インタビュー：CD1dによる糖脂質抗原提示とNKT細胞の活性化の治療の可能性

こんにちは、私はLa Jolla Institute for Allergy and ImmunologyのMitchell Cronenbergです。私は会長兼サイエンティフィックディレクターを務めておりますが、同時に非常に活発な研究室も運営しています。今回は、私たちが活用している技術の一つであるCD 1Dテトラマーについてお話しします。私の研究室での研究の大部分は、CD 1D反応性T細胞に関するものです。

これらの細胞は、ペプチドではなく糖脂質を認識するという点で独特です。また、私の研究室の別のグループでは、全く異なるテーマである粘膜免疫系とその調節について研究しています。CD1分子は抗原提示分子であり、これは抗原やタンパク質の断片、あるいはその他の分子と結合し、T細胞が認識できるようにそれらを提示することを意味します。

抗原提示分子には、大きく分けて2つの異なる種類があります。ペプチドを保持または提示するものと、脂質および糖脂質を保持するものです。そして、CD1分子は脂質および糖脂質を保持します。

それがそれらの機能であり、これらの脂質や糖脂質を保持してT細胞に提示します。実際にはCD1分子にはCD1A、B、C、Dの4種類があります。ここでは特にCD1Dに焦点を当てていますが、CD1Dはマウスモデルが存在することもあり、おそらく最もよく研究されている分子です。CD1Dは、自然免疫応答と獲得免疫応答の両方の特徴を持つ特異な白血球であるナチュラルキラーT細胞と呼ばれる特定のT細胞に糖脂質を提示します。

提示される糖脂質は、現時点では十分に特性が解明されていませんが、自己糖脂質である場合と、微生物由来の糖脂質である場合があります。また、提示されることが分かっている糖脂質には2つの供給源があります。その一つはFMS細菌と呼ばれるもので、おそらく生物圏で最も豊富な細菌です。

それらは海洋に、植物に、そして土壌に生息しています。しかし、それらが人々を病気にさせることは多くありません。私たちは、これらの細菌と共に生きることに非常に慣れているのだと思います。

私たちが知っている2番目のカテゴリーは、ジアルキルグリセロール含有糖脂質と呼ばれる、異なる種類の糖脂質です。これらは、ライム病の原因となるBorrelia burgdorferiや、おそらく他の多くの病原体に見られます。現在、どのような種類の細菌がこれらの糖脂質を持っているのかが明らかになりつつあります。

したがって、SMS由来の糖脂質や、ボレリアおよびおそらく他の多くの真の病原体由来のジアルキルグリセロール脂質が存在します。これらの脂質は、主に樹状細胞のCD1D分子にロードされますが、Bリンパ球や肝臓のER細胞、あるいは他の細胞型である可能性もあります。これらのCD1D分子はリソソームやエンドソームを通過し、そこでおそらくこれらの脂質と結合し、その後、先ほど述べたナチュラルキラーT細胞を含むT細胞によって認識されるよう、脂質を細胞表面へと運び出します。

糖脂質を持つ細菌にさらされた場合に起こることの一つに、NK T細胞が非常に迅速に活性化されることが挙げられます。一方で、従来のT細胞、言い換えればペプチド反応性T細胞が十分な免疫応答を開始するには、通常3〜4日かかります。特に、抗原経験がない場合はさらに時間を要します。

言い換えれば、それらが未感作である場合、ナイーブな状態にあります。対照的に、NK T細胞は数時間以内に活性化され、非常に短期間でγ-interferonのようなサイトカインを産生し始めます。これは細菌の排除に重要です。その点において、これらの細胞は自然免疫応答の側面を備えています。

モデル抗原の研究から、CD 1Dが後期エンドソームおよびリソソームに移行することが分かっています。これらは非常に酸性の高い細胞内コンパートメントであり、そこで糖脂質抗原がCD 1Dにロードされます。実際には、樹状細胞のような抗原提示細胞の内部に、脂質のCD 1D分子へのロードを助ける特殊な転送タンパク質が存在します。今回のfona細菌やborre細菌、およびその他の細菌は細胞外細菌であるため、脂質抗原は何らかの方法で細胞内、おそらくはリソソームへと輸送され、CD 1D分子にロードされると考えられます。

その後、NKT細胞が即座に活性化されます。そして、これらすべてが、肝臓の類洞、脾臓、おそらくは骨髄、およびNKT細胞が存在するその他の部位において、数時間以内に起こらなければなりません。テトラマー構造は、他のT細胞とは異なる先天的な特性を持つこれらのナチュラルキラーT細胞を、曖昧さなく定義するための極めて重要な鍵となります。利用可能な他のマーカーはあまりに曖昧ですが、このテトラマーを用いることで、これらの細胞を定義づける鍵となる事実である抗原受容体の特異性に基づいて細胞を同定することが可能になります。テトラマーの作製手法には長い歴史があります。

これはMark DavisとJohn Almanによって考案されました。その着想は、T細胞受容体の親和性が低いため、特異性に基づいて細胞を定義または同定しようとしても、それらが認識するペプチドや、ペプチドと抗原提示分子の複合体では、細胞を同定させるのに十分な親和性（結合強度）が得られないということでした。そこでMark DavisとJohn Allmanが開発したのが、このテトラマー技術です。これは、抗原提示分子とそれが提示する分子を用いてテトラマー（場合によってはオクタマー）を作成する方法であり、基本的に相互作用の親和性を高めるものです。これにより、インフルエンザペプチドおよび特定の抗原提示分子、あるいは関心のある任意の抗原に特異的な細胞を視覚化することが可能になります。

例えば、ワクチンの投与スケジュールがどの程度有効であるかを確認できるため、非常に重要な技術です。私たちは1990年代後半からこの取り組みを開始し、もともとは2000年に発表した論文（現在までに約500回引用されています）にまとめています。私たちが行ったのは、その技術を脂質に適用することでした。

そこで、可溶性CD1分子を作製しました。後ほど説明する手法を用いて、これらを重合させ、つまりテトラマー化させ、特定の糖脂質を結合させることができました。これにより、特定のT細胞受容体を検出するための試薬として利用可能になります。言い換えれば、目的の糖脂質とCD1dの複合体を認識する受容体を検出できるということです。このテトラマーは、NKT細胞の数、活性化状態、および機能を解析したいあらゆる状況で使用できます。

また、私たちの研究室では、さまざまなプロジェクトのいずれかから（この手法が）活用される可能性があります。例えば、特定の変異体やシグナル伝達経路がNK T細胞の発達に影響を与えるかどうかを調べたい場合、テトラマーを用いてNK T細胞の数を解析することで、それを明らかにできます。さらに、他のマーカーや細胞表面タンパク質を調べることで、NK T細胞が成熟しているか、あるいは活性化しているかを評価することも可能です。抗原刺激の後、テトラマーを用いることで、細胞が活性化しているかだけでなく、どのようなサイトカインを産生しているかについても解析できます。

このように、テトラマー染色を例えば細胞内サイトカイン染色と組み合わせることで、マルチパラメータフローサイトメトリーを用いて、NKT細胞の何パーセントがγ-interferonを産生しているか、何パーセントがIL-4を産生しているか、あるいはその両方を産生しているかといった、これらの細胞によるサイトカイン産生に関するさまざまな問いに対し、ex vivoで直接的に答えることができます。また、さらなる実験を行うことも可能です。例えば、テトラマーを用いてNKT細胞を精製し、in vitroで培養して他の細胞種との相互作用を調べたり、あるいは遺伝的な理由でNKT細胞を欠損している受容動物などへ移植したりすることが可能です。

私たちはその機能を回復させたいと考えています。そうすることで、細胞がどこにホーミングし、どのように機能するかについて検討することが可能です。最後に、ヒトNKT細胞の例では、分析目的、あるいは潜在的に治療目的で細胞を増殖させるために、テトラマーを用いてin vitroで細胞株を拡大させる手法が実際に用いられています。

ここでは、CD1Dテトラマーを作成するためにバクロウイルス発現システムを使用します。まず、プロモーター、およびβ2-ミクログロブリンとCD1D重鎖の発現配列を含む一般的なDNAコンストラクトから工程を開始します。このCD1分子は、2つのポリペプチドからなるヘテロ二量体です。

ここでは、2つのプロモーターを用いた発現システムを使用し、前述の手順で慎重にタイターを決定したバキュロウイルスを用いて昆虫培養細胞に感染させます。その後、細胞に感染させ、培養液から細胞によって発現したタンパク質を回収します。CD1D重鎖は、特にテトラマー作製用に設計されています。

私たちが（この実験で）行うことは2つ、あるいはむしろ3つあります。まず1つ目は、膜貫通領域を取り除くことです。これにより、可溶性タンパク質を発現させています。

第二に、金属イオンクロマトグラフィーでタンパク質を精製できるよう、ヘキサヒスチジンタグを付加しました。そして第三に、酵素的なビオチン化のためのビオチン部位と呼ばれるものを導入しています。これが今回の革新的な点です。

DavisとAlmanがテトラマー製造技術を初めて開発した際に、これは非常に重要なことでした。したがって、タンパク質を回収した後、ニッケルカラムクロマトグラフィーを用いて精製します。その後、サイズ排除クロマトグラフィーを行う場合もあります。

その後、タンパク質を酵素的にビオチン化し、インキュベートします。酵素的にビオチン化されたタンパク質をストレプトアビジン（strep ab）とともにインキュベートすると、テトラマーを形成します。一方、精製された可溶性CD1タンパク質は、目的の糖脂質溶液中で基本的に一晩インキュベートすることができます。ここで、糖脂質をDMSOに溶解させないことが非常に重要です。DMSOは糖脂質の希釈剤や溶媒として一般的ですが、CD1はDMSOに対して非常に敏感であるためです。

通常、少量のTweenとPBSを含むバッファーを使用します。このバッファーは、ほとんどのグリコリピドを溶解させるのに非常に有効です。また、自発的に起こると考えられているCD1Dへのロードには、さまざまなメーカーから販売されているストレプトアビジンを使用します。

そして、PE、Fico、Eryn、またはPCフィコシアニン染料のいずれかと結合させましたが、どちらを用いても非常にうまく機能し、良好な染色結果が得られました。したがって、全体として、この手順は十分に特性解析されているMHCクラスIテトラマーの作製手順とそれほど変わりませんが、細菌発現ではなくウイルス発現を用いている点と、当然ながらペプチドではなく脂質抗原を用いている点が異なります。一点強調しておきたいのは、ヒトにもNKT細胞が存在し、マウスのNKT細胞と同様の特異性を持っているということです。

したがって、この特異性は齧歯類から分岐して以来、少なくとも6000万年以上維持されています。実際、ヒトCD1Dテトラマーは、このビデオでご覧いただけるものと同じ手法で作成できます。しかし、実際にはヒトNK T細胞はマウステトラマーで非常にうまく機能し、その逆も同様です。そのため、ヒトの研究にマウステトラマーを使用できるため、ヒトテトラマーを作成することはそれほど多くありません。

NK T細胞が免疫応答の結果を決定する重要な要因であることが示されているマウスモデルは数多く存在します。その範囲は、がんに対する応答から、自己免疫疾患の調節、感染剤の除去、さらには動脈で起こる慢性炎症プロセスである硬化プラークの形成にまで及びます。

これらの細胞が、ヒトにおいてそれほど豊富に存在しない場合にどの程度重要であるかについては、いくつか議論があります。自己免疫状態でこれらの細胞が変化していることを示す報告が多くなされており、また喘息患者の肺において非常に濃縮されているという報告もあります。ただし、これらの報告にはニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（New England Journal of Medicine）に掲載された報告もありますが、それについては一部論争があります。それでも、ヒトにおいてこれらの細胞が重要である可能性を示唆する研究が数多く存在します。

臨床試験に関しては、進行がん患者を対象とした4つの第1相試験において、NKT細胞の刺激が検証されています。有効性を示すいくつかの根拠が得られていますが、当然ながら、これらの患者は非常に重篤な状態にあり、現在、数種類の異なるがんにおいて研究が進行中です。また、自己免疫疾患においてもNKT細胞を用いた細胞治療の活用に関心を持つ人々がいますが、それはまだ本格的な始動には至っていません。

これらの研究においてテトラマーは、主にアゴニスト療法後にNKT細胞に何が起こったかを分析するという点で役割を果たす可能性があります。したがって、通常の方針としては、反応や状態に応じて、糖脂質アゴニスト、あるいは他グループが開発している糖脂質アンタゴニストを使用することです。そして、NKT細胞に何が起こったかを評価しますが、これは通常、テトラマーを用いて行われます。

もう一つの潜在的な用途は、ヒトNKT細胞のin vitroにおける増殖です。例えば、テトラマーを用いた抗原刺激や、適切な糖脂質を持つ細胞を用いることで、in vitroで大量のヒトNKT細胞を増殖させることは十分に可能です。また、テトラマーや細胞を使用することに加えて、サイトカインを添加する必要があります。

しかし、それらの条件下で、大量のヒトNK T細胞を増殖させることが可能です。また、ボストンの少なくとも1つのグループが、糖脂質ベースの療法ではなく、この種の療法に関心を持っています。私の研究室の別のグループは、粘膜免疫の研究に従事しています。

多くの免疫学者は、リンパ節や脾臓にあるリンパ球または白血球に焦点を当ててきました。しかし、おそらく体内で見つかる大部分のリンパ球は、実際には腸粘膜に存在しており、そこにはおそらく10¹⁰〜10¹⁴個から10¹⁰〜10¹⁵個の細菌も存在しています。つまり、微生物的な視点から見ると、私たちは腸管を除いてほとんど無菌状態であると言えます。

また、腸管内にも非常に多くの白血球が存在しています。これらの細胞は独自の特性を持っており、実際にはあまり研究が進んでいません。そのため、私たちはこれらの細胞に関する基礎科学的な研究を行っています。

また、私は免疫調節不全とも呼ぶべきプロセスについても研究しており、それが腸管において炎症性腸疾患を引き起こします。これらは基本的に小腸または大腸の免疫介在性疾患であり、クローン病または潰瘍性大腸炎という名称で知られています。一部でヒトを対象とした研究も行っていますが、研究の大部分はマウスモデルを用いています。私たちは、クローン病のような症状を呈する粘膜免疫系の調節不全を再現した、非常に優れたマウスモデルを有しています。

私たちはそのプロセスと、そのプロセスを阻害する方法について研究しており、最終的には、これらの免疫介在性疾患に苦しむ患者さんにとってより優れた治療法を開発することを願っています。結論として、今後10年ほどで免疫学がどこに向かうのかについて少し考えてみたいと思いますが、意外に聞こえるかもしれませんが、10年先を予測することは非常に困難です。

粘膜免疫系は、実際、免疫学における主要な未開拓分野の一つであると考えています。とはいえ、粘膜免疫学の研究に関心を持つ人々や、著名な研究グループはますます増えています。また、絶大な影響を与えるであろうもう一つの分野は遺伝学、特にヒト遺伝学だと思います。ヒトゲノムの1,000人規模の配列解析へと移行、あるいは進展していくにつれ、個人単位での研究を行い、DNAの多様性が免疫応答にどのように影響するかを評価することが本当に可能になるでしょう。

現在、基礎的な経路に関する最良の研究の多くは齧歯類を用いて行われています。特にマウスなどの齧歯類は、私たちの研究において極めて重要です。しかし、将来的に複雑な自己免疫現象や個々人に起こりうるその他の事象を検討する際には、ヒトの遺伝子多型に基づいてこれらを行うことができると考えています。

多型を評価し、その情報を利用して免疫応答にどのような影響が及ぶかを予測し、最終的には、私が、そして他の人々が「個別化免疫療法」、あるいはより広い意味での「個別化医療」と呼ぶものへと移行することが可能になります。したがって、遺伝学は絶大な影響を与えることになるでしょう。マウス遺伝学においては、すでに優れたツールが存在しています。

私たちは、任意の遺伝子をノックアウトすることができます。また、特定の細胞型における遺伝子発現をノックアウトすることも可能です。これにより、驚くべき成果を上げることができます。

しかし、将来的には、ヒトの反応という観点から免疫応答と免疫を理解することに注力することになると考えています。