Name: 質量分析に先立つ堅牢なプロテオーム精製のための有機溶媒ベースのタンパク質沈殿 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 学ぶ有機溶媒ベースのタンパク質沈殿法で、質量分析に先立つ堅牢なプロテオーム精製を実現します。高速処理と高回収率を両立し、ボトムアップおよびトップダウンプロテオミクスワークフローに最適です。

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この研究は、カナダの自然科学・工学研究評議会から資金提供を受けました。著者らは、MSデータの取得に貢献してくれたBioinformatics Solutions Inc.(カナダ、ウォータールー)とHospital for Sick Children(トロント、カナダ)のSPARC BioCenter(Molecular Analysis)に感謝する。

1. 材料に関する考慮事項とサンプルの事前準備
<ol><li>高純度の溶媒(アセトン、クロロホルム、メタノール)(>99.5%)と化学薬品のみを使用し、余分な水分を含まない。</li>
	<li>水に塩化ナトリウムと硫酸亜鉛の溶液(1 M)を調製する。 注:塩溶液は、汚染物質または微生物の増殖がない限り、室温で無期限に保存することができます。</li>
	<li>沈殿を誘導するために必要な量のサンプルと溶媒を保持するのに十分な最小のポリプロピレン(PP)微量遠心分離バイアルを使用してください。</li>
	<li>沈殿させるサンプル中のSDS濃度が2%(w/v)以下であることを確認します。SDSが高い場合は、サンプルを水で希釈します。</li>
	<li>最適な沈殿効率を得るために、0.01 ~ 10 g/L のタンパク質濃度を確保します。 注:沈殿に最適な質量は、1〜100μgのタンパク質の範囲です。</li>
	<li>使用前に、すべての溶媒および溶液に粒子状物質がないことを確認してください。ろ過(<0.5 μm)または遠心分離工程(室温で10,000 x g で1分間)のいずれかを実行して、未溶解の微粒子を除去します。</li>
	<li>ジスルフィド結合還元およびアルキル化が必要な場合は、タンパク質沈殿の前にこれらのステップを実施してください。過剰な還元試薬およびアルキル化試薬は、沈殿プロセスを通じて除去されるであろう。</li>
	<li>プロトコールのいずれかを選択して実行することにより、タンパク質を沈殿させる(ステップ2、3、4、または5)。</li>
</ol>2. アセトンによる迅速な(バイアルベースの)タンパク質沈殿
<ol><li>ピペット90 μLの(微粒子フリー)タンパク質またはプロテオーム溶液をPP微量遠心チューブに入れます。次いで、10 μLの1 MNaCl水溶液を加える。 注:プロテオーム抽出物のイオン強度がすでに100mMを超える場合、追加の塩は必要ありません。</li>
	<li>ピペット400 μLのアセトンをサンプルに含む。バイアルにキャップを付け、バイアルを静かにタップして溶媒を結合します。激しい混合は必要ありません。 注:タンパク質、塩、およびアセトンの体積は、それぞれの相対比が維持されている限り、増加させることができる。</li>
	<li>バイアルを室温で、乱されずに、最低2分間インキュベートする。 注:低温でのインキュベーションを含むより長いインキュベーション(例えば、従来のアセトン沈殿は冷凍庫での一晩沈殿を使用する)は、より大きな(目に見える)凝集タンパク質微粒子の形成をもたらし(図1A)、一般に総タンパク質回収率を改善しない。</li>
	<li>インキュベーション後、サンプルを遠心分離機に入れ、バイアルの向きに注意します。室温で10,000 x g 以上で最低2分間回転します。</li>
	<li>バイアルのキャップを外し、バイアルをゆっくりと廃棄物容器に反転させて上清を静かにデカントします。反転したバイアルをペーパータオルにタッチして、バイアルから残留溶媒を引き出します。 警告: 廃溶剤は、適切なプロトコルに従って保管し、廃棄してください。</li>
	<li>SDS含有サンプルの場合は、ペレットを乱さないように注意しながら、400μLの新鮮なアセトンを分注してください。 メモ: ステップ 2.6 はオプションです。<ol><li>直ちにサンプルを遠心分離し(室温で10,000 x g 以上で1分間)、バイアルを初期スピンと同じ向きでローターに入れます。ステップ2.5で説明したように洗浄溶媒をデカントする。</li>
	</ol></li>
	<li>キャップを開けたままサンプルを完全に乾燥させます(約1分)。バイアルを要約し、ペレット可溶化を進める(ステップ6)。</li>
</ol>低分子量(LMW)ペプチド(ZnSO4+アセトン)の沈殿
<ol><li>54 μL のプロテオーム抽出物を 2 mL の PP バイアルに分注し、次いで 6 μL の 1 M ZnSO4 を加える。 注:LMWペプチド(≤5kDa)の最適な回収率は、最終的に97体積%にアセトンを添加することによって得られる。2 mL PP バイアルを仮定すると、最大初期サンプル量は 54 μL です。</li>
	<li>1940 μLのアセトンを最終的な97容量%に加える。静かに渦巻いて混ぜ合わせ、ベンチトップに乱れずに最低2分間放置します。</li>
	<li>遠心分離機(室温で10,000 x g で1分間)し、バイアルを反転させて上清を除去し、次いでバイアルをペーパータオルに接触させた。</li>
	<li>SDS含有サンプルの場合は、ペレットを乱さないように注意しながら、400μLの新鮮なアセトンを分注してください。 メモ: ステップ 3.4 はオプションです。<ol><li>ステップ3.3に従ってサンプルを直ちに遠心分離し、バイアルを初期スピンと同じ向きでローターに入れる。ステップ3.3で説明したように洗浄溶媒をデカントする。</li>
	</ol></li>
	<li>得られた乾燥ペレットを、短時間のボルテックスまたは超音波処理(〜5分)で水性溶媒に再可溶化する。</li>
</ol>4. クロロホルム/メタノール/水(CMW)によるタンパク質沈殿
<ol><li>100 μLのタンパク質またはプロテオーム溶液をPPバイアルに分配します。400 μLのメタノールを加え、続いて100 μLのクロロホルムを加えます。バイアルと渦を短くキャップして混合します。 注: CMW 沈殿の場合、底が狭い 1.5 mL バイアルが好まれます(図 2A)。 警告: クロロホルム溶剤は、適切な換気フードで取り扱う必要があります。クロロホルムと接触するすべての溶媒は、廃棄時にハロゲン化廃棄物として処理する必要があります。</li>
	<li>300μLの水をバイアルの中央に直接素早く分配する。バイアルにキャップを付けます。サンプルをベンチトップに1分間邪魔されずに座らせます。 注:ソリューションはすぐに白く濁って表示されます。水を加えた後にバイアルを混ぜないでください。</li>
	<li>PPバイアルを遠心分離機に入れ、最低5分間(室温で10,000 x g 以上)回転させます。 注:遠心分離すると、2つの可視溶媒層が形成されます(上層=メタノール/水、下層=クロロホルム)。固体タンパク質ペレットは、溶媒界面で形成される(図2A)。</li>
	<li>大きな(1mL)マイクロピペットチップを使用して、バイアルを〜45°に保持し、上層から約700μLの溶媒を均一な速度で除去する。</li>
	<li>より小さい(200 μL)マイクロピペットチップを使用して、〜45°傾けたバイアルから上部溶媒層を除去し続けます。ピペットは、上部溶媒層がバイアル内でビーズを形成するまで1回の連続運動で起こる。</li>
	<li>400 μLの新鮮なメタノールをサンプルバイアルに加え、ペレットを乱すことなく、溶媒をバイアルの側面に分配することによって。</li>
	<li>バイアルにキャップを付けます。バイアルを静かに揺らして溶媒層を結合し、溶媒を一緒に渦巻きます。 注:ペレットを乱さないようにすることが不可欠です。バイアルを渦巻きにしないでください。</li>
	<li>ローター内のバイアルの向きに注目して、最低10分間遠心分離機(室温で10,000 x g )します。タンパク質ペレットはバイアルの底に付着する(図2B)。</li>
	<li>ペレットを下に向けてバイアルを45°傾けます。ピペットチップをバイアルの上端に沿って置き、1mLのマイクロピペットチップで上清をゆっくりと連続した速度で除去する。バイアル中に約20μLの溶媒を保持する。</li>
	<li>SDS含有サンプル用のタンパク質ペレットを、400μLの新鮮なメタノールをゆっくりと分配して洗浄する。バイアルを渦巻きにしないでください。<ol><li>遠心分離(温度で2分間10,000 x g )を直接進め、バイアルを最初のスピンと同じ向きでローターに入れます。</li>
	</ol></li>
	<li>ステップ4.9に従って溶媒を除去する。残留溶媒が蒸発するまで、サンプルを煙道で空気乾燥させます。</li>
	<li>ステップ 6 で推奨されている再可溶化手順を参照してください。</li>
</ol>5. 使い捨てろ過カートリッジを使用したタンパク質沈殿
注: ステップ 2 ~ 5 で説明する各溶媒ベースの沈殿プロトコルは、2 段階のろ過および抽出カートリッジで実行できます ( 材料表を参照)。
<ol><li>上部のろ過カートリッジにプラグを取り付けた状態で(図3A)、以下の3つのオプションのいずれかで概説されているように、抽出されたプロテオーム、塩、および溶媒の所望の体積を分配します。<ol><li>(オプション1)アセトンによるタンパク質沈殿の場合は、90 μL のタンパク質またはプロテオーム溶液、10 μL の 1 M NaCl 水溶液、および 400 μL のアセトンを組み合わせてください。ベンチトップで最低2分間インキュベートします。 注:濃縮タンパク質サンプル(1 g/L)では、目に見える沈殿物が発生します(図3B)。</li>
		<li>(オプション2)LMW ペプチド沈殿の場合は、15 μL のサンプル、1.5 μL の 1 M ZnSO4、および 485 μL のアセトンを組み合わせます。ベンチトップで最低2分間インキュベートします。 注: 水性サンプル中の塩濃度が 90 mM であっても、ステップ 3 で推奨されている 100 mM と比較して回復率には影響しません。</li>
		<li>(オプション3)CMW 沈殿の場合は、プロテオーム抽出物 50 μL、メタノール 200 μL、クロロホルム 50 μL を追加します。バイアルをキャップし、簡単に渦を合わせます。<ol><li>150μLの水をバイアルの中央に直接素早く分配します。ベンチトップで1分間インキュベートします。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>プラグをろ過カートリッジに取り付けたまま、室温で2,500 x g で2分間遠心分離します。</li>
	<li>カートリッジを反転させ、ネジを外してカートリッジベースからプラグを取り外します。</li>
	<li>ろ過カートリッジを清潔なバイアルに入れ、遠心分離機に戻します。室温で500 x g で3分間スピンします。フロースルー溶媒を下部バイアルから廃棄する。 メモ: 上部のろ過カートリッジに溶媒が残っている場合は、遠心分離機に戻り、さらにスピンを実行します。</li>
	<li>ろ過カートリッジに 400 μL のアセトンを加えてタンパク質ペレットを洗浄します (CMW 沈殿の場合、ステップ 5.1.3、メタノール 400 μL を追加します)。</li>
	<li>室温で500 x g で3分間、または上部カートリッジに溶媒が残らなくなるまで遠心分離します。</li>
	<li>ステップ6で説明したように沈殿ペレットを再可溶化する。</li>
</ol>6. タンパク質ペレットの再可溶化
<ol><li>以下に記載する再可溶化プロトコールの直前に2〜5μLのイソプロパノールを膜に直接分配することによって、濾過カートリッジの基部にある膜を濡らす。</li>
	<li>以下のいずれかの再可溶化方法に従う。<ol><li>(オプション1)≥2% SDSを含む水性緩衝液を少なくとも20μLをろ過カートリッジに加えます。キャップと渦を激しく(〜1分)。あるいは、超音波処理(>10分)してタンパク質ペレットを分散させる。<ol><li>試料を95°Cで5分間加熱する)。加熱後に混合工程を繰り返す。 注:Laemmliゲルローディングバッファーは、タンパク質ペレットを再可溶化することができます。しかしながら、SDS含有試料は、トリプシン消化および逆相LCおよびMSと互換性がない。</li>
		</ol></li>
		<li>(オプション2)水中に80%(v / v)ギ酸の溶液を調製する。酸溶液(-20°C)、並びに沈殿したタンパク質を含む濾過カートリッジをプレチルする。<ol><li>50μLの冷たいギ酸をカートリッジに分注する。キャップと渦を30秒間。冷凍庫(-20°C)に10分間戻します。</li>
			<li>カートリッジをもう一度 30 秒間押し込みます。その後、冷却混合サイクルをもう1回繰り返す(10分、-20°C、30秒ボルテックス)。</li>
			<li>最後の500μLに水を加え、ギ酸を8%に希釈する。 注:コールドギ酸プロトコルは、その後のトリプシン消化と互換性がありませんが、LC-MSと互換性があります。</li>
		</ol></li>
		<li>(オプション3)50 μLの新しく調製した8 M尿素を水中でろ過カートリッジに加えます。30分間超音波処理する。<ol><li>カートリッジをベンチトップで1時間(一晩まで)インキュベートします。</li>
			<li>8 M尿素を水または適切な緩衝液で最低5倍に希釈する。 注:一度希釈されると、尿素可溶化プロトコルは、その後のトリプシン消化およびLC-MSと互換性があります。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>7. タンパク質消化
<ol><li>ボトムアップMS分析のために、以下に述べる2つの方法のうちの1つを用いて、再可溶化タンパク質を酵素消化に供する。<ol><li>(オプション1)ギ酸再可溶化の場合は、ステップ6.2.2.1で80%ギ酸の初期容量を25 μLに減らします。ステップ6.2.2.3では、375μLの水を使用してギ酸を5%(v/v)に希釈します。</li>
		<li>ペプシンをタンパク質と酵素のおおよその比率50:1でカートリッジに分配します。ろ過カートリッジにプラグを取り付けて、サンプルを室温で一晩インキュベートします。</li>
	</ol></li>
	<li>(オプション2)尿素中での再可溶化のために、ステップ6.2.3.2で100mMのトリスまたは炭酸水素アンモニウムを含有させて、8〜8.3の間のpHを確保する。<ol><li>トリプシンをおおよそのタンパク質対酵素質量比50:1で加える。プラグをカートリッジに取り付けて、サンプルを37°Cの温水浴中で一晩インキュベートする。</li>
		<li>溶液を10%TFAで酸性化して消化を最終1%まで終了させる。</li>
	</ol></li>
	<li>フィルターのベースからプラグを取り外し、清潔なバイアル(2分、5000 x g、室温)に含まれるカートリッジを遠心分離して、ペプシンまたはトリプシン消化タンパク質を回収します。</li>
</ol>8. SPE クリーンアップ
注: 消化または溶媒交換後の追加のサンプル脱塩の場合、サンプルは説明されているように逆相クリーンアップの対象となる可能性があります。
<ol><li>SPEカートリッジ(材料表を参照)を300 μLのメタノール(2分、400 x g)に、続いて300 μLの5%アセトニトリル/0.1%のTFA(2分、400 x g)を通してプライムします。</li>
	<li>プライミングされたSPEカートリッジを、再可溶化または消化されたタンパク質を含む濾過カートリッジのベースに接続します。</li>
	<li>SPEカートリッジを通してタンパク質を回転させます(5分、室温で800 x g )。上部のカートリッジに溶媒が残っている場合は、カートリッジを遠心分離機に戻してスピンを繰り返します。 メモ: サンプルを SPE カートリッジに 2 度目に通すと、回復率が向上する場合があります。</li>
	<li>300 μL の 5% アセトニトリル/0.1% の TFA を水に浸してカートリッジに加えます。洗浄するには、SPEカートリッジ(2分、2000 x g)を流します。フロースルーを破棄します。</li>
	<li>LMWタンパク質または消化ペプチドの場合は、50%アセトニトリル/0.1%TFA(5分、2500 x g)を300μL流してサンプルを溶出します。</li>
	<li>インタクトなタンパク質の場合は、ステップ8.5に従い、300 μL の 75% アセトニトリル/0.1% TFA を使用した追加の溶出ステップを実行します。得られた 2 つの抽出物を結合します。 メモ: ステップ 8.6 はオプションです。</li>
</ol>

Doucette研究所は、この研究で採用されたProTrap XGを考案し、特許を取得しました。AADはまた、サンプル調製カートリッジを商品化したプロテオフォーム・サイエンティフィックの創設パートナーでもあります。

最適なMS特性評価は、残留SDSが10ppm未満で枯渇すると達成されます。FASPやビーズ上消化などの代替アプローチは、可変回収率31、32、33で定量的なSDS枯渇を提供しますが、沈殿の主な目的は純度と収率を同時に最大化することです。これは、タンパク質ペレットを乱すことなく上清(SDSを含む)を効果的に単離することに依存する。バイアルベースの沈殿では、上清の大部分がピペッティングによって除去されると、凝集したペレットの一部が誤って失われる可能性がますます高まります。このため、残留溶媒のより有意な画分(〜20μL)を残し、洗浄工程34を追加することが不可欠である。洗浄工程では、バイアルから残留溶媒を希釈して除去します。特にCMWでは、ペレットが形成されると試料バイアルを渦巻く必要がない。激しい攪拌によってペレットを破壊すると、偶発的なピペッティングによる損失の可能性を高めるという望ましくない効果があります...

質量分析によるプロテオーム分析は、最新のMS機器の感度、分解能、スキャン速度、汎用性の向上により、ますます厳格になっています。MSの進歩は、より高いタンパク質同定効率およびより正確な定量1,2,3,4,5に寄与する。改善されたMS機器により、研究者は、ワークフローのすべての段階で最小限の時間で高純度タンパク質を定量回収できる、それに対応して一貫したフロントエンドサンプル調製戦略を求めています6,7,8,9,10,11 .生物学的系のプロテオーム状態を正確に反映するには、タンパク質を効率的かつ偏りのない方法で天然のサンプルマトリックスから単離する必要があります。この目的のために、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)などの変性界面活性剤を含む、効率的なタンパク質抽出および可溶化12を保証する。しかし、SDSはエレクトロスプレーイオン化を強く妨害し、適切に排除しないと厳しいMS信号抑制を引き起こす13。
使い捨てスピンカートリッジ14、15、16内に含まれる分子量カットオフフィルターを超えるタンパク質の保持など、その後のプロテオーム分析のために様々なSDS枯渇戦略が利用可能である。フィルター支援サンプル調製法(FASP)は、10ppm未満のSDSを効果的に枯渇させ、最適なMSを容易にするため、好まれています。しかし、FASPによるタンパク質回収は可変であり、これが他の技術の探求を促した。タンパク質(または界面活性剤)を選択的に捕捉するクロマトグラフィーアプローチは、様々な便利なカートリッジまたはビーズベースのフォーマットに進化してきた17、18、19、20、21。タンパク質精製に対するこれらの単純で(理想的には)一貫した戦略を考えると、有機溶媒によるタンパク質沈殿の古典的なアプローチは、タンパク質単離への有望なアプローチとして見過ごされがちです。溶媒沈殿はSDSを臨界レベル以下に正常に枯渇させることが示されていますが、タンパク質回収はこのアプローチの長年の懸念事項でした。複数のグループがタンパク質回収バイアスを観察しており、タンパク質濃度、分子量、疎水性の関数として許容できないほど低い沈殿収率で22,23。文献で報告された沈殿プロトコルの多様性のために、標準化された沈殿条件が開発された。2013年、Crowellらは、80%アセトン24中のタンパク質の沈殿効率に対するイオン強度の依存性を最初に報告した。調べたすべてのタンパク質について、最大30mM塩化ナトリウムの添加は、収量を最大化する(最大100%回収)ために不可欠であることが示された。より最近では、Nickersonらは、アセトン沈殿中のさらに高いイオン強度(最大100mM)と高温(20°C)の組み合わせが、2〜5分25分でほぼ定量的な回復をもたらすことを示した。低分子量(LMW)タンパク質の回収率のわずかな低下が観察された。したがって、Baghalabadiらによるその後の報告では、特定の塩、特に硫酸亜鉛をより高いレベルの有機溶媒(97%アセトン)と組み合わせることによって、LMWタンパク質およびペプチド(≤5kDa)の回収に成功したことが実証されました26。
沈殿プロトコルを精製することで、MSベースのプロテオミクスのタンパク質精製戦略がより信頼性の高いものになりますが、従来の沈殿の成功はユーザーの技術に大きく依存しています。この研究の主な目的は、汚染上清からのタンパク質ペレットの単離を容易にする堅牢な沈殿戦略を提示することです。使い捨てろ過カートリッジは、多孔質PTFEメンブレンフィルター27の上に凝集タンパク質を単離することによってピペッティングを排除するために開発された。上清中のMS干渉成分は、短時間の低速遠心分離工程で効果的に除去されます。使い捨てフィルターカートリッジは、交換可能なSPEカートリッジも提供しており、質量分析に先立って、再可溶化とオプションのタンパク質消化後の後続のサンプルクリーンアップを容易にします。
ここでは、修正アセトンおよびクロロホルム/メタノール/水28 プロトコルを含む一連の推奨プロテオーム沈殿ワークフローを、従来の(バイアルベース)および使い捨ての2状態ろ過および抽出カートリッジの半自動形式で紹介します。得られたタンパク質回収率とSDS枯渇効率をボトムアップのLC-MS/MSプロテオームカバレッジとともに強調し、各プロトコルから期待される結果を実証します。各アプローチに関連する実用的な利点と欠点について説明します。

<table><tbody><tr><td>アセトン</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>AC177170010</td><td>&le;0.002%アルデヒド</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A998-4</td><td>HPLCグレード</td></tr><tr><td>炭酸水素アンモニウム</td><td>ミリポール・シグマ</td><td>A6141-1KG</td><td>しっかりした</td></tr><tr><td>ベータ・メルカプトエタノール</td><td>ミリポール・シグマ</td><td>M3148-25ML</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>ミリポール・シグマ</td><td>B8026-5G</td><td>ブロモフェノール青ナトリウム塩</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>C298-400</td><td>クロロホルム</td></tr><tr><td>蟻酸</td><td>ハネウェル</td><td>56302</td><td>LC-MS用の溶出添加剤</td></tr><tr><td>融合ルーモス質量分析計</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td></td><td>標準タンパク質混合物の分析用</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>ミリポール・シグマ</td><td>356352-1L-M</td><td>分子生物学では、99%></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A4641</td><td>HPLCグレード</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A452SK-4</td><td>HPLCグレード</td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>75-400-102</td><td>最大21,000 xg</td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機チューブ(1.5 mL)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>05-408-130</td><td>テーパードボトム</td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機チューブ&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;(2 mL)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>02-681-321</td><td>丸みを帯びた底</td></tr><tr><td>マイクロピペットのヒント&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;(0.1-10 & mu;L)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>21-197-28</td><td>ユニバーサルピペットチップ、非滅菌</td></tr><tr><td>マイクロピペットのヒント&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;(1-200 & mu;L)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>07-200-302</td><td>ユニバーサルピペットチップ、非滅菌</td></tr><tr><td>マイクロピペットのヒント&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;(200-1000 & mu;L)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>07-200-303</td><td>ユニバーサルピペットチップ、非滅菌</td></tr><tr><td>マイクロピペット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>13-710-903</td><td>マイクロピペット・トリオパック</td></tr><tr><td>ペプシン</td><td>ミリポール・シグマ</td><td>P0525000</td><td>凍乾粉末、および&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;>3200単位/mg</td></tr><tr><td>プロトラップXG</td><td>プロテオフォーム・サイエンティフィック</td><td>PXG-0002</td><td>1箱あたり50個の完全なユニット</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>ミリポール・シグマ</td><td>S9888-1KG</td><td>ACS試薬、>99%</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>28312</td><td>粉末状固体</td></tr><tr><td>timsTOFプロ質量分析計</td><td>ブルーカー</td><td></td><td>肝臓プロテオーム抽出物の解析</td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>L06374。AP</td><td>99%</td></tr><tr><td>トリス</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP152-500</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>ミリポール・シグマ</td><td>9002-07-7</td><td>牛の膵臓から、TPCK処理済み</td></tr><tr><td>尿素</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610731</td><td>しっかりした</td></tr><tr><td>水(脱イオン化)</td><td>サトリウス・アリウム ミニ水質浄化システム</td><td>76307-662</td><td>タイプ1ウルトラピュア(18.2 M&Omega; cm)</td></tr><tr><td>硫酸亜鉛</td><td>ミリポール・シグマ</td><td>307491-100G</td><td>しっかりした</td></tr></tbody></table>

質量分析に先立つ堅牢なプロテオーム精製のための有機溶媒ベースのタンパク質沈殿

Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

質量分析(MS)機器の複数の進歩により、定性的および定量的プロテオーム分析が改善されましたが、MSに先んじてタンパク質を単離、濃縮、および処理するためのより信頼性の高いフロントエンドアプローチは、プロテオーム特性評価を成功させるために不可欠です。低く、一貫性のないタンパク質回収率および界面活性剤などの残留不純物は、MS分析に有害である。タンパク質沈殿は、他のサンプル調製戦略と比較して、信頼性が低く、時間がかかり、技術的に実行が難しいと考えられがちです。これらの懸念は、最適なタンパク質沈殿プロトコルを採用することによって克服されます。アセトン沈殿の場合、特定の塩、温度制御、溶媒組成、および沈殿時間の組み合わせが重要ですが、クロロホルム/メタノール/水沈殿の効率は適切なピペッティングとバイアル操作に依存します。あるいは、これらの沈殿プロトコルは、使い捨てスピンカートリッジ内で合理化され、半自動化されています。従来の形式で、使い捨ての2段階ろ過および抽出カートリッジを使用した溶媒ベースのタンパク質沈殿の予想される結果を、この研究で示します。これには、ボトムアップのLC-MS/MS 分析によるプロテオーム混合物の詳細な特性評価が含まれます。SDSベースのワークフローの優れた性能は、非汚染タンパク質と比較しても実証されています。

図4 は、アセトンを用いた使い捨てフィルターカートリッジ中のタンパク質のバイアルベースまたはカートリッジ促進沈殿に続く予想されるSDS枯渇を要約する。アセトン中での従来の一晩インキュベーション(−20°C)は、室温での迅速なアセトン沈殿プロトコル(ステップ2)、ならびにCMW沈殿(ステップ4)と比較される。残留SDSは、メチレンブルー活性物質(MBAS)アッセイ29によって定量した。簡単に説明すると、100 μLサンプルを100 μLのMBAS試薬(250 mgメチレンブルー、50 g硫酸ナトリウム、10 mL硫酸、水で1.0 Lに希釈)と組み合わせ、続いて400 μLのクロロホルムを添加し、UV/Vis分光光度計で651 nmの有機層の吸光度を測定しました。すべてのアプローチは、最適なMS分析を可能にするためにSDSを削減します。
定量的かつ再現性のあるタンパク質回収は、処理された酵母全細胞溶解物のSDS PAGE分析を通じて 図5...

本プロトコールは、質量分析前のプロテオームサンプルの堅牢かつ迅速な回収および精製のための制御された条件下での溶媒ベースのタンパク質沈殿を記載する。

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

これらのプロトコルは、溶媒ベースの沈殿によりタンパク質の回収率と純度を最大化するように設計されています。バイアルで沈殿を実行するためのいくつかのトリックと、スピンカートリッジ形式での半自動アプローチを紹介します。また、沈殿プロトコルを最適化して、一貫性と迅速性を実現しました。プロトコル全体は数分しかかかりません。これらのプロトコルは、タンパク質の溶媒沈殿が質量分析に先立つサンプル調製に理想的であることを示しています。プロトコルは、ボトムアップおよびトップダウンのプロワークフローにシームレスに適合します。今日私たちのためにデモンストレーションするのは、ノバスコシア州ハリファックスのプロテオフォームサイエンティフィックのシニアサイエンティストであるZiheng DangとVictoria Millerです。 ピペット 90マイクロリットルの粒子状遊離タンパク質溶液をポリプロピレンマイクロ遠心チューブに入れます。次に、10マイクロリットルの1モル塩化ナトリウム水溶液と400マイクロリットルのアセトンをサンプル溶液に加え、キャップをしてバイアルを軽くたたき、溶媒を混ぜ合わせます。バイアルがそれをインキュベートするのを待ちます。インキュベーション後最低2分間室温で乱されず、バイアルの向きに注意してサンプルを遠心分離し、室温で10, 000 RCF以上で最低2分間スピンします。遠心分離後、チューブの底部に目に見える白いペレットが観察されます。この時点で、チューブのキャップを外し、チューブを反転させて上層を廃棄物容器にデカントします。ペーパータオルを使用して、バイアルから残留溶媒を引き出します。サンプルを含むSDSの場合。ペレットを乱すことなく、400マイクロリットルの新鮮なアセトンを慎重に分注します。バイアルを最初のスピンと同じ向きでローターに入れることにより、室温で10, 000倍G以上で1分間サンプルを直ちに遠心分離します。前述のように洗浄溶剤を数えます。キャップを開けた状態でサンプルを約1分間乾燥させます。ドラフト内で、ペレット可溶化の前。100マイクロリットルのタンパク質溶液をポリプロピレンバイアルに分注します。ドラフトに、400マイクロリットルのメタノールを追加し、続いて100マイクロリットルのクロロホルムを追加します。バイアルとボルテックスを短時間キャップして混合します。300マイクロリットルの水をバイアルの中央に直接すばやく分注します。バイアルにキャップをし、ポリプロピレンバイアルを遠心分離機に入れ、室温で10, 000倍G以上で5分間回転させた後、1分間邪魔されずにベンチトップに座らせます。バイアルは、2つの溶媒層および約45度でバイアルまで目に見える白いペレットを有することが観察される。バイアル内にビーズが形成されるまで、最初に1ミリリットルの大きなマイクロピペットチップを使用して、後で200マイクロリットルのピペットチップを使用して、上層から約700マイクロリットルの溶媒を均一な速度で除去します。バイアルの側面に溶媒を分注することにより、ペレットを乱すことなく400マイクロリットルの新鮮なメタノールをサンプルバイアルに追加します。バイアルにキャップをし、バイアルを静かに揺らして溶媒を一緒に渦巻かせて溶媒層を結合します。室温で10, 000倍G以上で最低10分間ローター遠心分離機でバイアルの配向に注目して白色タンパク質ペレットを観察する。ペレットを下に向けてバイアルを傾けます。バイアルの上端に沿ってピペットチップを置き、1ミリリットルのマイクロピペットチップで上清をゆっくりと均一な速度で除去します。約20マイクロリットルの溶剤を保持します。残留溶剤をヒュームフード内で乾燥させます。タンパク質を沈殿させる。使い捨てのろ過カートリッジを使用して、プラグを上部のろ過カートリッジに取り付けます。90マイクロリットルのタンパク質溶液10マイクロリットルの1モルアクア、塩化ナトリウム、400マイクロリットルのアセトンを混ぜ合わせます。ベンチトップで最低2分間インキュベートし、室温 G.At 2, 500倍で2分間ろ過カートリッジに取り付けられたプラグで調製したタンパク質サンプルを遠心分離し、カートリッジを裏返し、ネジを外してカートリッジベースからプラグを取り外します。ろ過カートリッジを清潔なバイアル遠心分離機に入れ、タンパク質サンプルを室温で500倍Gで3分間行います。下部バイアルから溶媒の流れを捨てます。ろ過カートリッジに400マイクロリットルのアセトンを加えてタンパク質ペレットを洗浄し、室温で500倍Gで3分間遠心分離するか、上部カートリッジに溶媒がなくなるまで遠心分離します。以前に実証されたタンパク質沈殿プロトコルに従います。タンパク質ペレットの再可溶化のための再可溶化プロトコルに進む直前に、2〜5マイクロリットルのISOプロパノールを膜に直接分注することにより、ろ過カートリッジの基部で膜を濡らしてタンパク質を再可溶化し、水中のギ酸の80体積体積溶液を調製する。この酸性溶液を摂氏マイナス20度で事前に冷却し、沈殿したタンパク質を含むろ過カートリッジを冷却します。50マイクロリットルの冷希釈ギ酸を冷やしたカートリッジキャップとボルテックスに30秒間分注します。ろ過カートリッジを摂氏マイナス20度で10分間冷凍庫に戻します。前の渦とインキュベーションのステップを繰り返します。最終容量500マイクロリットルに450マイクロリットルの水を加えます。ギ酸を8%に希釈カートリッジを裏返し、ネジを外してカートリッジベースからプラグを取り外し、SPEカートリッジをバイアルに取り付けます。室温の遠心分離機でSPEカートリッジを通してタンパク質を800倍Gで5分間回転させます。 上部カートリッジに溶媒が残っている場合は、カートリッジを遠心分離機に戻し、スピンを繰り返します。300マイクロリットルの5%アセトニトリルと0.1%のTFAを水中でSPEカートリッジに加えてすすぎ、SPEカートリッジを2000倍Gで2分間流し、低分子量タンパク質または消化ペプチドを300マイクロリットル流してサンプルを溶出します。50%アセトニトリルと0.1%のTFAを2、500倍のG.Forで5分間インタクトタンパク質。300マイクロリットルの75%アセトニトリルと0.1%トリフルオロ禁欲酸を使用した追加の溶出ステップでフォローアップします。得られた2つの抽出物を結合します。この図は、使い捨てフィルターカートリッジ内のバイアルベースまたはタンパク質の沈殿後のSDS枯渇を比較しています。従来の迅速およびCMWプロトコルでアセトンを使用する。すべてのアプローチは、最適な質量分析を可能にするためにSDSを低減します。この図は、処理された酵母全細胞溶解物のSDSページ分析による急速なアセトン沈殿およびCMW沈殿による定量的タンパク質回収を示しています。すべての沈殿プロトコルで一貫した回収率が得られました。使い捨てろ過カートリッジでの沈殿により、メンブレンフィルターの上に凝集タンパク質を保持しながら、上清を含むSDSを注意深くピペットでピペットで固定する必要がなくなります。したがって、3つの独立した反復にわたる上清画分に目に見えるバンドは検出されませんでした。カートリッジベースのタンパク質沈殿は、バイアルベースの沈殿と比較して、ウシ血漿のペプシン消化サンプルの優れた回収率を示します。塩化ナトリウムを使用し、亜鉛溶媒を使用した場合、カートリッジには収率のより有意な違いが認められ、最高の収率が得られました。この図は、使い捨てフィルターカートリッジで処理されたサンプルのより高いペプチド存在量を反映する1を超える比率で、各ペプチドサンプルからのペプチドピーク強度を定量化します。この図は、3つの反復サンプル調製物間でタンパク質あたりの同定されたペプチドの数を比較しています。これらのグラフの0.94〜0.95の相関係数は、ボトムアップ質量分析のためのサンプル調製アプローチの高い一貫性を示しています。したがって、そのペレットが形成されたら、それを邪魔することを避けたいのです。無傷のペレットとして保管すると、歩留まりが向上します。したがって、そのペレットを余分なアセトンで洗うことを忘れないでください。これにより、サンプルを可能な限りクリーンに保つSDSを取り除き、最高の質量分析が可能になります。そのため、サンプルをピペットで固定するよりも、反転させて余分な溶媒を除去する方がはるかに簡単であることがわかりました。このようにして、より一貫した歩留まりが得られます。室温でアセトン沈殿を行うと、冷凍庫での従来の沈殿よりも一貫性があり、迅速な回収が得られました。

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Chemistry

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学ぶ有機溶媒ベースのタンパク質沈殿法で、質量分析に先立つ堅牢なプロテオーム精製を実現します。高速処理と高回収率を両立し、ボトムアップおよびトップダウンプロテオミクスワークフローに最適です。

質量分析に先立つ堅牢なプロテオーム精製のための有機溶媒ベースのタンパク質沈殿

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