2つの上皮細胞株における2つの内因性イオンチャネルのハイスループット機能研究のための膜電位の蛍光ベースのアッセイ(英語)
2022年6月22日
このプロトコルは、膜電位の変化を測定することによって電気発生膜タンパク質を研究するための方法を記載しています。このアッセイは、上皮細胞株で内因的に発現する複数のイオンチャネルの機能的読み出しのためのプラットフォームを提供します。
蛍光ベースの膜電位アッセイは、上皮細胞で内因的に発現するイオンチャネルに対するモジュレーターの効果を研究するための堅牢な方法を提供します。概念実証として、よく知られている上皮細胞株における2つのイオンチャネルの機能を測定しています。このアッセイは、外因性の化学プローブを使用してイオンチャネル機能を測定するため、汎用性が高く、遺伝的にコードされたプローブの必要性を回避します。
これらのハイスループットアッセイは、嚢胞性線維症の治療を進歩させる可能性のあるイオンチャネルに対する低分子モジュレーターの効果を同定し、特徴付けることができます。まず、EMEMを含むT75フラスコでCalu-3およびCaco-2細胞を、20%ウシ胎児血清および1%ペニシリンストレプトマイシンとともに培養します。細胞が80〜100%コンフルエントに達した後、T75フラスコから培地を吸引します。
細胞を10ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水で穏やかに洗浄します。次に、2ミリリットルの予熱した0.25%トリプシンを0.1%EDTAとともに細胞単層に加えます。フラスコを摂氏37度で約5分間置きます。
このステップでは、細胞がフラスコ表面から浮き上がり、単一細胞懸濁液に解離することを確認します。8ミリリットルの培養液を加えて反応を中和する。細胞が30〜40%コンフルエントに達したら、1.5ミリリットルの細胞懸濁液をコニカルチューブ内の18.5ミリリットルの培養培地に加え、混合します。
この細胞懸濁液を200マイクロリットルを96ウェルプレートの各ウェルに加え、ウェルあたり約140, 000細胞を得る。1枚のフル384ウェルプレートをプレートするには、1ミリリットルの細胞懸濁液をコニカルチューブ内の17ミリリットルの培養培地に加えて、ウェルあたり約50, 000個の細胞を得る。混合後、50マイクロリットルの細胞懸濁液を各ウェルに加える。
2日ごとに培地を交換し、すべてのウェルで同時に細胞が3〜5日以内に100%コンフルエントに達するようにします。機能研究の24時間前に培地を交換してください。まず、テキストプロトコルに記載されている試薬を使用して、ナトリウムフリー、塩化物フリーの緩衝液を調製します。
試薬を組織培養グレードの二重蒸留水に加えます。室温で一晩攪拌して試薬を溶解させます。溶液が安定したら、1モルのNMDG溶液を滴下してpHを7.4に調整します。
30分間混合し、溶液の浸透圧をキログラムあたり300プラスマイナス5ミリモルの範囲に調整します。緩衝液をろ過し、滅菌ボトルに保管します。次に、0.5ミリグラムの膜電位色素を1ミリリットルのナトリウムフリー、塩化物フリーのバッファーに溶解し、溶液を摂氏37度に温めます。
Calu-3およびCaco-2細胞単層から培地を除去します。96ウェルプレートの場合はウェルあたり195マイクロリットル、384ウェルプレートの場合はウェルあたり95マイクロリットルの色素溶液を追加します。細胞が摂氏37度と5%二酸化炭素で35分間色素をロードできるようにします。
次に、530ナノメートルで励起し、560ナノメートルで発光して蛍光測定を行います。最初に、30秒間隔で5分間連続したベースライン読み取りを行います。次いで、5マイクロリットルの400マイクロモルのフォルスコリン溶液を96ウェルプレートの各ウェルに添加し、1マイクロモルの最終フォルスコリン濃度を得た。
384ウェルプレートの場合、5マイクロリットルの20マイクロモルフォルスコリン溶液を追加します。15秒間隔で測定して20分間刺激評価を行います。次に、CFTR阻害剤の400マイクロモル溶液を5マイクロリットルを96ウェルプレートに加え、終濃度10マイクロモルを得た。
384ウェルプレートに、5マイクロリットルの200マイクロモルCFTR阻害剤を添加する。30秒間隔で測定しながら、15分間抑制測定値を取得します。各ウェルの蛍光強度測定値を定量化し、値をスプレッドシートとしてエクスポートします。
個々のウェルを含むカラム形式で。フォルスコリン誘発性変化を計算するには、96ウェルプレートの各ウェルからの相対蛍光単位測定値をベースライン測定値の最後の蛍光強度測定値で割り、それらをプロットします。フォルスコリン刺激中にベースラインから測定された最大蛍光強度としてピーク応答を測定します。
この測定値または曲線下面積を使用して、CFTR応答を定量化します。CFTR機能は、Caco-2細胞におけるフォルスコリン刺激後の膜脱分極として検出された。フッ化物流出は、ビヒクル対照としてのDMSOと比較して蛍光の急激な増加として検出された。
フォルスコリン刺激後、蛍光シグナルはCFTR阻害剤を添加するまで持続し、その後蛍光強度が急速に低下した。この現象は、Caco-2細胞とCalu-3細胞の両方で再現可能でした。CFTR活性は、フォルスコリンまたはDMSO刺激後の蛍光の最大変化の差として計算した。
個々のポイントは、フォルスコリン刺激およびDMSOコントロールの場合の平均からプラスマイナス3標準偏差の範囲であり、アッセイの再現性を示しています。機能応答の特異性を確認するために、これらの膜電位アッセイは、Ussingチャンバーなどの従来の電気生理学的方法を使用してさらに検証できます。このプラットフォームは、ハイスループットモジュレータースクリーンと異種発現システムとの間のギャップ、およびアクセスが困難な一次組織における時間のかかる生体電気測定を埋めることができます。
概要
この研究では、上皮細胞株における電源膜タンパク質、特にイオンチャネルの機能を評価するために設計された蛍光ベースの膜電位アッセイを紹介します。Calu-3とCaco-2細胞を使用し、この方法はイオンチャネル調節の高スループット分析を可能にし、嚢胞性線維症の治療応用の可能性を強調しています。
主要な研究構成要素
研究分野
- 電気生理学
- 細胞膜電位アッセイ
- イオンチャネル調節
背景
- イオンチャネルの高スループットスクリーニング方法
- 小分子調節剤がCFTR機能に与える影響
- 生物医学研究における上皮細胞株の利用
使用した方法
- 膜電位の蛍光ベース測定
- 上皮細胞株: Calu-3とCaco-2
- 薬理学的薬剤（フォルスコリンとCFTR阻害剤）を使用したアッセイ
主要な結果
- フォルスコリン刺激によって、CFTR活性を示す蛍光の測定可能な変化が誘導されました
- 蛍光信号は両方の細胞株で再現性を示しました
- 特定の阻害剤の使用によってCFTR機能の阻害が確認されました
結論
- 開発されたアッセイは、高スループット形式でイオンチャネル活性を効果的に評価します
- この方法は、一次組織における調節剤スクリーニングと電気生理学的測定を橋渡しするのに貢献します
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-throughput fluorescence-based membrane potential assays enable robust functional evaluation of endogenous ion channels in tissue-relevant epithelial cell lines. This platform advances predictive confidence in modulator screening by providing quantitative, reproducible readouts in physiologically relevant systems. The approach supports early-stage target validation and de-risks downstream portfolio decisions for ion channel drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of CFTR and ENaC channels in native epithelial contexts.
- Supports biological de-risking by measuring endogenous channel activity without genetic modification.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and modulator effects.
Screening & Assay Development
- Delivers high-throughput, plate-based assay readiness for compound screening campaigns.
- Provides standardized, quantitative fluorescence outputs for reliable comparison across wells and plates.
- Enables reproducible evaluation of small molecule modulators in scalable formats.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional readouts with disease-relevant epithelial models for translational continuity.
- Bridges high-throughput screening with confirmatory electrophysiological validation in primary tissues.
- Supports risk-adjusted advancement of candidate modulators toward preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
This fluorescence-based assay integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical evaluation for ion channel modulators.
- Discovery Biology: Quantifies membrane potential changes to test mechanistic hypotheses and clarify channel function.
- Screening: Provides reproducible, scalable assay outputs suitable for high-throughput compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence data enabling statistical comparison of modulator effects.
- Translational Research: Maintains disease relevance by using endogenous channels in epithelial cell lines.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible platform adaptable to additional ion channel targets and cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in ion channel studies.
- Operational Value: Standardizes assay protocols for reproducibility and scalability across discovery teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency in early-stage screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of modulators for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence assay design and quantitative data analysis.
- Needs access to high-throughput plate readers and compatible fluorescence detection infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell culture and assay protocols for reproducibility.
- May require adaptation for different epithelial models or additional ion channel targets.
- Validation with orthogonal electrophysiological methods is recommended for specificity confirmation.
