Name: 電界効果バイオセンシング技術を用いた分子シャペロンHsp90とそのクライアントプロテインキナーゼCdc37との生体分子相互作用の探索 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 探索する電界効果バイオセンシング技術を用いたHsp90とCdc37のタンパク質相互作用。ラベルフリーで高速・正確な測定により、創薬研究や生体分子解析に応用可能な手法を学ぶ。

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この研究は、バイナショナル科学財団(BSF)からS.K.S.とN.Q.への助成金によって支援されました。

注:本研究で用いた組換えタンパク質Hsp90およびCdc37は、商業的に入手した( 材料表を参照)。
1. チップの起動
注:実験で使用するすべての材料は、 材料表にリストされています。調製したすべての溶液を滅菌0.2μmフィルターでろ過します。
<ol><li>15 mLチューブ中の1 M 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)緩衝液(pH=6.0)に2 mgのEDCを加えて、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)溶液を調製する。別の 15 mL チューブ内の 2.5 mL の 1 M MES バッファー (pH = 6.0) に 6 mg のスルホ NHS を加えて、N-ヒドロキシスルホスクシンイミド (スルホ-NHS) 溶液を調製します。各溶液の 50 μL を独立したチューブにアリコートし、将来の使用のために -20 °C で保存します。</li>
	<li>等量のEDCサンドスルホNHS溶液(50 μLのEDC + 50 μLのスルホ-NHS)を上下にピペッティングして混合します(渦を巻かないでください)。 注:EDC/スルホ-NHSの混合溶液は、適切なチップ機能化のための効果的な架橋を維持するために、30分以内に使用する必要があります。</li>
	<li>同社から提供されたバイオセンサーチップ(5.7 cm x 2.4 cm、 材料表を参照)を、蓋が取り付けられたガラス製のペトリ皿に入れます。チップの活性化に関連するすべての機能化ステップは、ペトリ皿内で行われることが示唆される。バイオセンサーチップに50 μLの1 M MESバッファー(pH = 6.0)を塗布し、室温で1分間インキュベートしてからバッファーを吸引します。</li>
	<li>50 μL の EDC/スルホ-NHS 溶液をセンサーチップに直ちに塗布します。シャーレを覆い、室温で 15 分間インキュベートします。チップから EDC/スルホ-NHS 溶液を吸引します。</li>
	<li>チップを50 μLの1 M MESバッファー(pH = 6.0)で1回すすいでください。MES バッファーを吸引します。</li>
</ol>2. 標的タンパク質固定化
<ol><li>チップを50 μLの1x PBS(pH = 7.4)で2xすすぎます。チップからPBSを吸引し、標的分子Hsp90(50 μL; 500 nM)を加える。 注: バッファの不一致は、実験全体を台無しにする可能性があります。したがって、実験の前に、標的分子が較正に使用されたものと同じ緩衝液(例えば、1x PBS(pH = 7.4))中にあることを確認することが重要です。必要に応じて、実験前に一晩透析してバッファー交換を行う。この実験では、組換えタンパク質Hsp90およびCdc37の両方について、1x PBS(pH = 7.4; 材料表を参照)に対して、4°Cで適切なバッファー交換を行い、一晩透析を行った。 標的物質(この場合はHsp90)の濃度は、異なる実験プロトコールおよび標的物質(タンパク質/ペプチド/リガンド)の性質に応じて変化し得る。</li>
	<li>ガラスのシャーレを覆い、室温で30分間インキュベートする。標的分子を含む溶液を吸引し、50 μLの1x PBS(pH = 7.4)で3xをすすいでください。チップから1x PBS(pH = 7.4)溶液を吸引します。</li>
	<li>50 μL のクエンチ 1 (1x PBS (pH = 7.4) 中の 3.9 mM アミノ-PEG5-アルコール) 溶液をチップに加えます。ガラスシャーレを覆い、室温で 15 分間インキュベートします。チップからクエンチ1溶液を吸引する。</li>
	<li>50 μLのクエンチ2(1 Mエタノールアミン(pH=8.5))溶液をチップに加える。ガラスのシャーレを覆い、室温で15分間インキュベートする。チップからクエンチ2溶液を吸引し、50μLの1x PBSを使用してチップ5xをすすぎ、最後のPBS液滴をセンサーに残します。</li>
</ol>3. 検体サンプルの調製
<ol><li>所望の濃度範囲のCdc37の分析物希釈シリーズを調製する。最初の実験では、25 nM、50 nM、100 nM、200 nM、400 nM、800 nM、1,000 nM、2,000 nM、3,000 nM、および 5,000 nM の濃度を使用しました。2番目の実験では、0.4nM〜200nMの範囲の異なる濃度セットを使用した。</li>
	<li>信頼できるKD値を得るために、少なくとも8つの異なる分析物濃度を含むように実験を設計し ます。検体タンパク質の異なる希釈物を、較正に使用したものと同じ緩衝液中に調製し、標的タンパク質;ここでは1x PBS(pH = 7.4)です。</li>
</ol>4. FEBデバイスへの活性化バイオセンサーチップのロード
メモ:FEBデバイスは、LEDライト表示を備えたリーダーと、バイオセンサーチップを挿入するためのカートリッジで構成されています。
<ol><li>標的タンパク質固定化後、活性化チップをUSB 経由で コンピュータに接続するデバイスのカートリッジに挿入します。チップの挿入後、緑色のLEDライトがリーダーに表示され、FEBデバイスが実験の準備ができていることを示します。FEBデバイスが接続されているコンピュータに、同社が提供する自動ソフトウェア( 材料表を参照)をインストールし、以下のように実験を段階的に監視します。</li>
</ol>5. 実験を実行する
<ol><li>自動ソフトウェアの [実験の実行] モジュールを押し、再生またはその他の任意のプロトコル で 10 ポイント を選択します。次の詳細を入力します:オペレータ名、実験名、日付(例:Yana、Hsp90 + Cdc37、14.03.2021)。再生バッファ(例えば、PBSバッファ);固定化された標的(例えば、Hsp90);溶液中の分析物(例えば、Cdc37)。詳細については 、補足図 S1 を参照してください。</li>
	<li>ソフトウェアに表示される [実験の開始] ボタンを押し、以下で説明するように、自動ソフトウェアによって示される指示に従います。 注:ソフトウェアは完全に自動化され、ユーザーフレンドリーで、実験を段階的にガイドします。ポップアップウィンドウが画面に表示され、実験の各ステップでさらに進むように指示されます。ソフトウェアは、実験全体を通して、各分析物濃度の較正、分析物の関連付け、解離、再生、および洗浄(5倍)から連続して、各反復ステップの指示を提供します。</li>
	<li>機器のキャリブレーションを実行します。これを行うには、チップから残りのPBS溶液を吸引し、50 μLのキャリブレーションバッファー(1x PBS、pH = 7.4)を塗布します。 続行 ボタンを押し、キャリブレーションステップが完了するまで5分間待ちます。ソフトウェアは、キャリブレーションステップ(5分)用に決定されたエンドポイントを、フォローアップするための警告アラームとともに表示します。</li>
	<li>次に、検体会合を行う。これを行うには、チップから校正バッファーを吸引し、最低分析物濃度(25 nM の Cdc37)を 50 μL 塗布します。 [続行] ボタンを押し、関連付けの手順が完了するまで 5 分間待ちます。ソフトウェアは、アソシエーション・ステップ(5分)のエンドポイントを表示し、続行する警告アラームを表示します。</li>
	<li>分析物の解離を行う。これを行うには、チップから分析物溶液を吸引し、50 μLの解離バッファー(1x PBS、pH = 7.4)を塗布します。 [続行] ボタンを押し、解離ステップの継続時間(5分)が終了するまで5分間待ちます。ソフトウェアは、解離ステップ(5分)のエンドポイントを警告アラームとともに表示し、フォローアップします。</li>
	<li>次に、チップ再生を行います。解離溶液をチップから吸引し、50 μLの再生バッファー(1x PBS、pH = 7.4)を塗布します。 [続行] ボタンを押し、再生ステップの継続時間(30秒)が終了するまで30秒間待ちます。ソフトウェアは、再生ステップ(30秒)のエンドポイントを、フォローアップするための警告アラームとともに表示します。</li>
	<li>最後に、チップを洗う。再生溶液をチップから吸引し、50 μLの洗浄バッファー(1x PBS、pH = 7.4)をチップに塗布します。チップから溶液を吸引し、これを5回繰り返します。チップ上の洗浄バッファの最後の一滴を残して 続行 ボタンを押し、ソフトウェアディスプレイで洗浄ステップの持続時間が終了するまで30秒間待ちます。 メモ: ソフトウェアは、洗浄ステップ(30秒)のエンドポイントを警告アラームとともに表示し、実験の次のサイクルに進みます。</li>
	<li>使用する各分析物濃度について手順を繰り返します。較正、分析物の会合、解離、再生、および洗浄の5つのステップ(5x)は、1サイクルを構成する。ここに示す実験では、10の分析物濃度(25nM~5,000nMまたは0.4nM~200nMの範囲; 図2)。</li>
</ol>6. 分析
<ol><li>実験終了時に自動 解析 ソフトウェアの上部にある解析ボタンを押します。すべての実験ポイントを含む表示ウィンドウが表示されます。ウィンドウで、所定のプロトコルに使用される分析物濃度が正しいことを確認します。</li>
	<li>[解析の実行] ボタンを押して、KD 値を自動的に生成します。ソフトウェアは、平衡時の解離定数KD値が計算される対応するI-応答に対して分析物濃度をプロットすることによってヒルフィットプロットを生成します。</li>
	<li>生データを他の統計解析ソフトでエクスポートするには、下記のデータレビュー/エクスポートソフトを使用します。<ol>
<li>実験の終了時に自動的に作成されたR1Rファイル(Hsp90 + Cdc37 14.03.2021など)をデスクトップ上の新しいフォルダにコピーします。会社が提供する データレビュー/エクスポート ソフトウェアを開きます( 補足図S2Aを参照)。</li>
		<li>[データ処理>プロセスR1Rファイル]をクリック>、データレビュー/エクスポートソフトウェアのホーム画面で[OK]をクリックします。</li>
		<li>手順6.3.1でデスクトップ上に作成したR1Rファイルを含むフォルダを選択します。 をクリックし、OK ボタンを押します。これにより、元のR1Rデータのコピーが作成され、元のファイルを上書きせずにデータを確認および編集できます。</li>
		<li>データレビュー/エクスポートソフトウェアのホーム画面に表示されるデータ処理アイコンを押します。 OKに「処理済みR1Rファイルのロード」>押します。手順6.3.1で作成した、処理済みのR1Rファイルを含む同じフォルダを選択します。 OKを押します。この手順では、実験ファイルを含むフォルダーを確認する準備が整います。</li>
		<li>データレビュー/エクスポートソフトウェアのホーム画面で、 データ分析を押します。 「キャリブレーション>編集したR1Rファイルのキャリブレーション」>「OK 」を選択します( 補足図S2Bを参照)。このステップは、第1のキャリブレーションステップに従って全てのデータポイントを較正し、ベースラインを作成する。</li>
		<li>データレビュー/エクスポートソフトウェアのホーム画面で、 データ分析を押します。[ R1Rファイルの確認と編集]>[OK]を選択します。データ ポイントの確認、ポイントの削除、または [ステップの追加 /追加] ボタンを使用したステップの追加を行います 。キャリブレーションステップがベースライン上にある、アソシエーションステップがピークにあるなど、すべてのステップが正しい場所にあることを確認し( 補足図S3を参照)、 保存 ボタンを押してすべての変更を保存します。</li>
		<li>データレビュー/エクスポートソフトウェアのホーム画面で、 データ分析を押します。 [データの分析/プロット]を選択し、エクスポートするステップを選択します( 補足図S4を参照)。データをエクスポートする前に、キャリブレーションステップ(ステップ1、ステップ6など)を減算した後、各関連付けステップ(ステップ2、ステップ7など)をエクスポートリストに追加します。</li>
		<li>[このデータのエクスポート] を押します。ソフトウェアは、各トランジスタからの各分析物濃度データポイントのI応答を含むスプレッドシートファイルを生成します(すべてのトランジスタが動作している場合、各濃度ポイントに対して3つの異なるI応答値が得られます)。このスプレッドシートファイルを使用して、統計ソフトウェアでデータをさらに分析します。</li>
	</ol></li>
	<li>統計解析ソフトウェアを開きます。3 つの Y 値を持つ XY 表を作成します。 [作成] を押します。この表のデータ (X、Y 値) は、ステップ 6.3.8 で作成したスプレッドシート・ファイルからコピーされます。x軸は分析物濃度(使用した濃度に応じて)に対応し、3つのY値は同社が提供する データレビュー/エクスポート ソフトウェアから取得したI-Responsesに対応します。</li>
	<li>[このデータの分析] を押します。1つのサイト>結合飽和度>合計>非線形回帰(カーブフィット)>XY分析を選択します。ソフトウェアは自動的にデータを分析し、KD値を生成し、データポイントのグラフを作成します。</li>
</ol>

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著者らは、金銭的またはその他の利益相反がないと宣言しています。

本研究では、Hsp90とCdc37との間の生体分子相互作用を決定するために、FEB技術(リアルタイム動態特性評価アプローチ)を使用することの実現可能性を評価した。最初の探索的実験(最初の実験)は、適切な分析物濃度の選択が実験の重要な部分であり、文献で入手可能なデータに基づいて予測されたKD 値の上下の濃度点を含めることによって実験を設計するべきであることを示唆した。
それにもかかわらず、相互作用に関する予備的な情報がない場合は、低い範囲(0.08nM、0.16nM、0.4nM、2nM)とより高い範囲(1,000nM、2,500nM、5,000nM)の両方の広い範囲の濃度点を含めることによって予備実験を設計することをお勧めします。予備実験は、 KD値の大まかな推定値を提供し、正確なKD 値を得るために適切な濃度範囲を使用して後続の実験を計画することを可能にする。FEBシステムは、実験の濃度点の数を自由に選択できる編集プロトコル機能を提供します。
私たちの経験から、...

生体分子相互作用: タンパク質は生物の不可欠な部分であり、細胞代謝、細胞構造、細胞シグナル伝達、免疫応答、細胞接着などの多数の分子経路に関与する。一部のタンパク質は独立してその機能を果たすが、ほとんどのタンパク質は結合界面を使用して他のタンパク質と相互作用し、適切な生物学的活性を調整する1。
生体分子相互作用は、主に、タンパク質表面、複合体安定性、または相互作用の持続性に基づいて、関与するタンパク質2の明確な構造的および機能的特性に基づいて分類することができる3。生体分子相互作用における必須タンパク質とその役割を同定することは、分子レベルでの生化学的メカニズムを理解するために不可欠です4。現在、これらの相互作用5を検出するための様々なアプローチがある:インビトロ6、インシリコ7、生細胞8、エキソビボ9、およびインビボ10において、それぞれ独自の長所および短所を有する。
インビボアッセイは、実験ツール11として全動物を用いて行われ、theエキソビボアッセイは、自然条件下で最小限の変化を提供することによって、制御された外部環境において組織抽出物または全器官(例えば、心臓、脳、肝臓)に対して行われる。in vivoおよびex vivo研究の最も一般的な用途は、潜在的な薬理学的薬剤の全体的な安全性および有効性を確保することによって、ヒト試験前に潜在的な薬理学的薬剤の薬物動態、薬力学、および毒性効果を評価することである12。
生体分子相互作用は、生細胞内でも検出することができる。生細胞をイメージングすることで、特定の生化学的経路13の反応を実行する際の動的相互作用を観察することができます。さらに、生物発光または蛍光共鳴エネルギー移動などの検出技術は、これらの相互作用が細胞14内でどこでいつ起こるかについての情報を提供することができる。生細胞での検出は重要な詳細を提供しますが、これらの検出方法は光学と標識に依存しており、ネイティブの生物学を反映していない可能性があります。また、 in vitro 法よりも制御が弱く、15を実行するには専門的な専門知識が必要です。
インシリコ計算法は、主にin vitro実験前の標的分子の大規模スクリーニングに使用されます。計算予測方法、コンピュータベースのデータベース、分子ドッキング、定量的構造活性関係、および他の分子動力学シミュレーションアプローチは、十分に確立されたインシリコツール16の1つである。面倒な実験手法と比較して、in silicoツールは高感度で簡単に予測を行うことができますが、予測性能の精度は低下します17。
インビトロ アッセイは、標準的な生物学的文脈の外側の微生物または生体分子を用いて行われる。 in vitro 法による生体分子相互作用の描写は、タンパク質の機能と細胞機能の複雑なネットワークの背後にある生物学を理解するために不可欠です。好ましいアッセイ方法論は、タンパク質の固有の特性、速度論的値、ならびに相互作用の様式および強度に従って選択される18、19。
Hsp90/Cdc37 の相互作用: Hsp90とCdc37をつなぐシャペロンキナーゼ経路は、腫瘍生物学20において有望な治療標的である。Hsp90は、細胞周期制御、タンパク質集合、細胞生存、およびシグナル伝達経路において中心的な役割を果たす。Hsp90に依存しているタンパク質は、Cdc37などのコシャペロンを介して複合体形成のためにHsp90に送達されます。Hsp90/Cdc37複合体は、ほとんどのプロテインキナーゼのフォールディングを制御し、多数の細胞内シグナル伝達ネットワーク21のハブとして機能する。これは、急性骨髄芽球性白血病、多発性骨髄腫、および肝細胞癌を含む様々な悪性腫瘍におけるその上昇のために有望な抗腫瘍標的である22,23。
一般的に使用される インビトロ 生体分子相互作用検出技術 共免疫沈降法(co−IP)は、生物学的に関連する相互作用を同定するために抗原抗体特異性に依存する技術である24。この方法の主な欠点は、低親和性相互作用および動力学的値24を検出できないことである。等温滴定熱量測定(ITC)、表面プラズモン共鳴(SPR)、生体層干渉法(BLI)、FEB技術などの生物物理学的方法が、速度論的値を決定するために好ましい。
ITCは、生体分子相互作用を特徴付けるための完全な熱力学分析とともに結合エネルギーの決定に基づく生物物理学的検出方法である25。ITCの主な利点は、標的タンパク質の標識または固定を必要としないことである。ITCが遭遇する主な困難は、1つの実験に必要な高濃度の標的タンパク質と、小さな結合エンタルピー26による非共有結合複合体の分析の困難さである。SPRおよびBLIはいずれも、センサー表面上の標的分子の固定化に依存し、続いて固定化標的27、28に対する分析物のその後の注入に依存する標識のない生物物理学的技術である。SPRでは、生体分子相互作用中の屈折率の変化が測定される27;BLIでは、反射光の干渉は、時間28の関数として波長の変化としてリアルタイムで記録される。SPRとBLIはどちらも、高い特異性、感度、検出機能を提供するという共通の利点を共有しています29。両方の方法において、標的タンパク質はバイオセンサ表面に固定化されており、したがって、標的の天然の立体構造がいくらか失われる可能性があり、これは特異的相互作用と非特異的相互作用を区別することを困難にする30。BLIは、標的を固定化するために高価な使い捨て光ファイバーバイオセンサを使用するので、コストのかかる技術31である。これらの十分に確立された生体分子検出ツールと比較して、FEB技術は、動力学的特性評価を伴うリアルタイムでの生体分子検出に低ナノモル濃度を使用することにより、信頼性が高くラベルフリーのプラットフォームを提供します。FEB技術は、ITCが直面するバブリングの課題も克服し、SPRやBLIと比較して費用対効果が高くなります。
電界効果トランジスタ(FET)ベースのバイオセンサは、さまざまな生物医学的アプリケーションを提供することにより、生体分子相互作用を検出するための新しい分野です。FETシステムでは、ターゲットはバイオセンサチップに固定化され、相互作用はコンダクタンス32の変化によって検出される。効率的な電子バイオセンサの開発において考慮されるべきユニークな特徴は、センサ表面33を作製するために使用されるコーティング材料の半導電性の性質および化学的安定性などの物理化学的特性である。FETに使用されるシリコンのような従来の材料は、トランジスタチャネルと適切に機能するために特定の環境との間に挟まれた酸化物層を必要とするため、センサの感度を制限してきた34。さらに、シリコントランジスタは高塩分環境に敏感であるため、自然環境での生物学的相互作用を測定することは困難です。グラフェンベースのバイオセンサは、優れた化学的安定性と電場を提供するため、代替品として提示されています。グラフェンは炭素の単一原子層であるため、半導体として非常に敏感であり、生物学的溶液と化学的に互換性があります。これらの品質の両方が、互換性のある電子バイオセンサ35を生成するのに望ましい。グラフェンコーティングされたバイオセンサによって提供される生体分子の顕著な超高負荷ポテンシャルは、グラフェンベースのバイオセンサFEB技術の開発につながる。
FEB技術の原理:FEBは、結合標的が固定化されているグラフェンバイオセンサを通る電流を測定するラベルフリーの生体分子検出技術です。固定化タンパク質と分析物との間の相互作用は、リアルタイムでモニターされる電流の変化をもたらし、正確な動態測定を可能にする36。
計装:FEBシステムは、グラフェン電界効果トランジスタ(gFET)センサーチップと、実験全体を通して一定の電圧を印加する電子リーダで構成されています(図1)。検体は、バイオセンサ表面に固定化された標的タンパク質に溶液中で塗布される。相互作用が発生すると、電流の変化が測定され、リアルタイムで記録されます。分析物濃度が増加するにつれて、結合した分析物の割合も増加し、電流のより高い交替を引き起こします。装置に付属の自動分析ソフトウェア(材料表)を使用して、I-Responseはバイオセンシングユニット(BU)37の観点から測定および記録されます。I-Responseは、固定化ターゲットと分析物との相互作用時にリアルタイムで測定されるバイオセンサーチップを通る電流(I)の変化として定義されます。FEB自動解析ソフトウェアは、C応答が静電容量(C)の変化を記録する動的相互作用イベントに対するI応答とC応答の両方を解析できます。I-ResponseとC-Responseの両方の変動は、結合した分析物のフラクションに直接対応し、さらに分析してKD 値を生成することができます。自動分析ソフトウェアのデフォルトの設定はI-Responseです。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63495/63495fig01.jpg"> 図1:実験セットアップの概要 (A)グラフェンベースのチップと電子リーダ。(B)チップ部品の概要。チップは、システムに電流を供給する2つの電極に取り付けられています。チップの表面はグラフェンで覆われており、活性化されると標的を結合することができる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63495/63495fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
方法論： 最初に、活性化バイオセンサーチップをFEBデバイスに挿入し(図1)、その後、以下に概説する手順を実行します:(1)キャリブレーション:実験は、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH = 7.4)を使用してベースライン平衡化応答を作成するシステムキャリブレーションから始まります。(2)アソシエーション:分析物をチップに導入し、結合飽和に達するまでI-Responseを監視します。(3)解離:分析物を1x PBSを用いて解離させる。(4)再生:1x PBSを用いて検体の残骸を除去する。(5)洗浄:チップから結合および非結合の分析物を完全に除去するために、1x PBSを使用して合計5回の洗浄を行う。
解析： データ分析は、機器に付属の完全自動ソフトウェアを使用して実行されます。自動解析ソフトウェアは、KD 値を持つヒルフィットプロットを生成します。ヒルフィットプロットは、分析物濃度の関数として、分析物と標的タンパク質との関連を記述します。最大応答の半分が達成される濃度は、KD 値に比例する。低いKD 値は高い結合親和性を表し、その逆も同様である。
FEB実験で得られたデータを検証するために、データレビュー/エクスポートソフトウェアを使用して、各分析物濃度の各読み出しポイントからI-Responseを抽出し、以下で説明するように他の統計分析ソフトウェア( 材料表を参照)にエクスポートすることができます。

<table><tbody><tr><td>自動解析ソフトウェア</td><td>Agile plusソフトウェア、Cardea(Nanomed)</td><td>NA CAS番号:NA</td><td>本文中では、装置に付属の自動解析ソフトウェアと表記されています。自動解析を生成します。</td></tr><tr><td>COOH-BPU(Biosensing Processing Unit)</td><td>Agile plusソフトウェア、Cardea(Nanomed)</td><td>NA CAS番号:NA</td><td>バイオセンサーチップ</td></tr><tr><td>データレビューソフトウェア</td><td>Datalign 1.0、Cardea(Nanomed)</td><td>NA CAS番号:NA</td><td>本文中では付属のデータレビューソフトウェアと表記しています。装置に付属しており、情報データポイントを確認およびエクスポートすることができます。</td></tr><tr><td>透析バッグ</td><td>CelluSep,&nbsp;膜ろ過製品</td><td>T2-10-15 CAS番号:NA</td><td>T2チューブ(6,000-8,000 MWCO)、(10 mm fw、6.4mm&Oslash;、0.32ml / cm、15m)</td></tr><tr><td>EDC(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)</td><td>Cardea(Nanomed)</td><td>EDC160322-02 CAS番号:25952-53-8</td>白色<td>粉末</td></tr><tr><td>ITC(等温滴定型熱量測定)システム</td><td>Microcal-PEAQ-ITC(マルバーン、英国)</td><td>NA CAS番号: </td><td></td>NA</tr><tr><td>MES (2-(N-モルホリノ) エタンスルホン酸) 緩衝液</td><td>メルク</td><td>M3671-50G CAS 番号: 4432-31-9</td><td>白色粉末</td></tr><tr><td>NHS (N-ヒドロキシスルホスクシンイミド) チップ</td><td>Cardea (Nanomed)</td><td>NA CAS 番号: NA</td><td>グラフェンベースのチップ</td></tr><tr><td>PBS (リン酸緩衝生理食塩水) X 10</td><td>Bio-Lab</td><td>001623237500&nbsp; CAS番号:7758-11-4</td><td>液体透明溶液</td></tr><tr><td>ピペット</td><td>Thermo Scientific</td><td>11855231 CAS番号:NA</td><td>Finnpipette F3 5-50 & micro;L、黄色</td></tr><tr><td>クエンチ 1 (1 X PBS 中の 3.9 mM アミノ-PEG5-アルコール)</td><td>Cardea (Nanomed)</td><td>0105-001-002-001 CAS 番号: NA</td><td>液体、透明溶液</td></tr><tr><td>クエンチ 2 (1 M エタノールアミン (pH=8.5))</td><td>Cardea (Nanomed)</td><td>0105-001-003-001 CAS 番号: NA</td><td>液体、透明溶液</td></tr><tr><td>組換えタンパク質 Cdc37</td><td>Abcam</td><td>ab256157 CAS 番号: NA</td><td></td></tr><tr><td>組換えタンパク質 Hsp90 beta</td><td>Abcam</td><td>ab80033 CAS番号:NA</td><td></td></tr><tr><td>スプレッドシート</td><td>Excel、Microsoft office</td><td>NA CAS番号:NA</td><td></td></tr><tr><td>統計ソフト</td><td>GraphPad、Prism</td><td>NA CAS番号:NA</td><td>その他、統計ソフトと称する。シグマプロット、フィトンまたは他の統計プログラムはまた、</td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Cardea(Nanomed)</td><td>NHS160321-07 CAS番号:106627-54-7</td><td>白い粉</td></tr><tr><td>のヒント</td><td>アレックス赤</td><td>LC 1093-800-000 CAS番号:NA</td><td>ヒント1-200&マイクロ;L バルク 1,000個</td></tr></tbody></table>

電界効果バイオセンシング技術を用いた分子シャペロンhsp90とそのクライアントプロテインキナーゼcdc37との生体分子相互作用の探索

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

生体分子相互作用は、機能的に関連する生物学的事象を調節および調整することによって、多数の細胞プロセスにおいて多目的な役割を果たす。タンパク質、炭水化物、ビタミン、脂肪酸、核酸、酵素などの生体分子は、生物の基本的な構成要素です。それらはバイオシステム内の複雑なネットワークに集まり、無数のライフイベントを同期させます。タンパク質は通常、複雑なインターアクトームネットワークを利用してその機能を果たします。したがって、細胞レベルと生物レベルの両方で細胞におけるその重要性を解明するために、そのような相互作用を評価することが必須である。この目標に向けて、我々は、特定の生体分子相互作用を決定するために、急速に出現する技術、電界効果バイオセンシング(FEB)を導入する。FEBは、ベンチトップ型でラベルフリーで信頼性の高い生体分子検出技術で、特定の相互作用を決定し、高品質の電子ベースのバイオセンサーを使用しています。FEB技術は、バイオセンサー表面で使用される生体適合性ナノ材料によるナノモル範囲の相互作用を監視することができる。概念実証として、ヒートショックタンパク質90(Hsp90)と細胞分裂サイクル37(Cdc37)との間のタンパク質間相互作用(PPI)を解明した。Hsp90はATP依存性分子シャペロンであり、多くのタンパク質の折り畳み、安定性、成熟、および品質管理に不可欠な役割を果たし、それによって複数の重要な細胞機能を調節する。Cdc37は、プロテインキナーゼを特異的に認識してHsp90にリクルートし、下流のシグナル伝達経路を調節するため、プロテインキナーゼ特異的分子シャペロンとみなされる。そのため、Cdc37はHsp90の共同シャペロンと考えられている。シャペロンキナーゼ経路(Hsp90/Cdc37複合体)は、細胞増殖を促進する複数の悪性腫瘍において過剰活性化される。したがって、それは癌治療の潜在的な標的である。本研究は、Hsp90/Cdc37モデルシステムを用いたFEB技術の効率を実証する。FEBは、2つのタンパク質間に強力なPPIを検出した(3つの独立した実験におけるKD 値は0.014μM、0.053μM、および0.072μM)。要約すると、FEBはラベルフリーで費用対効果の高いPPI検出プラットフォームであり、迅速かつ正確な測定を提供します。

実験1の結果: 標的タンパク質Hsp90(500nM)を、上記のような標的固定化プロトコルに従ってチップに固定化した。最初の実験のために、25nM〜5,000nMの範囲の10濃度の分析物タンパク質Cdc37を、文献で入手可能なデータに基づいて調製した( 表1参照)。
実験のステップは、I応答で起こる変化を追跡することによってリアルタイムで監視することができます(図3A)。プロトコルに含まれる各ステップが実験全体を通してI応答にどのように影響するかを視覚化できます。たとえば、キャリブレーション中にI-応答はゼロに近く、アソシエーションステップでは、分析物(Cdc37)濃度の増加とともにI-応答が徐々に増加します。この実験のデータ(図3A)を見ると、低い分析物濃度(25nMで50BU)でI-Responseの急激な増加が観察されました。低い分析物濃度では低いI-Responseが予想され、濃度の...

電界効果バイオセンシング(FEB)は、生体分子相互作用を検出するための標識のない技術です。これは、結合標的が固定化されているグラフェンバイオセンサを通る電流を測定する。FEB技術を用いてHsp90とCdc37の生体分子間相互作用を評価し、2つのタンパク質間の強い相互作用が検出された。

電界効果バイオセンシング技術を用いた分子シャペロンHsp90とそのクライアントプロテインキナーゼCdc37との生体分子相互作用の探索

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

FEBは、ラベルフリーで費用対効果の高い_____________相互作用検出プラットフォームであり、迅速かつ正確な測定を提供します。この方法は、既知または未知の相互作用の検証と、生体分子相互作用の潜在的な阻害剤を試験する簡単な方法を提供します。FEBの主な利点は、オープンなハンドピペッティングプラットフォームを使用して実験全体を通してユーザーをゲートし、ユーザーがほとんどまたはまったくトレーニングなしで作業できるようにする、自動化されたユーザーフレンドリーなソフトウェアです。FEB技術はまた、医薬品、小分子、ペプチドおよびタンパク質の生体分子分析、in vitro生物学的活性をin vivo有効性に容易に変換することによる薬物検証の多様な分野でのアプリケーションを提供します。初心者であるため、信頼性の高いKD値を得るために実験を最適化するために適切な分析物濃度を選択する際に課題に直面する可能性があります。チップの機能化プロセスと適切なバッファ交換に注意を払うことをお勧めします。等量のEDC溶液とスルホNHS溶液を上下にピペッティングして混合することから始めます。同社から供給されたバイオセンサーチップを、蓋が取り付けられたガラス製のペトリ皿に入れます。チップの活性化に関連するすべての機能化ステップは、ペトリ皿内で行われることが示唆される。50マイクロリットルの1モルMESバッファーをバイオセンサーチップに塗布します。室温で1分間インキュベートする。その後、緩衝液を吸引し、50マイクロリットルのEDCスルホ-NHS溶液を直ちにセンサーチップに塗布する。ペトリ皿を覆い、室温で15分間インキュベートする。チップからEDCスルホ-NHS溶液を吸引し、50マイクロリットルの1モルMESバッファーを塗布する。MESバッファーを吸引し、50マイクロリットルの1X PBSでチップを2回すすいでください。チップからPBSを吸引し、標的分子Hsp90を加える。 ガラスシャーレを覆い、室温で30分間インキュベートする。次いで、標的分子を含む溶液を吸引し、50マイクロリットルの1X PBSで3回すすいだ。チップから1X PBS溶液を吸引し、50マイクロリットルのクエンチ1溶液を加える。ガラス製のシャーレを覆い、室温で15分間インキュベートする。チップからクエンチ1溶液を吸引し、50マイクロリットルのクエンチ2溶液を加える。ガラス製のシャーレを覆い、室温で15分間インキュベートする。その後、チップからクエンチ2つの溶液を吸引し、50マイクロリットルの1X PBSを使用してチップを5回すすぎ、最後のPBS液滴をセンサーに残します。所望の濃度範囲のCdc37の分析物希釈シリーズを調製する。信頼性の高い解離定数、またはKD値を得るために少なくとも8つの異なる分析物濃度を含むように実験を設計し、較正および標的タンパク質に使用される同じ緩衝液中にこれらの異なる希釈物を調製する。チップを機器に慎重に置きます。ソフトウェアがオンになっていて、LEDライトが緑色に点灯していることを確認します。次に、自動ソフトウェアの [実験の実行] モジュールを押し、再生またはその他の目的のプロトコルを使用して 10 個のポイントを選択します。オペレータ名、実験名、日付、再生バッファー、固定化ターゲット、溶液中の分析物などの詳細を入力します。ソフトウェアに表示される [実験の開始] ボタンを押し、自動ソフトウェアの指示に従ってください。機器のキャリブレーションを実行するには、チップから残りのPBS溶液を吸引し、50マイクロリットルのキャリブレーションバッファーを塗布します。続行ボタンを押し、キャリブレーションステップが完了するまで5分間待ちます。ソフトウェアは、キャリブレーションステップのために決定されたエンドポイントを、フォローアップするための警告アラームとともに表示します。次に、チップから校正バッファーを吸引し、最低分析物濃度の50マイクロリットルを塗布することにより、分析物会合を行う。[続行] ボタンを押し、関連付けの手順が完了するまで 5 分間待ちます。アソシエーション・ステップの終点が警告アラームとともに表示され、続行されます。分析物の解離を行うには、チップから分析物溶液を吸引し、50マイクロリットルの解離バッファーを塗布します。続行ボタンを押します。解離ステップの期間が経過すると、ソフトウェアは解離ステップのエンドポイントを警告アラームとともに表示します。次に、チップから解離液を吸引し、50マイクロリットルの再生バッファーを塗布してチップ再生を行う。次に、[続行] ボタンを押します。再生ステップは、通常、完了するまでに約 30 秒かかります。その後、ソフトウェアは再生ステップの終点を警告アラームとともに表示し、フォローアップします。最後に、チップを洗浄するために、チップから再生溶液を吸引し、50マイクロリットルの洗浄バッファーを塗布する。チップから溶液を吸引し、これを5回繰り返します。洗浄バッファーの最後の一滴をチップに残します。次に、[続行]ボタンを押し、ソフトウェア表示で洗浄ステップの継続時間が終了するまで30秒間待ちます。使用する分析物濃度ごとに手順を繰り返します。較正、分析物会合、解離、再生、および洗浄の5つのステップは、1サイクルを構成する。実験終了時に自動解析ソフトウェアの[解析]ボタンを押します。すべての実験ポイントを含む表示ウィンドウが表示されます。所定のプロトコルに使用される分析物濃度が正しいことを確認します。[分析の実行] ボタンを押して、KD 値を自動的に生成します。ソフトウェアは、平衡時の解離定数が計算される対応するI応答に対して分析物濃度をプロットすることによって、ヒルフィットプロットを生成します。標的タンパク質Hsp90をチップに固定化し、第1の実験のために、25ナノモルから5,000ナノモルの範囲の10濃度の分析物タンパク質Cdc37を調製した。実験 1 から生成されたデータ ファイルをここに示しました。リアルタイムで監視された実験データをここに示します。Y軸はバイオセンサユニット内のI応答に対応し、X軸は実験における分析物の異なる時点および濃度に対応する。ここに示すグラフィカル画像は、自動解析ソフトウェアから生成されたヒルフィットプロットを表しています。Y軸はバイオセンサユニットのI応答に対応し、X軸は実験における異なる分析物濃度に対応する。ここに示すグラフィカル画像は、統計解析ソフトウェアを使用して生成された関連プロットを表しています。Y軸は関連相の終端におけるI応答に対応し、X軸は分析物Cdc37の異なる濃度に対応する。実験2では、0.4ナノモルから200ナノモルの範囲の異なる濃度のセットを使用し、生成されたデータファイルをここに示します。グラフィカルな画像は、Hsp90とCdc37の相互作用のITCサーモグラムを表しています。ここに示されているのは、298.15ケルビンでHsp90にCdc37を連続的に注入したために得られた対応する熱進化曲線です。ここで使用される差動電力は時間の関数です。このプロットの積分データ点は、対応する正規化された熱とHsp90のミューラー比対Cdc37を示します。ここで使用されるオープンピペッティングアプローチでは、ユーザーが先端でバイオセンサーに触れないように、ハンドピペッティングの基本的な習熟度を持っている必要があります。ステップタイミングの再現性は、ユーザに完全に依存します。研究者が2つの生体分子間の相互作用を特徴付けたら、FEBシステムを使用して特定の生体分子相互作用を標的とする潜在的な阻害剤またはモジュレーターを設計することによってスクリーニング実験を行うことができます。この手順は、タンパク質間の既知および新規の相互作用、ならびに薬物およびペプチドを含む小分子を同定、検証、および定量するために使用することができる。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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のpH依存性活性の検出<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;シャペロンHdeB<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

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3色 1 分子 FRET を使用して蛋白質の相互作用の相関関係を研究するには

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均質ビーズベースアッセイを用いたシャペロンコカペロン相互作用の研究

このプロトコルは熱衝撃蛋白質70 (Hsp70)のシャペロンの活動を示す。 大腸菌dnaK756...

熱ショックタンパク質70のシャペロン機能を研究するための大腸菌ベースの相補アッセイ

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疾患における機能不全タンパク質間相互作用のマッピング

探索する電界効果バイオセンシング技術を用いたHsp90とCdc37のタンパク質相互作用。ラベルフリーで高速・正確な測定により、創薬研究や生体分子解析に応用可能な手法を学ぶ。

電界効果バイオセンシング技術を用いた分子シャペロンHsp90とそのクライアントプロテインキナーゼCdc37との生体分子相互作用の探索

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