをブロックし、ストークスビームのブロックを解除します。遅延段を平行移動して、オシロスコープのピーク位置を前のステップのマーク位置に一時的に一致させます。2つのビームを一致させるのに必要な遅延距離を計算し、その後、速いビームのビーム経路を延長するか、遅いビームのビーム経路を短くする。次にスペーサーとしてDMSOと両面テープを用いて顕微鏡スライドサンプルを用意し、スライドとカバースリップの間にサンプルを保持する。カバースリップ側を顕微鏡対物レンズに向けて顕微鏡上に試料を置き、明視野照明下でI片から試料を観察した。ガラステープ界面の気泡の最上層と最下層の両方でサンプルの焦点を見つけ、テープの2つの層の間にあるように焦点を移動します。次に、同調可能なビーム出力を798ナノメートルに設定します。コンデンサーの光スループットに基づいて、対物レンズの焦点でポンプとストークスビームに対してそれぞれ約40ミリワットになるように光パワーを調整します。次に、MATLABでスキャン画像を開き、フォーカスというラベルの付いたボタンをクリックしてスキャンを開始します。ガルボスキャナの前にステアリングミラーを調整して、DC信号をチャンネル1ディスプレイの中央に配置します。電動遅延段を動かし、チャンネル2ディスプレイに表示されるロックイン出力を注意深く観察します。最後に、AC信号強度を最大化するために時間遅延を調整します。ダイクロイックミラーを調整して、SRS信号をACチャンネルの中央に配置します。次に、ロックインアンプの位相を調整して信号を最大化します。サンプルスライドを顕微鏡に取り付けた後、前述のように、サンプルフォーカスで両方のビームのパワーをそれぞれ約40ミリワットに調整しました。MATLABからスキャン画像を開きます。次に、DMSOの2,913逆センチメートルのラマンピークに対応する遅延段を走査することによって、最大のSRS信号を求める。DMSOの2,913逆センチメートルのラマンピークに対応するSRS画像を取得する。ImageJ で画像を開き、フレームの中央にある小さな領域を選択します。メジャー関数を使用して、選択した領域の値の平均と標準偏差を計算します。周波数アクセスキャリブレーションでは、DMSOの2、913、2、994逆センチメートルのラマンピークをカバーする遅延段範囲でハイパースペクトルスキャンを保存します。次に、ハイパースペクトルデータセットに対応するステージ位置を保存します。ステージ位置に対して線形回帰を実行し、ラマンシフトを2、913、2、994逆センチメートルで行います。線形回帰式を使用して、遅延位置を対応するラマン周波数に変換します。スペクトル分解能の較正のために、ロッドの挿入による光路長の増加を伴う前の位置に基づいてステージ位置を推定する。ガラス棒を追加するとビームがわずかにずれるため、ビームの空間的なオーバーラップを再調整します。偏光ビームスプリッター、1/4波長板、および第2のEOMを第1のEOMの後の浸潤ビーム経路に設置する。2番目のEOMに入力された信号を抜き、次に最初のEOMに入力された信号を差し込み、電源を入れます。ストークスビームを20メガヘルツに変調するには、ビームを最初のEOMに送ります。最初のEOMの傾きと位置を調整して、ビームがEOMクリスタルの中央に配置されるようにします。両面テープ、顕微鏡スライド、カバーガラスで組織スライドサンプルを作製する。カバースリップ側が顕微鏡対物レンズに面して顕微鏡上に試料を置きます。エピモードSRSイメージングでは、ビームが顕微鏡に入る前に1/2波長板を設置して、顕微鏡に入るビームの偏光を変化させます。偏光ビームスプリッタを対物レンズの上に配置して、偏光解除された逆反射ビームが検出器に到達できるようにします。次に、75ミリメートルのアクロメートレンズと30ミリメートルの非球面レンズを使用して、対物の背面開口部から光検出器に後方散乱光子を中継する。検出器を取り付けて、偏光ビームスプリッタによって導かれた後方散乱光を収集します。次に、変調ビームが検出器に入るのを阻止するフィルターを取り付けます。ロッドの長さを変えると、スペクトル分解能に影響します。ガラスチャーピングロッドを使用しない場合、DMSOからの2つのラマンピークはまったく解決されません。ガラスのチャーピングロッドの数の増加は、満足のいく点で2つのピークを解決し始める。マッチングチャーピングは両方のピークを解決し、ステージ位置を周波数に合わせて較正するために使用できます。DMSOスペクトルを画像化するために使用される直交偏光の2つの時間遅延パルス列は、許容可能な変調深さと時間的分離を有するSRS励起との間の時間遅延を示す。対照的に、位相シフトの悪い2色のSRSは、反転または負のピークを生じる。2,850および2,930逆センチメートルのエクスビボマウス脳組織におけるリアルタイム2色SRS画像化がここに示されている。生の脂質およびタンパク質画像を色分けして、脂質およびタンパク質の寄与を示す単一の画像を生成した。偽ヘマトキシリンおよびエオジン再着色は、病理学的適用のためのヘマトキシリンおよびエオジン染色を模倣するためにも行われた。空間的時間オーバーラップと空間分解能の最適化は、SRS の空間フォーカス アプローチにとって最も重要なステップです。この方法は、一般に、過渡吸収顕微鏡などの他のポンププローブ顕微鏡実験に適用可能である。この方法はまた、細胞および組織における非蛍光分子の画像化を可能にする。ここで提示された方法は、クリニックにおける刺激ラマン組織学の将来の翻訳のための画像取得時間を短縮する。

real-time-two-color-stimulated-raman-scattering-imaging-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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出典:エスピノーザ、R.、他.組織診断のためのマウス脳のリアルタイム2色刺激ラマン散乱イメージング. J. Vis. Exp.

マウス脳組織の2色刺激ラマン散乱イメージング

Source: Nishimura, C. ら。 HIV誘発性神経炎症のマウスモデルにおける2光子顕微鏡を用いた脳血管構造の定量化。 J. Vis. Exp. (2016).

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学ぶ 2色刺激ラマン散乱顕微鏡法によるマウス脳組織のリアルタイムイメージング。ラベルフリーで迅速な組織診断が可能となり、神経科学研究や病理診断への応用が期待されます。

組織診断のためのマウス脳のリアルタイム、2色刺激ラマン散乱イメージング

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