微小解剖マウス脈絡叢からの免疫細胞の単離と特性評価
2022年2月3日
この研究は、単離された灌流マウスの脳脈絡叢に対するフローサイトメトリーおよび2つの異なるゲーティング戦略を使用する。このプロトコルは、この脳構造に移入する主要な免疫細胞サブセットを識別します。
このプロトコルは、マウスモデルにおける様々な文脈における脳の調節における脈絡叢および末梢免疫細胞の役割に関する疑問に対処するのに有用であり得る。このプロトコルは、マウスの脈絡膜叢におけるユニークな免疫細胞集団の詳細な定量的および定性的な分析を可能にする。脈絡叢の解剖は、その小さなサイズと透明な色のために、最初は難しいことがあります。
最初に灌流されていない動物で練習することをお勧めします。まず、C57ブラック6匹のマウス背側から解剖した脳をペトリ皿に上向きに置き、皿を両眼ループの目的の下に置きます。鉗子を使用して脳を所定の位置に保ちながら、別の一対の鉗子の両端を半球間の正中線を通して挿入します。
鉗子を使用して、脳梁と海馬のある皮質を中隔から引き離し、側脳室と第3心室の一部を露出させます。側脈絡叢を、側心室を裏打ちし、両端でフレアリングする長いベールとして識別する。次に、薄い鉗子の両端を用いて、側方脈絡叢を採取する。
海馬の後襞に隠れている三角形の後部を集めるように注意してください。次に、対側半球の脳梁と海馬のある皮質を中隔から引き離し、第3心室全体と反対側の外側心室を露出させます。微細な鉗子を用いて、粒状の表面アスペクトを有する短い構造として同定された第3の脈絡叢を収集する。
次に、他の側索叢を集める。次に、鉗子の両端を小脳と中脳の間に挿入し、小脳をポンと髄質から切り離して第4心室を露出させます。次に、第4の脈絡叢を、小脳と髄質の間の側方右端から左端に第4心室を並ぶ顆粒状表面側面を有する長い球状構造として同定する。
微細な鉗子を用いて、第4の脈絡叢を採取する。採取した全ての脈絡叢をコラゲナーゼIVと共にインキュベートした後、約10回程度ピペットを上下に穏やかにピペットし、解離を確定させた。次いで、チューブをMACS緩衝液で1.5ミリリットルに充填し、コラゲナーゼIV活性を停止させた。
次に、細胞を遠心分離し、上清を捨ててから、細胞を1.5ミリリットルのMACS緩衝液で洗浄する。適切な補償ビーズおよび抗体溶液を加えた後、サンプルを氷上で30〜45分間インキュベートし、光曝露から保護する。次に、チューブに1.5ミリリットルのMACSバッファーを充填し、細胞と補償ビーズを遠心分離します。
細胞および補償ビーズを500マイクロリットルのMACS緩衝液に再懸濁した後、70ミクロンのストレーナーを通して細胞を濾過する。フローサイトメーターとソフトウェアの電源を入れた後、サイズに基づいて前方散乱領域と側方散乱領域とゲートセルを選択します。次に、前方散乱面積対前方散乱高さを持つ単一セルのドーターゲートを作成します。
次に、DAPI陽性細胞を除外するために、DAPI対前方散乱領域を有する生細胞用のドーターゲートを作成する。次に、CD45対前方散乱領域を有するCD45陽性免疫細胞のための娘ゲートを作成する。次に、CD45陽性細胞からドーターゲートを作成し、F480対CD11bを選択して、CD11b陽性F480陽性およびCD11b陽性F480陰性集団を同定する。
次に、CD11b陽性F480陽性細胞のドーターゲートを作成し、CX3CR1対IA-IEを選択して、CX3CR1陽性IA-IE陽性境界関連マクロファージおよびCX3CR1陽性IA-IE陰性マクロファージの両方を同定した。次に、CD11b陽性F480陽性CX3CR1陽性IA-IE陰性マクロファージのドーターゲートを作成し、F480対CD11bを選択して、CD11b陽性F480中間CX3CR1陽性IA-IE陰性コルマーエピプレクサスマクロファージおよびCD11b陽性F480高CX3CR1陽性IA-IE陰性境界関連マクロファージの両方を同定する。次いでCD11b陽性F480陰性集団から、Ly6C対IA−IEのゲートを得た。
主に単球または好中球に対応するIA−IE陽性Ly6C陰性集団およびIA−IE陰性Ly6C陽性細胞の両方を選択する。最後に、CD11b陽性F480陰性IA-IE陽性Ly6C陰性集団のドーターゲートを作成し、CD11b対CX3CR1を選択します。次に、CD11b高CX3CR1低およびCD11b陽性CX3CR1陰性集団の両方を同定する。
T細胞ゲーティングの場合、前述のようにDAPI陽性細胞を除外した後、CD45対FSC-Aを有するCD45陽性免疫細胞のドーターゲートを作成し、次いでCD45陽性細胞からドーターゲートを作成し、TCRベータ対CD11bを選択する。最後に、TCRベータ陽性CD11b陰性集団のドーターゲートを作成し、CD4対CD8aを選択する。
CD8陰性およびCD4陽性T細胞ならびにCD8陽性CD4陰性T細胞の両方を同定する。ここで実証されたフローサイトメトリー分析は、骨髄系およびT細胞の主要なサブセットと、マウス1匹あたりのそれらの相対的な総数を再現性の高い方法で明らかにすることに成功しました。骨髄系細胞のフローサイトメトリー分析は、脈絡叢がCD11b陽性CX3CR1陽性F480高境界関連マクロファージによって移入され、脈絡叢におけるCD45陽性免疫細胞の80%を表すことを示す。
コルマーエピプレクサスマクロファージのCD11b高F480中間体CX3CR1陽性IA−IE陰性集団も同定された。CD11b陽性F480陰性免疫細胞のうち、Ly6C陰性IA−IE陽性細胞の2つの異なる集団が特徴付けられ、樹状細胞に対応する可能性が高い。T細胞の分析およびゲーティング戦略は、CD45陽性CD11b陰性TCRベータ陽性細胞の少数集団の存在を強調した。
このうち、マウス1匹あたり約30~50個のCD8陰性CD4陽性およびCD8陽性CD4陰性T細胞が生理的条件下で脈絡叢に移入した。血液汚染は脈絡叢の免疫組成をぼやけさせる可能性があるため、灌流の質を制御することが重要です。この方法に続いて、バルクまたは単一細胞RNAシーケンシングなどのさらなる分析のために、選択された細胞集団をソートすることができる。
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概要
本研究では、フローサイトメトリーを用いて、灌流後のマウス脳の脈絡叢における免疫細胞集団を調査します。包括的なゲーティング戦略を採用することで、この脳構造における主要な免疫細胞サブセットを特定し、脳の調節におけるそれらの役割についての理解を深めます。
研究の主要構成要素
研究分野
- 中枢神経系における免疫細胞解析
- 脈絡叢の機能
- マウスモデル
背景
- 脈絡叢は、脳のホメオスタシスに関与する重要な構造です。
- 脈絡叢細胞はサイズが小さく透明であるため、単離および解析に困難が伴います。
- 本研究では、脈絡叢における免疫細胞の同定に取り組んでいます。
使用方法
- 細胞集団解析のためのフローサイトメトリー
- モデルシステムとしてのマウス脳の単離灌流
- 免疫細胞サブセット定量をためのゲーティング戦略
主要な結果
- 脈絡叢内にマクロファージおよびT細胞の有意な集団が存在することを明らかにした。
- CD11b陽性マクロファージを含む、主要な免疫細胞サブセットを特性化した。
- マウス間におけるフローサイトメトリー結果の再現性を実証した。
結論
- 本プロトコルは、脈絡叢の免疫学的概況に関する知見を提供します。
- 得られた知見により、免疫細胞が脳機能にどのように影響を及ぼすかについての理解が深まります。
よくある質問
業界における実用的な関連性
マウス脈絡叢から免疫細胞を定量的に単離および特性解析することで、末梢から脳への免疫学的コミュニケーションを精密に解析することが可能になります。このワークフローは、中枢神経系（CNS）疾患に関与する神経免疫経路のメカニズム解明によるリスク低減およびターゲットバリデーションを支援します。本プロトコルの再現性と細胞サブセットの解像度は、トランスレーショナルなバイオマーカーの探索および前臨床モデルの精緻化のための基盤となります。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 脳免疫インターフェースにおける免疫細胞の不均一性の詳細なマッピングを可能にします。
- 特定の細胞集団を定量化することで、神経免疫ターゲットの機能的検証をサポートします。
- 免疫細胞の役割を明確にすることで、CNS創薬におけるメカニズム的なリスク低減を促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ダウンストリームアッセイに向けた免疫細胞懸濁液の標準化された調製方法を提供します。
- 定量的な免疫プロファイリングのための再現性のあるフローサイトメトリーゲーティング戦略を提供します。
- 実験条件間における免疫細胞サブセットの堅牢な比較を可能にします。
トランスレーショナル＆前臨床研究
- 免疫細胞の特性解析を、疾患に関連するCNSモデルに適合させます。
- トランスクリプトーム解析のための細胞ソートを可能にすることで、発見から前臨床検証までの継続性をサポートします。
- 神経免疫調節戦略における予測の信頼性を向上させます。
パイプラインおよびワークフローの統合
本プロトコルは、CNSモデルにおける免疫細胞プロファイリング、ターゲット検証、およびダウンストリームの分子解析を可能にすることで、創薬から前臨床に至る一連のプロセスへと統合されます。
- 発見生物学：脈絡叢細胞を介した脳機能の免疫調節に関する仮説検証を支援します。
- スクリーニング：再現性のある定量的出力を得るために、免疫細胞の分離およびフローサイトメトリーのゲーティングを標準化します。
- 分析：比較分析のための細胞サブセットの計数およびゲーティングデータを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：トランスクリプトーム解析または機能研究に向けた、定義済み免疫細胞集団のソーティングを可能にします。
- エンタープライズ再利用：CNS（中枢神経系）に特化した研究開発における、免疫細胞特性解析のための再利用可能なワークフローを確立します。
運用およびエンタープライズへの影響
- 科学的価値：神経免疫標的の選択および検証における予測信頼性を向上させる。
- 運用上の価値：研究全体を通じて、標準化され再現可能な免疫細胞プロファイリングを実現する。
- 戦略的価値：メカニズムの曖昧さを軽減し、CNSプログラムにおけるリスク調整後のポートフォリオ決定を支援する。
- ポートフォリオへの影響：定量的な細胞サブセットデータに基づいた神経免疫標的の優先順位付けを可能にする。
実施上の注意点
- マウス脳の解剖およびフローサイトメトリーのゲーティング戦略に関する専門知識が必要です。
- 高パラメータフローサイトメトリーおよびセルソーティングの設備を利用できる環境が必要です。
- 血液混入を避けるため、厳格な灌流およびサンプルハンドリングが求められます。
- 研究間での比較可能性を確保するためには、ゲーティングと抗体パネルの標準化が不可欠です。
- マウスの系統や疾患モデルに応じて、最適化が必要になる場合があります。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Dissection of the Choroid Plexus from the Brain
2:47
Preparation of Samples for Flow Cytometry Analysis
3:52
Choroid Plexus Myeloid Cells Gating
6:46
Choroid Plexus T Cells Gating
7:44
Results: Myeloid and T Cells Gating Strategy to Identify Choroid Plexus Immune Subsets
9:24
Conclusion
