電界効果バイオセンシング技術を用いた分子シャペロンHsp90とそのクライアントプロテインキナーゼCdc37との生体分子相互作用の探索

FEBは、ラベルフリーで費用対効果の高い_____________相互作用検出プラットフォームであり、迅速かつ正確な測定を提供します。この方法は、既知または未知の相互作用の検証と、生体分子相互作用の潜在的な阻害剤を試験する簡単な方法を提供します。FEBの主な利点は、オープンなハンドピペッティングプラットフォームを使用して実験全体を通してユーザーをゲートし、ユーザーがほとんどまたはまったくトレーニングなしで作業できるようにする、自動化されたユーザーフレンドリーなソフトウェアです。

FEB技術はまた、医薬品、小分子、ペプチドおよびタンパク質の生体分子分析、in vitro生物学的活性をin vivo有効性に容易に変換することによる薬物検証の多様な分野でのアプリケーションを提供します。初心者であるため、信頼性の高いKD値を得るために実験を最適化するために適切な分析物濃度を選択する際に課題に直面する可能性があります。チップの機能化プロセスと適切なバッファ交換に注意を払うことをお勧めします。

等量のEDC溶液とスルホNHS溶液を上下にピペッティングして混合することから始めます。同社から供給されたバイオセンサーチップを、蓋が取り付けられたガラス製のペトリ皿に入れます。チップの活性化に関連するすべての機能化ステップは、ペトリ皿内で行われることが示唆される。

50マイクロリットルの1モルMESバッファーをバイオセンサーチップに塗布します。室温で1分間インキュベートする。その後、緩衝液を吸引し、50マイクロリットルのEDCスルホ-NHS溶液を直ちにセンサーチップに塗布する。

ペトリ皿を覆い、室温で15分間インキュベートする。チップからEDCスルホ-NHS溶液を吸引し、50マイクロリットルの1モルMESバッファーを塗布する。MESバッファーを吸引し、50マイクロリットルの1X PBSでチップを2回すすいでください。

チップからPBSを吸引し、標的分子Hsp90を加える。 ガラスシャーレを覆い、室温で30分間インキュベートする。次いで、標的分子を含む溶液を吸引し、50マイクロリットルの1X PBSで3回すすいだ。

チップから1X PBS溶液を吸引し、50マイクロリットルのクエンチ1溶液を加える。ガラス製のシャーレを覆い、室温で15分間インキュベートする。チップからクエンチ1溶液を吸引し、50マイクロリットルのクエンチ2溶液を加える。

ガラス製のシャーレを覆い、室温で15分間インキュベートする。その後、チップからクエンチ2つの溶液を吸引し、50マイクロリットルの1X PBSを使用してチップを5回すすぎ、最後のPBS液滴をセンサーに残します。所望の濃度範囲のCdc37の分析物希釈シリーズを調製する。

信頼性の高い解離定数、またはKD値を得るために少なくとも8つの異なる分析物濃度を含むように実験を設計し、較正および標的タンパク質に使用される同じ緩衝液中にこれらの異なる希釈物を調製する。チップを機器に慎重に置きます。ソフトウェアがオンになっていて、LEDライトが緑色に点灯していることを確認します。

次に、自動ソフトウェアの [実験の実行] モジュールを押し、再生またはその他の目的のプロトコルを使用して 10 個のポイントを選択します。オペレータ名、実験名、日付、再生バッファー、固定化ターゲット、溶液中の分析物などの詳細を入力します。ソフトウェアに表示される [実験の開始] ボタンを押し、自動ソフトウェアの指示に従ってください。

機器のキャリブレーションを実行するには、チップから残りのPBS溶液を吸引し、50マイクロリットルのキャリブレーションバッファーを塗布します。続行ボタンを押し、キャリブレーションステップが完了するまで5分間待ちます。ソフトウェアは、キャリブレーションステップのために決定されたエンドポイントを、フォローアップするための警告アラームとともに表示します。

次に、チップから校正バッファーを吸引し、最低分析物濃度の50マイクロリットルを塗布することにより、分析物会合を行う。[続行] ボタンを押し、関連付けの手順が完了するまで 5 分間待ちます。アソシエーション・ステップの終点が警告アラームとともに表示され、続行されます。

分析物の解離を行うには、チップから分析物溶液を吸引し、50マイクロリットルの解離バッファーを塗布します。続行ボタンを押します。解離ステップの期間が経過すると、ソフトウェアは解離ステップのエンドポイントを警告アラームとともに表示します。

次に、チップから解離液を吸引し、50マイクロリットルの再生バッファーを塗布してチップ再生を行う。次に、[続行] ボタンを押します。再生ステップは、通常、完了するまでに約 30 秒かかります。

その後、ソフトウェアは再生ステップの終点を警告アラームとともに表示し、フォローアップします。最後に、チップを洗浄するために、チップから再生溶液を吸引し、50マイクロリットルの洗浄バッファーを塗布する。チップから溶液を吸引し、これを5回繰り返します。

洗浄バッファーの最後の一滴をチップに残します。次に、[続行]ボタンを押し、ソフトウェア表示で洗浄ステップの継続時間が終了するまで30秒間待ちます。使用する分析物濃度ごとに手順を繰り返します。

較正、分析物会合、解離、再生、および洗浄の5つのステップは、1サイクルを構成する。実験終了時に自動解析ソフトウェアの[解析]ボタンを押します。すべての実験ポイントを含む表示ウィンドウが表示されます。

所定のプロトコルに使用される分析物濃度が正しいことを確認します。[分析の実行] ボタンを押して、KD 値を自動的に生成します。ソフトウェアは、平衡時の解離定数が計算される対応するI応答に対して分析物濃度をプロットすることによって、ヒルフィットプロットを生成します。

標的タンパク質Hsp90をチップに固定化し、第1の実験のために、25ナノモルから5,000ナノモルの範囲の10濃度の分析物タンパク質Cdc37を調製した。実験 1 から生成されたデータ ファイルをここに示しました。リアルタイムで監視された実験データをここに示します。

Y軸はバイオセンサユニット内のI応答に対応し、X軸は実験における分析物の異なる時点および濃度に対応する。ここに示すグラフィカル画像は、自動解析ソフトウェアから生成されたヒルフィットプロットを表しています。Y軸はバイオセンサユニットのI応答に対応し、X軸は実験における異なる分析物濃度に対応する。

ここに示すグラフィカル画像は、統計解析ソフトウェアを使用して生成された関連プロットを表しています。Y軸は関連相の終端におけるI応答に対応し、X軸は分析物Cdc37の異なる濃度に対応する。実験2では、0.4ナノモルから200ナノモルの範囲の異なる濃度のセットを使用し、生成されたデータファイルをここに示します。

グラフィカルな画像は、Hsp90とCdc37の相互作用のITCサーモグラムを表しています。ここに示されているのは、298.15ケルビンでHsp90にCdc37を連続的に注入したために得られた対応する熱進化曲線です。ここで使用される差動電力は時間の関数です。

このプロットの積分データ点は、対応する正規化された熱とHsp90のミューラー比対Cdc37を示します。ここで使用されるオープンピペッティングアプローチでは、ユーザーが先端でバイオセンサーに触れないように、ハンドピペッティングの基本的な習熟度を持っている必要があります。ステップタイミングの再現性は、ユーザに完全に依存します。

研究者が2つの生体分子間の相互作用を特徴付けたら、FEBシステムを使用して特定の生体分子相互作用を標的とする潜在的な阻害剤またはモジュレーターを設計することによってスクリーニング実験を行うことができます。この手順は、タンパク質間の既知および新規の相互作用、ならびに薬物およびペプチドを含む小分子を同定、検証、および定量するために使用することができる。