Name: 自己 カエノールハブディティス 線虫の生態学的調査を行うための高度にスケーラブルなアプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 学ぶCaenorhabditis線虫の生態学的調査のためのスケーラブルな分離・同定法。モバイルデータ収集プラットフォームとクラウドデータベースを活用し、生息環境データを正確に記録する手法を解説します。

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この研究は、ノースウェスタン大学からのスタートアップ資金と、米国国立科学財団のキャリア賞(IOS-1751035)によって支援され、どちらもE.C.A.に授与されました。

<ol><li>Frézal, L., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+outside+the+Petri+dish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849(2015).</li>
<li>Sivasundar, A., Hey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+from+natural+populations+with+RNAI+reveals+high+outcrossing+and+population+structure+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Sampling from natural populations with RNAI reveals high outcrossing and population structure in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology: CB. 15 (17), 1598-1602 (2005).</li>
<li>Kiontke, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phylogeny+and+molecular+barcodes+for+Caenorhabditis%2C+with+numerous+new+species+from+rotting+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">A phylogeny and molecular barcodes for Caenorhabditis, with numerous new species from rotting fruits.</a> BMC Evolutionary Biology. 11, 339(2011).</li>
<li>Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+years+of+life+in+compost%3A+temporal+and+spatial+variation+of+North+German+Caenorhabditis+elegans+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations.</a> Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).</li>
<li>Richaud, A., Zhang, G., Lee, D., Lee, J., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+local+coexistence+pattern+of+selfing+genotypes+in+Caenorhabditis+elegans+natural+metapopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The local coexistence pattern of selfing genotypes in Caenorhabditis elegans natural metapopulations.</a> Genetics. 208 (2), 807-821 (2018).</li>
<li>Ferrari, C., Salle, R., Callemeyn-Torre, N., Jovelin, R., Cutter, A. D., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephemeral-habitat+colonization+and+neotropical+species+richness+of+Caenorhabditis+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ecology%22%5BJournal%5D)">Ephemeral-habitat colonization and neotropical species richness of Caenorhabditis nematodes.</a> BMC Ecology. 17 (1), 43(2017).</li>
<li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sampling+of+Hawaiian+Caenorhabditis+elegans+reveals+high+genetic+diversity+and+admixture+with+global+populations%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Deep sampling of Hawaiian Caenorhabditis elegans reveals high genetic diversity and admixture with global populations.</a> eLife. 8, 50465(2019).</li>
<li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+adaptation+and+spatiotemporal+patterns+of+genetic+diversity+revealed+by+repeated+sampling+of+Caenorhabditis+elegans+across+the+Hawaiian+Islands%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Noble, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selfing+is+the+safest+sex+for+Caenorhabditis+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Selfing is the safest sex for Caenorhabditis tropicalis.</a> eLife. 10, 62587(2021).</li>
<li>Cutter, A. D., Morran, L. T., Phillips, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Males%2C+Outcrossing%2C+and+Sexual+Selection+in+Caenorhabditis+Nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Males, Outcrossing, and Sexual Selection in Caenorhabditis Nematodes.</a> Genetics. 213 (1), 27-57 (2019).</li>
<li>Petersen, C., Dirksen, P., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+we+need+more+ecology+for+genetic+models+such+as+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Why we need more ecology for genetic models such as C. elegans.</a> Trends in Genetics: TIG. 31 (3), 120-127 (2015).</li>
<li>Haber, M., Schüngel, M., Putz, A., Müller, S., Hasert, B., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+history+of+Caenorhabditis+elegans+inferred+from+microsatellites%3A+evidence+for+spatial+and+temporal+genetic+differentiation+and+the+occurrence+of+outbreeding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding.</a> Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2005).</li>
<li>Barrière, A., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+C.+elegans+and+Related+Nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Isolation of C. elegans and Related Nematodes.</a> WormBook. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19764/ (2018).</li>
<li>Poullet, N., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+and+isolation+of+C.+elegans+from+the+natural+habitat%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sampling and isolation of C. elegans from the natural habitat.</a> Methods in Molecular Biology. 1327, 221-229 (2015).</li>
<li>Di Bernardo, M., Crombie, T. A., Cook, D. E., Andersen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((easyFulcrum%3A+An+R+package+to+process+and+analyze+ecological+sampling+data+generated+using+the+Fulcrum+mobile+application%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">easyFulcrum: An R package to process and analyze ecological sampling data generated using the Fulcrum mobile application.</a> PloS one. 16 (10), 0254293(2021).</li>
<li>Mobile data collection & workflow automation in NCAP. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fulcrumapp.com/">https://www.fulcrumapp.com/</a> (2021).</li>
<li>Nematode Isolation Application. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-isolation">https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-isolation</a> (2021).</li>
<li>Nematode Field Sampling Application. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-field-sampling">https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-field-sampling</a> (2021).</li>
<li>JOVE wild_isolate-genotyping-template. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://docs.google.com/spreadsheets/d/1oEP40jy6_K6Wkwn7Qm4iF58rTUe4JWk2zhJ20-keoOk/edit">https://docs.google.com/spreadsheets/d/1oEP40jy6_K6Wkwn7Qm4iF58rTUe4JWk2zhJ20-keoOk/edit</a> (2021).</li>
<li>Nucleotide BLAST: Search nucleotide databases using a nucleotide query. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch">https://blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch</a> (2021).</li>
<li>easyFulcrum. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html">http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html</a> (2021).</li>
<li>Andersen, E. C., Bloom, J. S., Gerke, J. P., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+in+the+neuropeptide+receptor+npr-1+is+a+major+determinant+of+Caenorhabditis+elegans+growth+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A variant in the neuropeptide receptor npr-1 is a major determinant of Caenorhabditis elegans growth and physiology.</a> PLoS Genetics. 10 (2), 1004156(2014).</li>
<li>Tuli, M. A., Daul, A., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormBook%3A+Caenorhabditis+Nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">WormBook: Caenorhabditis Nomenclature.</a> WormBook. , (2018).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormBook%3A+Maintenance+of+C.+Elegant%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">WormBook: Maintenance of C. Elegant.</a> WormBook. , (2006).</li>
</ol>

著者らは利益相反を報告していない。

このプロトコルには、注意して実行する必要がある重要な手順が含まれています。たとえば、フィールドチームと分離チームは、フィールドからサンプルを収集したり、実験室のサンプルから線虫を単離したりする前に、アプリケーションで正しい収集プロジェクトを選択するように注意することが重要です。間違った収集プロジェクトが選択された場合、誤ったデータレコードは、オンラインでレコード編集ツールを使用してフルクラムデータベースで修正するのが最適です。このプロセスは、多くの誤って配置されたレコードにとって面倒な作業になる可能性があります。ただし、データベースはレコードに対する変更を保持するため、収集レコードと分離レコードの完全な監査が可能になります。このプロトコルの他の重要なステップには、フィールドからのサンプルと、それらのサンプルから単離された線虫の処理が含まれます。Caenorhabditis線虫がサンプリングおよび出荷ステップで生き残ることを保証するために、サンプルの温度は4°C〜25°Cの間で維持されるべきである。 25°Cを超える温度は、C. elegans14に無菌を引き起こす可能性があります。線虫への損失を最小限に抑えるために、可能な限り5日以内にサンプルを収集バッグから収集プレートに移すようにしてください。線虫が単離された後、それらが滅びる前に遺伝子型決定され、凍結保存されることが重要である。真菌や細菌の汚染がSプレートを不快にさせる可能性があるため、生後2〜3週間以上のSプレート上に生きた線虫を見つけることは困難です。
このプロトコルは、研究者が現場にいる間に収集したいさまざまな種類のデータに対応するために簡単に変更できます。たとえば、「線虫フィールドサンプリング」アプリケーションは、アプリケーション編集用のフルクラムのオンラインGUIを使用して、新しいデータ入力フィールドで簡単にカスタマイズできます。さらに、データ分析パッケージ easyFulcrumは、新しいデータを処理するときにこれらの編集に対応できます15。ユーザーが魅力的に感じるかもしれない別の修正は、現場で異なるサンプリング方法を使用することです。研究者は、離散的な基板をサンプリングするのではなく、複数の基板タイプを含むより大きな領域をサンプリングしたいと考えるかもしれません。これらのより大きなサンプルは、Baermann漏斗またはトレイ抽出方法を使用して実験室で最もよく処理されます13。重要なことに、CラベルとSラベルの使用は、これらの技術に依然として適用され、したがってモバイルアプリケーションと互換性があります。
このプロトコルの主な制限は、実験室での単離前の線虫の取り扱い時間に関連する。第一に、試料採取と線虫単離との間のラグタイムは、採取時に所与の試料上の線虫の発生段階を記録することを不可能にする。第二に、自然界における雄の頻度と交配頻度は 、カエノラブディティス 線虫を自殖させるための重要な進化上の疑問です10。この方法は、線虫が単離される前に何世代も経っている可能性が高いため、これらの質問に対処するのにはあまり適していません。遅延分離は、本質的に男性の頻度の直接的な証拠が不可能であることを意味します。さらに、ジェノタイピングステップ中の多世代にわたる遅延は、線虫株を配列決定する前に、アウトクロス(ヘテロ接合性)のゲノム証拠が侵食されることを意味する。自然界におけるヘテロ接合性を同定するために、自然界から直接単離された線虫によって産生される子孫をシーケンシングに使用する2。このプロトコルの別の潜在的な制限は、自己発症 性Caenorhabditisの同定に偏っていることである。これは、自走種の孤立した線虫は、受精した雌が単離された場合にのみ増殖する義務的なアウトクロッサーよりも増殖する可能性が高いためである。
この収集方法は、既存の収集プロトコル13,14に基づいています。この技術の主な進歩は、大規模な収集プロジェクトに関連する膨大な量の生態学的および分子的データの組織化を容易にするために、モバイル技術とカスタマイズされたソフトウェアの使用である。この収集プロトコルを使用して生成された生態学的データは、Caenorhabditis種の自然集団に対する未解決の問題に対処するために使用することができる。例えば、この方法で生成されたデータは、ハワイ諸島全体の種のニッチな好みを発見するために使用されてきました。さらに、凍結保存された線虫のゲノムを配列決定することにより、研究者は遺伝的変異のパターンが生態学的データとどのように相関しているかを調査することができます。この種の研究は、カエノラブディティス集団における局所適応の兆候を明らかにし、自然の文脈における遺伝的変異の関連性に関する重要な洞察を提供することができます8。Caenorhabditis線虫の多くの遺伝子の機能的理解を得るためには、生態学的研究が必要になる可能性が高い11。C. elegansでさえ、配列決定された最初の多細胞動物であり、地球上で最も徹底的に研究された動物の1つであるにもかかわらず、遺伝子の大部分は機能的注釈を欠いている。この収集プロトコルは、野生のカエノラブディティス線虫の収集とその生態と自然の遺伝的多様性の研究を促進することによって、この知識のギャップに対処するために開発されました。

過去20年間、Caenorhabditis線虫の生態学への関心が高まっています。これらの研究から、自由生活のカエノルハブディティス種は、温帯地域と熱帯地域の両方の一時的なマイクロ生息地から単離することができ、植物材料の分解に関連する微生物の花を、時にはシンパトリーで摂食することができることが分かっています1,2,3,4,5,6,7,8.また、この属では自己受精の収斂進化が3回起こっており、C. briggsae、C. elegans、およびC. tropicalisの自己生産が支配的な生殖様式であることもわかっています9,10。これらの自殖業者の中で、C. elegansは地球上で最も広く研究されている動物の1つであり、生物学の重要な進歩を遂げるために研究者によって使用されてきました。重要なことに、他の自己性Caenorhabditis種は、C. elegansの実験的利点の多くを共有しており、この属における比較研究を急速に進めている。しかし、野生におけるこれらの線虫の不可解な性質は、その生態と自然の多様性を研究することを困難にし、それは彼らの遺伝子の生物学的機能と進化が種間の遺伝的多様性を形作った方法を理解するために重要です10,11。
野生のCaenorhabditis線虫の自殖の生態学を研究するための最大の課題は、その小さなサイズです。成虫線虫は、しばしば長さが1mm以下である。この課題は、研究者が野生の基質をサンプリングし、野生の動物を観察する能力なしに実験室で目的の線虫を基質から分離しようとすることを必要とする。訓練を受けた専門家でさえ、顕微鏡下で自己化カエノラブディティス線虫を他の自由生活線虫と区別することは困難であると考えているため、線虫は通常、確立された分子バーコードを使用して配列同一性によって同定される前に基質から除去され、単離され、増殖するために放置される3,12,13,14.この方法で各線虫を処理するために必要な時間と労力は、研究者が実験室で単離された各線虫の同一性を、現場でサンプリングされた正確な基質および関連する生態学的データまでさかのぼって追跡できなければならないため、組織的な課題を提示する。ここでは、フィールドから自己組織化Caenorhabditis線虫を効率的に収集して同定し、これらの分離株を関連する空間的および生態学的データと忠実に大規模にリンクするための段階的なプロセスについて説明します。
この収集方法は、モバイルデータ収集プラットフォーム、クラウドベースのデータベース、およびRソフトウェア環境を使用して、生態学的調査の規模と精度を向上させます。Fulcrum はカスタマイズ可能なデータ収集プラットフォームであり、ほとんどのモバイル デバイスで動作し、ユーザーは位置ベースのデータを収集および整理するためのカスタム アプリケーションを構築できます (https://www.fulcrumapp.com)。このプロトコルは、カスタマイズされたデータ収集アプリケーションを使用して、現場からの空間的に明示的な生態学的データを整理し、それらのデータを実験室で単離された線虫のアイデンティティと正確にリンクさせる方法に関する詳細な指示を提供する。このプロトコルはまた、確立された分子バーコードを使用して、自己化Caenorhabditis線虫を効率的に同定する方法も説明する。これらの方法からのデータは、付属のRソフトウェアパッケージeasyFulcrum15で簡単かつ再現性よく処理して、天然のカエノラブディティス集団の生態学的および遺伝的多様性を探索することができます。

<table><tbody><tr><td>粘着ラベル</td><td>Avery</td><td>61533</td><td>CラベルとSラベルの印刷</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>トーマスサイエンティフィック</td><td>C748D75</td><td>アガロースゲル調製</td></tr><tr><td>バックパック</td><td></td><td></td><td>各チームメンバーがその日の機器、サンプル、食品、水を保持するためのバックパック。</td></tr><tr><td>段ボール箱</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>AS261</td><td>Sプレートの保管</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Neamtode lysis, SSU and ITS2 PCR</td></tr><tr><td>コレクションバッグ</td><td>ジップロック</td><td>NA</td><td>基板の収集</td></tr><tr><td>デジタル温度/湿度計</td><td>Preciva</td><td>HT-86</td><td>周囲温度と湿度の測定</td></tr><tr><td>ディスセクトスコープ</td><td>NA</td><td>NA</td><td>線虫の分離、溶解</td></tr><tr><td>使い捨てリザーバー</td><td>USA Scientific</td><td>1306-1010</td><td>PCRマスターミックスの分注と色素</td></tr><tr><td>のDNAラダーのローディング、1 KBと</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0243</td><td>SSUおよびITS2 PCR製品の可視化</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Thomas Scientific</td><td>CB4430-2</td><td>PCRマスターミックスコンポーネント</td></tr><tr><td>easyFulcrum R package</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>EDTA溶液(0.5 M pH 8.0)</td><td>http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html</td><td></td> 収集データを処理するためのRパッケージ NA <td>レシピについては補足表3を参照してください</td></tr><tr><td>エタノール(95%)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>サンプルのメッキアウト、スプーン滅菌</td></tr><tr><td>臭化エチジウム溶液(10 mg / mL)</td><td>VWR</td><td>97064-602</td><td>SSUおよびITS2 PCR製品の視覚化</td></tr><tr><td>モバイルデバイス用外部バッテリー充電器</td><td>NA</td><td></td><td>NA iPhoneまたはAndroidフラスコ用外部バッテリー充電器と充電ケーブル</td></tr><tr><td>(500mL)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB501500</td><td>アガロースゲル製剤</td></tr><tr><td>食品</td><td>NA</td><td>NA</td><td>パック</td></tr><tr><td>ゲル電気泳動装置</td><td>Thermo Scientific</td><td>B2</td><td>可視化SSUおよびITS2 PCR産物</td></tr><tr><td>ゲル電気泳動電源</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>可視化 SSUおよびITS2 PCR産物</td></tr><tr><td>ゲルローディング色素、6x</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td>可視化 SSUおよびITS2 PCR産物</td></tr><tr><td>ITS2プライマーセット</td><td>NA</td><td></td><td>NA oECA1687 = フォワードプライマー CTGCGTTACTTACCACGAATTG CARAC, oECA202 = リバースプライマー GCGGTATTTGCTACTACCAYYAM GATCTGC</td></tr><tr><td>ITS2 シーケンシングプライマー</td><td>NA</td><td>NA</td><td>oECA306 =フォワードプライマーCACTTTCAAGCAACCCGAC</td></tr><tr><td>溶解</td><td>バッファーNA</td><td>NA</td><td>線虫溶解、レシピのプロトコルを参照してください</td></tr><tr><td>マイクロ波</td><td>NA</td><td>NA</td><td>アガロースゲル調製</td></tr>モバイルデバイス<tr><td></td><td>NA</td><td>NA</td><td>機内モードで充電された電話。Fulcrum アプリの GPS 位置は、写真から抽出された GPS 位置に比べて不正確です。この設定により、消費電力が少なくなり、より正確なGPS測定が可能になります。</td></tr><tr><td>NGMAプレート、10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>Cプレート、NGMAプレートプロトコルについては、Andersen et al. 2014を参照してください。</td></tr><tr><td>NGMAプレート、3.5 cm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>5662-7102Q</td><td>Sプレート、NGMAプレートプロトコルについては、Andersen et al. 2014を参照してください。</td></tr><tr><td>非接触赤外線温度計</td><td>Etekcity</td><td>B00837ZGRY</td><td>基板温度の測定</td></tr><tr><td>ペーパータオル</td><td>NA</td><td>NA</td><td>袋詰めされたサンプル中の余分な水分を吸収するためのペーパータオル。</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-374-12</td><td>プレートシーリング</td></tr><tr><td>PCR接着剤箔</td><td>VWR</td><td>60941-126</td><td>PCR接着箔</td></tr><tr><td>PCRバッファー(10x)</td><td>トーマスサイエンティフィック</td><td>CB3702-7</td><td>PCRマスターミックスコンポーネント</td></tr><tr><td>PCRプレート(96ウェル)</td><td>トーマスサイエンティフィック</td><td>1149K04</td><td>SSUおよびITS2 PCR</td></tr><tr><td>ペンシル</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックスプーン</td><td>NA</td><td>NA</td><td>メッキアウトサンプル</td></tr><tr><td>プラチナピック</td><td>NA</td><td>NA</td><td>線虫分離、溶解</td></tr><tr><td>ラベル付きジップロック収集袋</td><td>NA</td><td></td><td>NA Cラベルバーコードがあらかじめラベル付けされたジップロックビニール袋の束。各バンドルには、輪ゴムで包まれた25個のバーコード付きバッグが含まれている必要があります。</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>シグマ</td><td>3115879001</td><td>線虫溶解、使用直前に溶解バッファーに添加</td></tr><tr><td>Rソフトウェア</td><td>NA</td><td></td><td>NA Rソフトウェア:統計計算のための言語と環境</td></tr> <tr><td>https://www.R-project.org/ ソフトクーラーバッグとアイスパック</td><td>NA</td><td>NA</td><td>周囲温度が25°Cを超えるときにサンプルを冷たく保つためのクーラーとクーラーパック。</td></tr><tr><td>予備電池</td><td>NA</td><td></td><td>NA サンプリング装置用予備電池</td></tr><tr><td>SSUプライマーセット</td><td>NA</td><td>NA</td><td>oECA1271 = フォワードプライマー TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = リバースプライマー CCTCTGACTTTTCGTTCTTGATTAA</td></tr><tr><td>ストリップチューブキャップ (12ウェル)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V29</td><td>線虫溶解</td></tr><tr><td>ストリップチューブ (12ウェル)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V31</td><td>線虫溶解</td></tr><tr><td>TAEバッファー (1x)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>SSUおよびITS2 PCR産物の可視化。レシピについては補足表3を参照してください</td></tr><tr><td>Taq ポリメラーゼ</td><td>Thomas Scientific</td><td>C775Y45</td><td>PCR マスターミックス コンポーネント</td></tr><tr><td>サーモサイクラー</td><td>NA</td><td>NA</td><td>ネアムトード溶解、SSU および ITS2 PCR</td></tr><tr><td>水</td><td>NA</td><td></td><td>NA パック それに応じて</td></tr></tbody></table>

自己 カエノールハブディティス 線虫の生態学的調査を行うための高度にスケーラブルなアプローチ

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

Caenorhabditis elegans は生物学の主要なモデル生物の1つですが、研究者はごく最近になってその自然生態学に焦点を当てています。C . elegans に関する情報の自然な文脈における相対的な希薄さは、自然界の小さな線虫の同定に伴う課題から来ている。これらの課題にもかかわらず、 C. elegans の生態学への関心の高まりは、実験室の外でのその生活に関する豊富な新しい情報を引き起こしました。自然界における C. elegans の探索の激化は、多くの新しい Caenorhabditis 種の発見に貢献し、同属線虫が野生で頻繁に共存し、腐敗した植物材料に関連する微生物の花を食べることを明らかにした。新種の同定はまた、男性と自己受精雌雄同体のアンドロディオエキアス交配系が カエノラブディティス内で独立して3回進化したことを明らかにした。他の2つの自己受容種、 C. briggsae とC. tropicalisは、 C. elegans の実験的利点を共有し、自己受精を含む重要な形質の機構的基礎への比較研究を可能にした。これらの進歩にもかかわらず、これらの重要な種の生態学と自然の多様性については、まだ多くのことが学ばれています。例えば、私たちはまだ彼らの遺伝子の多くについて機能的な情報を欠いており、それは彼らの自然生態学の理解を通してのみ達成されるかもしれません。自己発生 性Caenorhabditis 線虫の生態学的研究を促進するために、我々は野生から線虫を収集するための非常にスケーラブルな方法を開発しました。我々の方法は、モバイルデータ収集プラットフォーム、クラウドベースのデータベース、およびRソフトウェア環境を利用して、野生から線虫を収集し、関連する生態学的データを記録し、分子バーコードを使用して野生の線虫を同定する研究者の能力を強化する。

このプロトコルは、ハワイやカリフォルニアを含む複数の場所からCaenorhabditis線虫を収集するために使用されています。Caenorhabditis線虫の単離成功率は、採取場所、気候、サンプリング経験、およびサンプリングされた基質タイプによって異なります。このプロトコルは、ハワイ諸島を広範囲にサンプリングするために使用されており、そこでは9つの収集プロジェクトが複数の年と季節にわたって実施されています。自己発症性Caenorhabditis種の単離成功率は、C. briggsae (4,506サンプル中162サンプル、3.6%)とC. elegans(4,506サンプル中163サンプル、3.6%)でほぼ同じであり、C. tropicalis(4,506サンプル中26サンプル、0.58%)ではるかに低い8。自己所有種の各々は、他の基質カテゴリーと比較して腐敗した果実および花の基質上で濃縮される。研究者が基質の嗜好を特徴付けるのではなく、成功率を最大化しようとしている場合、腐った果物および花の基質をサンプリングする。ただし、成功率は、選択した基板の品質によって異なります。例えば、果物および花の基質のうち、乾燥しすぎたり、濡れたり、新鮮すぎたりする基質は、カエノラブディティス線虫を産出しない可能性が高い。
この収集プロトコルのスケーラビリティは、1組の研究者が野生から収集できるコレクションの数から明らかです。例えば、2018年10月、この収集プロトコルを使用した研究者のペアは、2つのハワイ諸島の複数の場所から7日間で合計1,000以上のサンプルを収集することができました。このフィールドチームはサンプルを一晩で実験室に出荷し、そこで8人の研究者のチームが到着時にサンプルから2,000以上の線虫を単離しました。このプロトコルの主な利点は、現場で必要な機器と人員を削減することで、遠隔地でのサンプリングに関連するコストを最小限に抑えることです。このプロトコルを使用すると、小規模なフィールドチームはサンプリングに集中でき、隔離チームは、線虫を単離するための解剖顕微鏡や寒天プレートなどの壊れやすく重い機器を使用して、自宅の施設でサンプルを処理できます。さらに、モバイルデータ収集アプリケーションの実装により、サンプルに関連付けられたすべてのフィールドデータをCラベルに直接リンクできるため、分離チームはサンプルの処理中にフィールドチームから独立して作業できます。
この収集プロトコルを使用する研究者は、収集プロジェクトの前に線虫を単離するために必要な努力を考慮する必要があります。絶縁と同定の手順はレート制限があり、小規模な収集チームはアイソレータをサンプルで迅速に圧倒することができます。さらに、多くのコレクションを処理するために必要な実験室スペースは、進行中の研究を妨げる可能性があります(図3)。さらに、いくつかの単離された線虫は、遺伝子型決定に追加の努力を必要とする。例えば、分離株の約2%は、最初の溶解試行後にSSU PCRプライマーセットで増幅できず、溶解材料がITS2プライマーセットによる増幅に適していることを確認するために再溶解する必要があります(図8)。さらに、分離株の約3%は、サンガーシーケンシングの最初のラウンド後に高品質の配列を生成できません。これらの分離株では、別の溶解ラウンド、ITS2 PCR、およびサンガーシーケンシングがしばしば必要となり、分離チームの引き渡し時間が長くなる可能性があります。重要なことに、配列同一性だけでは、新しい カエノラブディティス 種を正当化するのに十分な証拠ではない(図7)。分離株を新しい カエノラブディティス 種として飼育することを適切に正当化するためには、交配実験を行い、型指定された標本を確立するために追加の努力がなされなければならない13。型指定された標本の正式な形態学的記述も好ましいが、必須ではない3。これらの考慮事項は、この収集プロトコルを採用している研究者が、収集プロジェクトを開始する前にリソースが適切に割り当てられていることを確認するために、分離および識別手順の試験テストの恩恵を受けることを示唆しています。重要なのは、小規模な収集プロジェクトでも、プロセスの再現性が高く、ラボグループ全体の品質管理目的でデータを簡単に監査できるため、このプロトコルの恩恵を受けることができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig01.jpg"> (A)理想的な腐朽した果実が画像(1)の中央に示されているが、果実はほとんど認識できない。腐敗した果物が近くに表示されます。落ちたばかりの果物のサンプリングは避けてください(2)。(B)理想的に分解された花が上部に示されている(3)。落ちたばかりの花のサンプリングは避けてください(4)。(C)乾燥した葉の最上層の下の暗い葉のゴミは、Caenorhabditis線虫を自家採りにサンプリングするときに理想的です(5)。乾燥した葉のゴミのサンプリングは避けてください(6)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig02.jpg"> 図 2: 線虫フィールドサンプリングモバイルアプリケーション。(A) フルクラムのAppleデバイスで線虫フィールドサンプリングアプリケーションを開いた後の初期画面。右下の赤い矢印は、新しいコレクション レコードの作成に使用する [+] ボタンを指しています。(B) Apple デバイスに表示される新しいコレクションレコードの例。赤い矢印は、コレクションレコード画面の上部にある「プロジェクト」フィールドを指しています。現場でサンプリングするときは、必ず正しいプロジェクトを選択してください。project フィールドは、後続のコレクションレコードを作成するときに最後に使用されたプロジェクトにデフォルト設定されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig03.jpg"> 図3:サンプルをメッキアウトする前に整理された収集バッグと収集プレート。 この図は、左側の C ラベルの付いた収集バッグのサンプルを示しています。各コレクションバッグには、その上に一致するCラベルの10cmプレートがあります。右側には、収集バッグから移した後のサンプル材料を含む10cmの収集プレートがあります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig04.jpg"> 図4:適切に転写されたサンプルを含む収集プレート(Cプレート)。 分解する果実が入った10cmのCプレートを細菌芝生の端に置いた。Cラベルはプレート蓋に取り付けられています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig05.jpg"> 図5:線虫分離モバイルアプリケーション。 (A)Fulcrumモバイルアプリケーションのアプリケーション選択画面。赤い矢印は線 虫分離 アプリケーションを指しています。(B) Fulcrum の Apple デバイスで 線虫分離 アプリケーションを開いた後の初期画面。右下の赤い矢印は、新しい分離レコードの作成に使用する [+ ] ボタンを指しています。(C) Apple デバイスに表示される新しい分離レコードの例。赤い矢印は、分離記録画面の上部にある「プロジェクト」フィールドを指しています。分離するときは、必ず正しいプロジェクトを選択してください。project フィールドは、後続の分離レコードを作成するときに最後に使用されたプロジェクトに既定で使用されます。(D) Cラベルの下の [選択] フィールドをタップすると、ユーザーは検索ボタン(赤い矢印)をタップして、線虫を隔離しているCラベルを見つけます。(E)Cラベルを選択した後、ユーザーはデバイスのカメラを使用してCプレートを撮影します。(F)その後、ユーザーはCプレート上に線虫があるかどうかを入力します。分離する線虫がある場合、S ラベルが単離レコードに追加されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig06.jpg"> 図 6: NCBI BLASTの結果ページ。 (1)すべてのシーケンスのBLAST結果を表示するために使用するドロップダウンメニュー。(2) ドロップダウンから選択した現在のシーケンスの説明。この場合、SラベルS-05554の結果が表示されます。(3)S-05554の一番上の爆風ヒットが示されています。紫色のテキストは、この配置を視覚化するためのリンクがクリックされたことを示します。可能性のある新しい Caenorhabditis 種を特定するために、目でアライメントを検査してください、上記のステップ9.8を参照してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig07.jpg"> 図7:NCBI BLASTアラインメントの可視化例。 (A) C. kamaaina サブジェクト配列にアラインメントされた分離株のITS2クエリ配列の例。(1) アライメントの同一性パーセント (89%)で、BLASTヒット数が多いほど低い。(2) クエリとサブジェクト シーケンス (G から A) の間の不一致。(3)前記アラインメントアルゴリズムにより作製された前記被験体配列における4塩基対ギャップと、クエリまたはサブジェクトのギャップは、アライメントが不十分であることを示します。(4)多くのミスマッチやギャップのあるアライメントの中心にある一般化された領域。このような領域は、クエリシーケンスが新しい Caenorhabditis 種から来ている可能性があることを示唆しています。2017年に発見された新種 C. oiwiの実際のアライメント例が示されています。(B)分離株のITS2クエリ配列と対象配列との間の良好なアラインメントの例。(5)アラインメントの同一性パーセント(99%)は、通常、クエリ配列が対象と同じ種の単離物に由来することを意味する。(6)完全な同一性を有する整列の中心領域。このような領域は、クエリ分離がサブジェクトと同じ種である可能性が高いことを示唆しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig08.jpg"> 図 8: SSU および ITS2 PCR 産物 上のゲルは、12の代表的なサンプルに対するSSUプライマーセットを用いて生成されたPCR産物を示す。DNAはしごが参考として左側に含まれています。 カエノラブディティス 線虫のSSU PCR産物の長さは約500bpです。サンプル2〜12はSSUプライマーセットで増幅したが、サンプル1はそうしなかった。サンプル1に500bp SSUアンプリコンがないことは、溶解材料の品質が悪く、サンプルを再溶解しなければならないことを示唆しています。下のゲルは、上のゲルに示したのと同じ12サンプルのITS2プライマーセットで生成されたPCR産物を示す。はしごおよびサンプルは、両方のゲルに対して同じ配向にある。12サンプルのうち6サンプルはITS2プライマーセットで増幅しなかった。SSU および ITS2 バンドを持つサンプルはサンガー配列決定され、NCBI BLAST アルゴリズムを使用して配列類似性によって同定されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル 1: C ラベル。 2500 個の一意の C ラベルを含む PDF ファイル。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/C-labels.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル 2: S ラベル。 5000 個の一意の S ラベルを含む PDF ファイル。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/S-labels.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表 1: フィールド資料 線虫をサンプリングするために現場で使用される材料のパッキングリスト。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表 2: PCR レシピおよびサーモサイクラー条件。 ITS2 および SSU PCR の PCR レシピとサーモサイクラー条件の表です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/Supplemental_Table_2.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表3:電気泳動バッファーレシピ。 0.5 M pH 8.0 エチレンジアミン四酢酸溶液 (EDTA) および TRIS-酢酸-EDTA (TAE) 緩衝液のレシピ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/Supplemental_Table_3.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、自己発症 性Caenorhabditis 線虫の大規模な生態学的調査を実行するために使用することができる。この方法の主な利点は、自然から収集された線虫に関連する生態学的および分子的データの効率的な組織化および分析である。

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative ...

このプロトコルは、自然からのCaenorhabditis線虫の単離および同定を合理化し、線虫の自然環境に関連する重要な生態学的および環境的データを記録するために使用することができる。この手法の主な利点は、モバイルデータ収集プラットフォーム、クラウドベースのデータベース、および標準化されたデータ処理機能を活用することで可能になるスケーラビリティと精度です。まず、Caenorhabditis線虫を調査する場所を特定します。Fulcrum プロジェクトを作成するには、無償の教育契約を使用して Fulcrum のアカウントをオンラインで作成し、線虫フィールド サンプリング アプリケーションを追加します。次に、線虫分離アプリケーションを追加します。一連のQRコードラベルをCラベルとして印刷してコレクションを追跡し、Sラベルを印刷して線虫の分離を追跡します。Cラベルをジップロックのビニール袋に貼り付けて梱包します。実験室で使用するためにSラベルのセットを保管してください。Fulcrum モバイルアプリのドロップダウンメニューから線虫フィールドのサンプリングを選択し、プラスを押してプロジェクトで新しいレコードを開始します。基板の写真を撮ります。Cラベルフィールドをタップし、スキャンを選択します。モバイルデバイスのカメラを使用してコレクションバッグのバーコードをスキャンし、[完了] をタップします。基板フィールドをタップし、基板タイプを選択します。非接触温度計を用いて基板の表面温度を測定し、その値を基板温度フィールドに記録する。また、周囲の温度と湿度を測定して記録します。画面左上の[保存]をタップして、フルクラムで保存して記録します。収集袋を手袋として反転させて、スティックやその他の硬い破片なしで大さじ1杯の基板を集めて基板を拾い上げ、袋を密封します。各ジップロックバッグについて、バッグのCラベルを書き留め、OP50細菌が付着した10センチメートルのプレートの蓋に一致するCラベルを貼り付けます。各収集袋からサンプル大さじ1杯を清潔なプラスチックスプーンを使用してCプレートに移します。Fulcrum アプリケーションで、アプリケーションメニューから線虫分離を選択します。次に、右下のプラスアイコンをタップして、新しい分離レコードを作成します。選択ボタンをタップすると、サンプルに関連付けられているCラベルが検索されます。検索アイコンをタップします。次に、スキャンアイコンをタップしてCラベルQRコードをスキャンします。解剖顕微鏡でCプレート上の線虫を探します。サンプルフィールド上のワームをタップして、サンプル上の線虫の存在を記録します。線虫が存在しない場合は、Cプレートをパラフィルムし、バイオハザードビンに処分します。線虫が存在する場合は、Cプレートから最大5つの線虫を単離し、それぞれを独自のSプレートに移す。次に、[Sラベルプレート]フィールドをタップして、この絶縁に使用するSプレートを入力します。右下のプラスをタップします。Sラベルをタップし、スキャンをクリックしてデバイスのカメラを開き、SプレートのSラベルQRコードをスキャンします。隔離記録にすべての情報が正しく追加されたら、右上の保存ボタンをタップしてから、孤立した線虫でSプレートをパラフィルムし、線虫のSプレートを保持するように指定された領域に脇に置いておきます。Fulcrum Web サイトにサインインし、線虫分離アプリケーションを選択します。エクスポーターをクリックして、線虫分離s_labeled_platesを含むzipファイルをダウンロードします。csv ファイル。野生の分離ジェノタイピングテンプレートGoogleシートに移動し、Googleスプレッドシートをコピーします。線虫分離s_labeled_platesからコピーしたSラベルを配置します。csv 列をジェノタイピングシートに挿入します。隔離後48時間でSプレート上で増殖している動物を確認します。Sプレートに増殖動物がいる場合は、ジェノタイピングシートの増殖48列に1つを入力し、Sプレートを48時間増殖ボックス1とラベル付けされたボックスに移動します。単離後48時間で増殖しなかったSプレートを、単離後168時間で再度確認してください。現在 S プレートが増殖している場合は、ジェノタイピング シートの [増殖 168] 列に 1 つを入力し、S プレートを 168 時間増殖ボックス 1 というラベルの付いたボックスに移動します。Google スプレッドシートで遺伝子型をフィルタリングして、溶解する 1 つの増殖ボックスに S ラベルのみを含め、溶解ノードを介して列 S-ラベルを選択します。溶解する増殖ボックスごとに溶解ワークシートを印刷します。溶解するサンプル用に12ウェルストリップチューブを準備します。1本のストリップチューブのキャップを外し、繰り返しピペッターで各キャップに8マイクロリットルの溶解バッファーを追加します。ソースプレートから3〜5匹の動物を溶解ワークシートに示されたキャップ位置に選びます。最大8本のストリップチューブについて繰り返し、ストリップチューブをマイナス80°Cの冷凍庫に入れます。ストリップチューブのセットを取り出し、サーモサイクラーで溶解プログラムを実行します。その後、溶解物を摂氏マイナス80度で最大1週間保管する。マイナス80°Cの冷凍庫からストリップチューブを取り出し、溶解材料を氷上で解凍する。溶解材料が融解している間に、ITS2およびSSUマスターミックスを氷上の別々のチューブで調製する。2マイクロリットルの溶解液を、少量のマルチチャンネルピペットでPCRプレート内の適切なウェルに加えます。適切なサーモサイクラープログラムでPCRを実行し、どのSラベルがITS2またはSSU PCR産物をジェノタイピングシートに生成するかを記録します。ITS2 陽性の各サンプルについて、残りの ITS2 PCR 産物をサンガーシーケンシングに使用し、シーケンシングプラットフォームから各 S-Label の seq 出力ファイルを取得します。ウェブブラウザでNBCI BLASTのウェブサイトに移動して、BLAST検索を開始します。Caenorhabditis種にBLASTするSプレート配列の場合、種ID列にBLASTがヒットした上位の属名と種名を入力します。Caenorhabditis命名規則に従って、株に一意の名前を付け、株名列に株名を入力します。データを処理するには、フルクラム Web サイトに移動し、フルクラム データベースから生のプロジェクト データをエクスポートします。新しい R スクリプトを開き、イージーフルクラム ビネットの指示に従ってコレクション データを処理します。NBCI BLASTでは、SレーベルS-05554の結果は、トップヒットがCaenorhabditisブリッグサエであることを示しています。さらに、いくつかの単離された線虫は、遺伝子型決定に追加の努力を必要とする。例えば、分離株の約 2% は、最初の溶解試行後に SSU PCR プライマーセットで増幅できず、溶解材料が ITS2 プライマーセットによる増幅に適していることを確認するために再依存する必要があります。この手順に従って、研究者は野生の線虫分離株に関連する生態学的および環境的データを探索して、特定の線虫種を保有する可能性が最も高い場所および基質特性を特定することができる。

a-highly-scalable-approach-to-perform-ecological-surveys-selfing

Research

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