Name: 2つの上皮細胞株における2つの内因性イオンチャネルのハイスループット機能研究のための膜電位の蛍光ベースのアッセイ(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 学ぶ蛍光ベースの膜電位アッセイを用いて、Calu-3およびCaco-2上皮細胞株における内因性イオンチャネルの高スループット機能解析を行う方法。この技術は囊胞性線維症治療薬のスクリーニングに貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、CFTRとENaCを測定する膜電位アッセイの実施に協力してくれた病気の子供のための病院のChristopher FladdとSPARC BioCentreに感謝したいと思います。この作業は、CFITカナダとシックキッズ財団から提供された資金提供を受けて、CFITプログラムによってサポートされました。この研究は、Genome CanadaとOntario Genomics Institute(OGI-148)を通じてカナダ政府から資金提供を受けた。この研究はオンタリオ州政府によって資金提供されました。S.X.は、カナダ消化器病学会(CAG)博士号奨学金の支援を受けました。

1. 細胞のプレーティングと分化
<ol><li>20%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン-ストレプトマイシン(ペン/ストレプ)を含むEMEMでCalu-3およびCaco-2細胞をT-75フラスコに培養します。</li>
	<li>細胞が80〜100%のコンフルエントに達したら、T-75フラスコから培地を吸引します。</li>
	<li>細胞を10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回穏やかに洗浄します。</li>
	<li>2 mLの予熱した0.25%トリプシン/0.1%EDTAを細胞単層に加え、T-75フラスコを37°Cで約5分間置いて、細胞を培養フラスコ表面から持ち上げ、解離させて単一細胞懸濁液にします。</li>
	<li>細胞がフラスコ表面から持ち上げられたら、8 mLの培養液で反応を中和し(ステップ1.1)、合計10 mLの細胞懸濁液を入れます。 注:10 mLの血清学的ピペットを使用して、細胞凝集塊を単一細胞懸濁液に機械的に解離します。</li>
	<li>細胞を96ウェルプレート(~140,000-150,000細胞/ウェル)または384ウェルプレート(~45,000-50,000細胞/ウェル)に30-40%のコンフルエントでプレートします。<ol><li>1枚のフル96ウェルプレートをプレートするには、50 mLコニカルチューブ内の18.5 mLの培養液に1.5 mLの細胞懸濁液を加えます。混合後、200μLの細胞懸濁液を各ウェルに加える。</li>
		<li>1枚のフル384ウェルプレートをプレートするには、50 mLコニカルチューブ内の17 mLの培養液に1 mLの細胞懸濁液を加えます。混合後、50μLの細胞懸濁液を各ウェルに加える。 注:細胞の塊がなく、単一細胞が各ウェルに均等に分布していることを確認してください。</li>
	</ol></li>
	<li>メッキ後2日ごとに培地を交換してください。細胞が異なるウェル間で同時にコンフルエントに達しない場合は、プレートを廃棄し、手順1.5を繰り返します。</li>
	<li>播種したら、細胞が3〜5日以内に100%コンフルエントに達するのを待ちます。機能研究の24時間前に培地を交換してください。</li>
</ol>2. CFTRファンクショナルアッセイバッファー溶液の調製
<ol><li>ナトリウムフリー、塩化物フリーの緩衝液を 、表1に示す試薬で調製します。</li>
	<li>試薬を組織培養グレードの二重蒸留H 2 O(ddH2O)に加える。室温で一晩攪拌することにより、試薬を溶解させます(蒸発を避けるために密閉容器に入れます)。</li>
	<li>溶液が安定したら、pHを測定します。溶液のpHが7.4を超える場合は、1 M N-メチル-D-グルカミン(NMDG)溶液を滴下してpHを7.4に調整します。 注意: 溶液は塩化物を含まないままでなければならないため、HClで溶液のpHを調整しないでください。</li>
	<li>溶液をさらに30分間混合し、溶液の浸透圧を測定します。<ol><li>緩衝液の浸透圧を300 ± 5 mOsm/kgの生理学的範囲に下げます。</li>
	</ol></li>
	<li>緩衝液をろ過し、滅菌ボトルに保管します。 注:溶液は4°Cで最大6か月間保存できます。6ヶ月以上保存する場合は、使用前に室温でpHと浸透圧を確認してください。</li>
</ol>3. CFTRファンクショナルアッセイ
<ol><li>膜電位色素をナトリウムフリー、塩化物フリーの緩衝液(色素0.5 mg/緩衝液1 mL)に溶解し、37°Cに温めます。 注意: 膜電位染料粉末を光にさらさないでください。</li>
	<li>Calu-3またはCaco-2細胞単層から培養液を取り出し、色素含有溶液を各ウェルに加えます(96ウェルプレートの場合はウェルあたり195 μL、384ウェルプレートの場合はウェルあたり95 μL)。 注:384ウェルプレートのウェルあたり最大112 μLを追加できます。</li>
	<li>細胞に色素を37°Cおよび5%CO2で35分間ロードさせます。</li>
	<li>色素溶液をロードした細胞を蛍光プレートリーダーに移動します。プレートの底面から蛍光測定を行い、励起 = 530 ± 5 nm、発光 = 560 ± 5 nm</li>
	<li>5秒間隔で30分間連続ベースライン測定値を取得することから始めます。</li>
	<li>フォルスコリンまたはDMSOの低濃度溶液5 μLを各ウェルに加え、最終濃度1 μMのフォルスコリン(1x)にします。15秒間隔で測定しながら、20分間刺激測定値を取得します。<ol><li>96ウェルプレートフォーマットの場合、1 mMフォルスコリン(1,000倍)ストック溶液またはDMSOを48 μLのナトリウムフリー、塩化物を含まない緩衝液で2 μLに希釈して、フォルスコリンの低濃度(40 μMフォルスコリン(1:25希釈))溶液を調製します。 注:低濃度の40 μMフォルスコリンに続いて、次のステップで2回目の希釈(1:40希釈)を行い、最終濃度1 μMフォルスコリンにします。</li>
		<li>384ウェルプレートフォーマットの場合、1 μLの1 mM(1,000倍)フォルスコリンストック溶液またはDMSOを49 μLのナトリウムフリー、塩化物を含まない緩衝液で希釈して、低濃度(20 μMフォルスコリン(1:50希釈))溶液を調製します。 注:低濃度の20 μMフォルスコリンに続いて、次のステップで2回目の希釈(1:20希釈)を行い、最終濃度1 μMフォルスコリンにします。</li>
	</ol></li>
	<li>CFTRInh172の低濃度溶液5 μLを加えて、最終濃度10 μM CFTRInh172にします。30秒間隔で測定しながら、15分間抑制測定値を取得します。<ol><li>96ウェルプレートフォーマットの場合、10 mM CFTRInh172(1,000倍)ストック溶液2 μLを48 μLのナトリウムフリー、塩化物を含まない緩衝液で希釈することにより、CFTRInh172低濃度(400 μM CFTRInh172(1:25希釈))溶液を調製します。 注:低濃度の400 μM CFTRInh172に続いて、次のステップで2回目の希釈(1:40希釈)を行い、最終濃度10 μM CFTRInh172にします。</li>
		<li>384ウェルプレートフォーマットの場合、10 mM CFTRInh172(1,000x)ストック溶液1 μLを49 μLのナトリウムフリー、塩化物を含まない緩衝液で希釈することにより、CFTRInh172低濃度(200 μM CFTRInh172(1:50希釈))溶液を調製します。 注:低濃度の200 μM CFTRInh172に続いて、次のステップで2回目の希釈(1:20希釈)を行い、最終濃度10 μM CFTRInh172にします。</li>
	</ol></li>
	<li>各ウェルの蛍光強度測定値を定量化し、個々のウェルを含むカラム形式のスプレッドシートとして値をエクスポートします。フォルスコリン誘発性変化を計算するには、96ウェルまたは384ウェルプレートの各ウェルからのRFU(相対蛍光単位)測定値をベースライン測定値の最後の蛍光強度測定値で割り、それらをプロットします。<ol><li>あるいは、CFTRInh172媒介阻害応答を定量化して、CFTR機能の特異性をよりよく確認する12、フォルスコリンによる急性治療は、SLC26A912などの他の塩化物チャネルの活性を介した膜脱分極をもたらす可能性がある。</li>
	</ol></li>
	<li>フォルスコリン刺激中のベースラインからの最大蛍光強度測定値としてピーク応答を測定します。この測定値または曲線下面積を使用して、CFTR応答を定量化します。</li>
</ol>4. ENaC機能アッセイバッファー溶液調製
<ol><li>表2に記載されている試薬を使用して、塩化物を含まない高ナトリウム緩衝溶液を調製します。</li>
	<li>溶液が安定したら、pHを測定します。溶液のpHが7.4未満の場合は、1 N NaOH溶液を滴下してpHを7.4に調整します。 注意: 溶液は塩化物を含まないままでなければならないため、HClで溶液のpHを調整しないでください。</li>
	<li>緩衝液の浸透圧を300 ± 5 mOsm/kgの生理学的範囲に下げます。</li>
	<li>緩衝液をろ過し、4°Cの滅菌ボトルに最大6か月間保存します。 注意: 保管が6か月を超える場合は、使用前に室温でpHと浸透圧を確認してください。</li>
</ol>5. ENaC機能アッセイ
<ol><li>膜電位色素を塩化物を含まない高ナトリウム緩衝液(色素0.5mg/緩衝液1mL)に溶解し、37°Cに加温します。 注意: 膜電位染料粉末を光にさらさないでください。</li>
	<li>Calu-3またはCaco-2細胞単層から培養液を取り出し、色素含有溶液を各ウェルに加えます(96ウェルプレートの場合はウェルあたり195 μL、384ウェルプレートの場合はウェルあたり95 μL)。 注意: 染料溶液を光にさらさないでください。</li>
	<li>細胞に37°Cおよび5%CO2で35分間色素をロードさせます。</li>
	<li>色素溶液をロードした細胞を蛍光プレートリーダーに移動します。プレートの底部から蛍光測定値を読み取り、励起= 530 ± 5 nm、発光= 560 ± 5 nm。</li>
	<li>5秒間隔で30分間連続ベースライン測定値を取得することから始めます。</li>
	<li>ENaC機能を阻害するには、高ナトリウム、ゼロ塩化物緩衝溶液に溶解した低濃度溶液アミロリドまたは低濃度溶液DMSOを最終濃度10 μMのアミロリドに添加します。<ol><li>96ウェルプレートフォーマットの場合、10 mMアミロリド(1,000x)ストック溶液2 μLを48 μLの塩化ナトリウムフリー緩衝液で希釈して、低濃度(400 μMアミロリド(1:25希釈))溶液を調製します。 注:低濃度の400 μMアミロリドに続いて、次のステップで2回目の希釈(1:40希釈)を行い、最終濃度10 μMのアミロリドにします。</li>
		<li>384ウェルプレートフォーマットの場合、塩化物を含まない高ナトリウム緩衝液49 μLに1 μLの10 mMアミロリド(1,000倍)ストック溶液を加えて、アミロリドの低濃度(200 μMアミロ化物(1:50希釈))溶液を調製します。 注:低濃度の200 μMアミロリドに続いて、次のステップで2回目の希釈(1:20希釈)を行い、最終濃度10 μMのアミロリドにします。</li>
	</ol></li>
	<li>45秒間隔で測定しながら、60分間抑制測定値を取得します。</li>
	<li>データ分析のためにステップ 3.7 を繰り返します。</li>
	<li>アミロリド添加後約15〜20分で、ベースラインからプラトー点までの阻害率としてアミロリド反応を測定します。.この差を使用して、ENaC応答を定量化します。</li>
</ol>

<ol><li>Ahmadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+profiling+of+CFTR+modulators+in+patient-derived+respiratory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Genomic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Phenotypic profiling of CFTR modulators in patient-derived respiratory epithelia.</a> NPJ Genomic Medicine. 2, 12(2017).</li>
<li>Xia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+functional+analysis+of+CFTR+and+other+apically+localized+proteins+in+iPSC-derived+human+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">High-throughput functional analysis of CFTR and other apically localized proteins in iPSC-derived human intestinal organoids.</a> Cells. 10 (12), 3419(2021).</li>
<li>Jiang, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+platform+for+high-throughput+therapy+testing+on+iPSC-derived+lung+progenitor+cells+from+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A new platform for high-throughput therapy testing on iPSC-derived lung progenitor cells from cystic fibrosis patients.</a> Stem Cell Reports. 16 (11), 2825-2837 (2021).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Embryonic+Kidney+293+Cells%3A+a+vehicle+for+biopharmaceutical+manufacturing%2C+structural+biology%2C+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%2C+Tissues%2C+Organs%22%5BJournal%5D)">Human Embryonic Kidney 293 Cells: a vehicle for biopharmaceutical manufacturing, structural biology, and electrophysiology.</a> Cells, Tissues, Organs. 205 (1), 1-8 (2018).</li>
<li>Hadida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+N-%282%2C4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl%29-4-oxo-1%2C4-dihydroquinoline-3-carboxamide+%28VX-770%2C+ivacaftor%29%2C+a+potent+and+orally+bioavailable+CFTR+potentiator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (23), 9776-9795 (2014).</li>
<li>Chen, M. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+optimization+of+novel+high-throughput+assays+for+human+epithelial+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Validation and optimization of novel high-throughput assays for human epithelial sodium channels.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (2), 242-253 (2015).</li>
<li>Maitra, R., Sivashanmugam, P., Warner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+membrane+potential+assay+to+monitor+CFTR+function+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A rapid membrane potential assay to monitor CFTR function and inhibition.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1132-1137 (2013).</li>
<li>Mall, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ENaC+inhibition+in+cystic+fibrosis%3A+potential+role+in+the+new+era+of+CFTR+modulator+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">ENaC inhibition in cystic fibrosis: potential role in the new era of CFTR modulator therapies.</a> European Respiratory Journal. 56 (6), 2000946(2020).</li>
<li>Moore, P. J., Tarran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial+sodium+channel+%28ENaC%29+as+a+therapeutic+target+for+cystic+fibrosis+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Therapeutic+Targets%22%5BJournal%5D)">The epithelial sodium channel (ENaC) as a therapeutic target for cystic fibrosis lung disease.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 22 (8), 687-701 (2018).</li>
<li>Stutts, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+as+a+cAMP-dependent+regulator+of+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels.</a> Science. 269 (5225), 847-850 (1995).</li>
<li>Merkert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+for+modulators+of+CFTR+activity+based+on+genetically+engineered+cystic+fibrosis+disease-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening for modulators of CFTR activity based on genetically engineered cystic fibrosis disease-specific iPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (6), 1389-1403 (2019).</li>
<li>Bertrand, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CFTR+trafficking+mutation+F508del+inhibits+the+constitutive+activity+of+SLC26A9%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The CFTR trafficking mutation F508del inhibits the constitutive activity of SLC26A9.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (6), 912-925 (2017).</li>
<li>Frelin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amiloride+and+its+analogs+as+tools+to+inhibit+Na%2B+transport+via+the+Na%2B+channel+the+Na%2B%2FH%2B+antiport+and+the+Na%2B%2FCa2%2B+exchanger%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Amiloride and its analogs as tools to inhibit Na+ transport via the Na+ channel the Na+/H+ antiport and the Na+/Ca2+ exchanger.</a> Biochimie. 70 (9), 1285-1290 (1988).</li>
<li>Di Paola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC6A14+is+a+genetic+modifier+of+cystic+fibrosis+that+regulates+Pseudomonas+aeruginosa+attachment+to+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">SLC6A14 is a genetic modifier of cystic fibrosis that regulates Pseudomonas aeruginosa attachment to human bronchial epithelial cells.</a> mBio. 8 (6), 02073(2017).</li>
<li>Schiavi, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthetic+and+growth+abnormalities+are+associated+with+high-level+expression+of+CFTR+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Biosynthetic and growth abnormalities are associated with high-level expression of CFTR in heterologous cells.</a> American Journal of Physiology. 270, 341-351 (1996).</li>
<li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+ciliated+cholangiocytes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Generation of functional ciliated cholangiocytes from human pluripotent stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 6504(2021).</li>
<li>Lu, C., Pribanic, S., Debonneville, A., Jiang, C., Rotin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PY+motif+of+ENaC%2C+mutated+in+Liddle+syndrome%2C+regulates+channel+internalization%2C+sorting+and+mobilization+from+subapical+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The PY motif of ENaC, mutated in Liddle syndrome, regulates channel internalization, sorting and mobilization from subapical pool.</a> Traffic. 8 (9), 1246-1264 (2007).</li>
</ol>

著者は競合する利益を宣言しません。

ここでは、上皮性大腸癌細胞株Caco-2およびヒト上皮性肺癌細胞株Calu-3におけるCFTRおよびENaC活性を測定するための蛍光ベースの方法について説明しました。上皮細胞株におけるこれらの膜電位アッセイは、初代患者由来の上皮培養における最終的な in vitro 検証の前に、異種発現系で以前に同定された低分子モジュレーター化合物の有効性を確認するために使用できます。 
上記の測定値が関心のあるチャネルに適切に起因することを確認することが不可欠です。例えば、CFTRに起因する測定は、CFTRタンパク質発現およびフォルスコリンおよび阻害剤CFTRInh-172によって調節される塩化物の電気化学的駆動力への依存性を示すはずである。同様に、10 μMアミロライドによって引き起こされる膜電位の変化は、ENaCタンパク質の発現と内向きのナトリウム駆動力に依存している場合、ENaCに起因する可能性があります。我々は、ENaC 2の3つのサブユニットすべてでトランスフェクションした後、MDCK細胞におけるENaCのこれらの特性を確認しましたが、Caco-2およびCalu-3細胞で測定されたアミロリド応答がENaCによって付与されることはまだ正式に確認されていません。アミロリドはENaC13に加えてナトリウム - プロトン交換体NHE3の機能を調節することができるので、これは特に重要である。おそらく、このアッセイで観察されたアミロリド誘発過分極は、他のチャネルに対する細胞内酸性化の間接的な影響を部分的に反映している可能性があります。.この膜電位感受性色素を用いて測定したアミロリド誘発過分極が、上記の細胞株やiPS細胞由来組織などのより複雑な細胞系においてENaCによって付与されることを確認するために、これらの系統の偏性ENaCサブユニット(β)をノックアウトすることにより、この活性が失われることを確認しています。
これらのアッセイの成功には、いくつかの要因に注意を払う必要があります。第一に、上皮培養物はコンフルエントでよく分化していなければなりません。CFTRおよびENaC機能の測定には、96ウェルプレートではウェルあたり約145,000細胞、384ウェルプレートではウェルあたり約45,000セルをプレーティングする必要があります。上皮細胞がコンフルエントに達したら(メッキから3〜4日以内)、2〜5日間の分化を待ちます。このタイミングは、イムノブロッティングによる最大CFTRタンパク質発現に基づいて予め決定した14。同様に、Calu-3およびCaco-2の両方の細胞株における機能的ENaC発現について最適なタイミングが決定された。 
非コンフルエントな単分子膜または細胞の異常増殖は、技術的な反復全体での再現性の低下につながります。個々のウェル内の細胞が同時にコンフルエントに達しない場合は、これらのプレートを廃棄する必要があります。さらに、不安定なベースライン測定値または刺激応答の欠如は、細胞品質の低下を示している可能性があり、分析から除外する必要があります。CFTRアクチベーターであるフォルスコリン、またはENaC阻害剤であるアミロリドに対する応答の低下は、過剰に継代された細胞の使用を反映している可能性があります15。Calu-3およびCaco-2細胞では問題ではありませんが、他の細胞または組織がプレートにうまく接着しない可能性があり、ウェルのプレコーティングが必要になる場合があります。例えば、以前の研究では、2D胆管細胞培養物をコラーゲンコーティング16を用いてプレートに付着させた。あるいは、2D腸組織の接着を、Poly-L-リジン2を用いて増加させた。 
さらに、蛍光ベースのアッセイを用いて低分子によるイオンチャネルの調節を試験する際には、低分子の蛍光特性によって生じる潜在的なアーチファクトに対処することが重要である。機能的応答の特異性を確認するために、膜電位アッセイは、Ussing研究17などの従来の電気生理学的方法を使用してさらに検証することができる。 
膜電位感受性色素によって検出される応答が目的のチャネルによって特異的に付与されることを確認した後、これらのアッセイは、関連する細胞状況において上皮イオンチャネルの有望なモジュレーターを検証する大きな可能性を秘めています。このプラットフォームは、異種発現システムにおけるハイスループットモジュレータースクリーンと、アクセスが困難な一次組織における時間のかかる生体電気測定との間のギャップを埋めることができます。

組換えチャネルタンパク質の蛍光ベースのハイスループット活性アッセイは、将来の治療法になる可能性のある低分子モジュレーターを特定するのに非常に効果的です1、2、3、4。イオンチャネルモジュレーター用の低分子ライブラリーをスクリーニングする一般的な方法の1つは、膜電位の変化を測定することです。典型的には、これらのスクリーニングは、HEK-293細胞5、6、7などの細胞株において異質に発現する組換えチャネルを用いて実施される。
ただし、関連する細胞型における「ヒット」の検証が必要です。我々は、目的のチャネルを内因的に発現する関連細胞株における二次スクリーニングが望ましいことを提案する。このような二次スクリーニングは、アクセスしにくい一次ヒト組織に依存する最終検証アッセイにおいて有効である可能性が最も高いモジュレーターを特定するであろう。
また、同じ組織タイプ内の複数のイオンチャネルターゲットの活性を報告する柔軟性を備えたアッセイシステムも必要です。たとえば、CFTRとENaCが機能的に相互作用するという概念を支持する実質的な公開文献があります8,9,10。いくつかのよく研究された上皮細胞株がCFTRおよびENaCの両方を発現することが知られているが、今日まで、両方をハイスループット様式で研究するためのアッセイ条件は記載されていない。
この蛍光ベースの膜電位アッセイは、CFTRおよびENaCの機能を測定するために外因性の化学プローブを採用し、遺伝的にコードされたプローブの必要性をバイパスするため、用途が広い11。原理の証明として、CFTRとENaCの両方のチャネル活性を測定するために必要な重要なステップを強調するために、一般的に使用される2つの上皮細胞株が例として研究されています。

<table><tbody><tr><td>Amiloride</td><td>Spectrum Chemical</td><td>TCI-A2599-5G</td><td>DMSO に溶解し、-20 °Cで保存。C</td></tr><tr><td>CFTRInh-172</td><td>CF Foundation Therapeutics</td><td></td><td>DMSOに溶解し、-20°Cで保存。C</td></tr><tr><td>EMEM、1xs</td><td>Wisent</td><td>320-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Wisent</td><td>080-450</td><td></td></tr><tr><td>FLIPR 膜電位色素</td><td>分子デバイス</td><td>R8042</td><td>4 °C;C</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3917</td><td>DMSOに溶解し、-20°Cで保存。C</td></tr><tr><td>グルコン酸ラクトンまたは(D-(+)-グルコン酸 &delta;-ラクトン)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4750</td><td>室温で保存</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Bioshop</td><td>HEP001.5</td><td>室温で保存</td></tr><tr><td>ヒト気管支腺癌細胞株 (Calu-3)</td><td>ATCC</td><td>HTB-55</td><td></td></tr><tr><td>ヒト上皮結腸直腸腺癌細胞株 (Caco-2)</td><td>ATCC</td><td>HTB-37</td><td></td></tr><tr><td>N-メチル-D-グルカミン (NMDG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>室温で保存</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液</td><td>Wisent</td><td>450-200-EL</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td> <td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>グルコン酸カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1847</td><td>室温で保存</td></tr><tr><td>グルコン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9005</td><td>室温で保存</td></tr></tbody></table>

2つの上皮細胞株における2つの内因性イオンチャネルのハイスループット機能研究のための膜電位の蛍光ベースのアッセイ(英語)

A Fluorescence-Based Assay of Membrane Potential for High-Throughput Functional Study of Two Endogenous Ion Channels in Two Epithelial Cell Lines

蛍光ベースの研究は、培養中の細胞のハイスループットプレートリーダーアッセイに適しています。これらは、HEK-293細胞などの細胞で過剰発現している組換えイオンチャネルタンパク質を標的とする創薬キャンペーンに一般的に使用されています。しかし、低分子介入の効果を研究するための組織関連細胞株の使用にますます重点が置かれています。以下のプロトコルは、上皮細胞株において内因的に発現されるイオンチャネルの研究のための蛍光ベースの膜電位アッセイの適応を記載する。膜電位アッセイでは、一般的に研究されている2つの上皮細胞株であるCaco-2とCalu-3における嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)の塩化物チャネル活性のハイスループットアッセイについて詳しく説明しています。さらに、この論文では、同じ上皮細胞株でハイスループットフォーマットで上皮ナトリウムチャネル(ENaC)の活性を測定するためのこのシステムの新しいアプリケーションについて説明します。これらの蛍光ベースのアッセイを組み合わせることで、低分子モジュレーターを研究するための堅牢で柔軟なプラットフォームが提供され、関連する細胞コンテキストで2つの上皮チャネルを標的としています。

CFTRチャネル活性を測定するために、高分化した接着細胞を、膜電位感受性色素を含むゼロ塩化物細胞外溶液中でインキュベートする。CFTR機能は、フォルスコリン刺激後の膜脱分極として一貫して検出されます。 塩化物流出は、ビヒクル制御と比較して蛍光の急激な増加として検出される。蛍光シグナルはCFTR阻害剤(CFTRInh172)を添加するまで持続し、Caco-2細胞で見られるように蛍光強度の急速な低下をもたらし(図1A)、Caco-2細胞とCalu-3細胞の両方で再現性があります(図1B)。フォルスコリンまたはDMSO(ビヒクル)後の蛍光の最大変化の差としてのCFTR活性の評価。個々の点は±平均フォルスコリン刺激(黒点)またはDMSO対照(灰色点)から3標準偏差の範囲であり、Z'係数0.586に対応していた。この優れたスコアは、このアッセイの再現性を示した(図1C)。ベースラインに軽微なドリフトがある場合、活性化後、阻害剤添加点までのトレース全体でベースラインを外挿することにより、ドリフトの影響を最小限に抑えることができます。応答は曲線下の面積として定量化でき、下限は外挿された線で定義されます。
ENaC活性は、96ウェルプレートで増殖したコンフルエントな気道および結腸上皮細胞においても測定することができる。CFTRチャネル活性のアッセイとは対照的に、これらの細胞は高ナトリウム含有溶液に沈められ、ENaCを介したナトリウム吸収を可能にします。アミロリドの急性添加により、ナトリウムの取り込みが遮断され、細胞は相対的な膜過分極を経験する。これは、低濃度(10 μM)(図2A)と高濃度(50 μM)の両方のCaco-2細胞(図2A、B)と、高濃度のアミロリド(50 μM)のCalu-3細胞(図2B)で示されています。ENaCアッセイは384ウェルプレートフォーマットに拡張され、ENaC阻害において高い再現性を示しました。同様に、個々の点は、平均アミロリド阻害(黒点)またはDMSO対照(灰色点)から±3標準偏差の範囲であった。Calu-3細胞におけるENaC応答は、アミロライド(50μM)を用いた急性治療で0.629のZ'係数を報告し(図2C)、これらのパラメータがハイスループットスクリーニングをサポートすることを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63528/63528fig01.jpg"> 図1:Caco-2およびCalu-3細胞における膜脱分極の変化としてのCFTRチャネル測定 。 (A)Caco-2細胞におけるフォルスコリン(1 μM)およびDMSOコントロールによるCFTR刺激の代表的な痕跡。(B)Caco-2およびCalu-3細胞におけるフォルスコリン刺激のボックスおよびウィスカープロット(**** P &lt; 0.0001、n &gt; 3生物学的反復、n &gt; 3技術的反復)。生物学的複製は独立した細胞株継代です。テクニカルレプリケートとは、マルチウェルプレートの独立したウェルを指します。箱ひげ図は中央値を表します。境界はIQRを表し、ウィスカは最小値と最大値を定義します。(C)Caco-2細胞におけるDMSOコントロールと比較したフォルスコリン刺激による再現可能なCFTR応答のブランド-アルトマンプロット。黒い点は、フォルスコリン刺激に応答した蛍光の最大絶対変化を表します。灰色の点は、DMSO制御に応答した蛍光の変化を表す。略語:CFTR =嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター;DMSO = ジメチルスルホキシド;IQR =四分位範囲;Fsk = フォルスコリン;ΔF/F0 = 蛍光の変化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63528/63528fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63528/63528fig02.jpg"> 図2:Caco-2およびCalu-3細胞における膜過分極によるENaC阻害測定。 (A)Caco-2細胞におけるDMSOコントロールに対するアミロライド(10 μM)によるENaC阻害の代表的な痕跡。(B)Caco-2およびCalu-3細胞におけるアミロライド阻害のボックスおよびウィスカープロット(**** P &lt; 0.0001、n &gt; 3生物学的複製、n &gt; 3技術的複製)。(C)Calu-3細胞におけるDMSOコントロールと比較したアミロリド阻害による再現可能なENaC応答のブランド-アルトマンプロット。黒い点は、アミロライド阻害に応答した蛍光の最大絶対変化を表す。灰色の点は、DMSO制御に応答した蛍光の変化を表す。略語:ENaC =上皮ナトリウムチャネル;DMSO = ジメチルスルホキシド;アミル。=アミロリド;ΔF/F0 = 蛍光の変化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63528/63528fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>名前</td>
			<td>濃度</td>
		</tr><tr><td>NMDG(N-メチル-D-グルカミン)</td>
			<td>150ミリメートル</td>
		</tr><tr><td>グルコン酸ラクトン</td>
			<td>150ミリメートル</td>
		</tr><tr><td>グルコン酸カリウム</td>
			<td>3ミリメートル</td>
		</tr><tr><td>ヘペス</td>
			<td>10ミリメートル</td>
		</tr></tbody></table>表1:ゼロナトリウムおよび塩化物を用いたCFTR機能アッセイのための試薬およびそれに対応する濃度。 略語:CFTR =嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>名前</td>
			<td>濃度</td>
		</tr><tr><td>グルコン酸ナトリウム</td>
			<td>150ミリメートル</td>
		</tr><tr><td>グルコン酸カリウム</td>
			<td>3ミリメートル</td>
		</tr><tr><td>ヘペス</td>
			<td>10ミリメートル</td>
		</tr></tbody></table>表2:高ナトリウム、ゼロ塩化物を含むENaC機能アッセイバッファーの試薬およびそれに対応する濃度。 略称:ENaC =上皮性ナトリウム(Na)チャネル。

このプロトコルは、膜電位の変化を測定することによって電気発生膜タンパク質を研究するための方法を記載しています。このアッセイは、上皮細胞株で内因的に発現する複数のイオンチャネルの機能的読み出しのためのプラットフォームを提供します。

Fluorescence-based studies are suitable for high-throughput plate reader assays of cells in culture. They have been commonly employed for drug discovery ...

蛍光ベースの膜電位アッセイは、上皮細胞で内因的に発現するイオンチャネルに対するモジュレーターの効果を研究するための堅牢な方法を提供します。概念実証として、よく知られている上皮細胞株における2つのイオンチャネルの機能を測定しています。このアッセイは、外因性の化学プローブを使用してイオンチャネル機能を測定するため、汎用性が高く、遺伝的にコードされたプローブの必要性を回避します。これらのハイスループットアッセイは、嚢胞性線維症の治療を進歩させる可能性のあるイオンチャネルに対する低分子モジュレーターの効果を同定し、特徴付けることができます。まず、EMEMを含むT75フラスコでCalu-3およびCaco-2細胞を、20%ウシ胎児血清および1%ペニシリンストレプトマイシンとともに培養します。細胞が80〜100%コンフルエントに達した後、T75フラスコから培地を吸引します。細胞を10ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水で穏やかに洗浄します。次に、2ミリリットルの予熱した0.25%トリプシンを0.1%EDTAとともに細胞単層に加えます。フラスコを摂氏37度で約5分間置きます。このステップでは、細胞がフラスコ表面から浮き上がり、単一細胞懸濁液に解離することを確認します。8ミリリットルの培養液を加えて反応を中和する。細胞が30〜40%コンフルエントに達したら、1.5ミリリットルの細胞懸濁液をコニカルチューブ内の18.5ミリリットルの培養培地に加え、混合します。この細胞懸濁液を200マイクロリットルを96ウェルプレートの各ウェルに加え、ウェルあたり約140, 000細胞を得る。1枚のフル384ウェルプレートをプレートするには、1ミリリットルの細胞懸濁液をコニカルチューブ内の17ミリリットルの培養培地に加えて、ウェルあたり約50, 000個の細胞を得る。混合後、50マイクロリットルの細胞懸濁液を各ウェルに加える。2日ごとに培地を交換し、すべてのウェルで同時に細胞が3〜5日以内に100%コンフルエントに達するようにします。機能研究の24時間前に培地を交換してください。まず、テキストプロトコルに記載されている試薬を使用して、ナトリウムフリー、塩化物フリーの緩衝液を調製します。試薬を組織培養グレードの二重蒸留水に加えます。室温で一晩攪拌して試薬を溶解させます。溶液が安定したら、1モルのNMDG溶液を滴下してpHを7.4に調整します。30分間混合し、溶液の浸透圧をキログラムあたり300プラスマイナス5ミリモルの範囲に調整します。緩衝液をろ過し、滅菌ボトルに保管します。次に、0.5ミリグラムの膜電位色素を1ミリリットルのナトリウムフリー、塩化物フリーのバッファーに溶解し、溶液を摂氏37度に温めます。Calu-3およびCaco-2細胞単層から培地を除去します。96ウェルプレートの場合はウェルあたり195マイクロリットル、384ウェルプレートの場合はウェルあたり95マイクロリットルの色素溶液を追加します。細胞が摂氏37度と5%二酸化炭素で35分間色素をロードできるようにします。次に、530ナノメートルで励起し、560ナノメートルで発光して蛍光測定を行います。最初に、30秒間隔で5分間連続したベースライン読み取りを行います。次いで、5マイクロリットルの400マイクロモルのフォルスコリン溶液を96ウェルプレートの各ウェルに添加し、1マイクロモルの最終フォルスコリン濃度を得た。384ウェルプレートの場合、5マイクロリットルの20マイクロモルフォルスコリン溶液を追加します。15秒間隔で測定して20分間刺激評価を行います。次に、CFTR阻害剤の400マイクロモル溶液を5マイクロリットルを96ウェルプレートに加え、終濃度10マイクロモルを得た。384ウェルプレートに、5マイクロリットルの200マイクロモルCFTR阻害剤を添加する。30秒間隔で測定しながら、15分間抑制測定値を取得します。各ウェルの蛍光強度測定値を定量化し、値をスプレッドシートとしてエクスポートします。個々のウェルを含むカラム形式で。フォルスコリン誘発性変化を計算するには、96ウェルプレートの各ウェルからの相対蛍光単位測定値をベースライン測定値の最後の蛍光強度測定値で割り、それらをプロットします。フォルスコリン刺激中にベースラインから測定された最大蛍光強度としてピーク応答を測定します。この測定値または曲線下面積を使用して、CFTR応答を定量化します。CFTR機能は、Caco-2細胞におけるフォルスコリン刺激後の膜脱分極として検出された。フッ化物流出は、ビヒクル対照としてのDMSOと比較して蛍光の急激な増加として検出された。フォルスコリン刺激後、蛍光シグナルはCFTR阻害剤を添加するまで持続し、その後蛍光強度が急速に低下した。この現象は、Caco-2細胞とCalu-3細胞の両方で再現可能でした。CFTR活性は、フォルスコリンまたはDMSO刺激後の蛍光の最大変化の差として計算した。個々のポイントは、フォルスコリン刺激およびDMSOコントロールの場合の平均からプラスマイナス3標準偏差の範囲であり、アッセイの再現性を示しています。機能応答の特異性を確認するために、これらの膜電位アッセイは、Ussingチャンバーなどの従来の電気生理学的方法を使用してさらに検証できます。このプラットフォームは、ハイスループットモジュレータースクリーンと異種発現システムとの間のギャップ、およびアクセスが困難な一次組織における時間のかかる生体電気測定を埋めることができます。

a-fluorescence-based-assay-membrane-potential-for-high-throughput

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、イオンチャンネルの機能上の単一の点変異の効果を研究する方法を説明します。...

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

Gタンパク質依存性内向き整流Kと相互作用する薬剤を同定するためのリアルタイムスクリーニングの手順...

GIRKチャネルのモジュレーターを同定するための蛍光スクリーニングアッセイ

このビデオは、哺乳類細胞における原形質膜の再封鎖効率を研究するためのアッセイを示しています。細胞は細菌の細孔形成毒素にさらされ、細胞膜に細孔を形成します。細胞外カルシウムイオンの存在下では、細孔がカルシウムの流入を引き起こし、膜の再封入イベントを誘発します。再封止効率は、DNA結合性ヨウ化プロピジウム色素を用いて評価されますが、これは再密封された膜がない細胞にのみ入ります。...

原形質膜の再封止効率を測定するためのin vitro蛍光ベースのアッセイ

このビデオは、マウスの脳動脈セグメントの内皮細胞における細胞内カルシウムレベルと膜電位の変化を同時に測定する方法を示しています。単離された内皮チューブには蛍光カルシウムインジケーターが充填され、細胞内カルシウム放出を誘導する薬剤で治療され、膜電位が変化します。インジケーターの蛍光性によりカルシウムレベルの測定が可能となり、細胞内に記録電極を挿入して膜電位の変化を測定します。...

マウス脳内皮における細胞内カルシウム電位と膜電位の同時測定

尿細管上皮細胞で発現するイオンチャネルは、多発性嚢胞腎疾患の病理において重要な役割を果たす。ここでは、新たにげっ歯類の腎臓から単離された胆嚢上皮におけるパッチクランプ分析を行うために使用される実験プロトコルおよび細胞内カルシウムレベルの測定を説明します。...

新たに単離したPKD上皮の機能的特性を監視するためにパッチクランプし、ライブ蛍光顕微鏡を実装

遺伝的にコード化された電圧指標を使用して膜電位の変化をイメージングする方法が説明されています。...

遺伝的にコードされた蛍光電圧センサーの2種類のイメージング膜電位

継承された不整脈は、しばしば、一つ以上のイオンチャネルの表面の配信を変更する突然変異によって引き起こされます。ここでは、TSA-201細胞で発現された組換えイオンチャネルの相対的な合計および細胞表面タンパク質発現の定量化を提供するために、フローサイトメトリーアッセイを適合させます。...

フローサイトメトリーを用いた組換えイオンチャネルの相対的な細胞表面および合計式の決意

ここで細胞の蛍光イメージング解析による効率を再封止膜を測定する高スループット蛍光を用いた測定について述べる。この試金は、薬や哺乳類細胞における原形質膜を再シールするターゲット遺伝子をスクリーニングするために使用できます。...

哺乳類細胞における効率を再封止膜の高スループット測定

ここで説明は、(1) たてそのまま脳血管内皮「チューブ」と内皮細胞のカルシウムと膜内皮由来過分極電位 (2) 同時計測を隔離するためのプロトコルです。さらに、これらのメソッド内皮細胞カルシウムと個々...

細胞内カルシウムと新鮮な分離とそのままマウス脳血管内皮細胞の膜電位の同時計測

このプロトコルは、細胞環境において受容体に結合するアデニンヌクレオチドをリアルタイムで測定する方法を提示する。結合は、トリニトロフェニルヌクレオチド誘導体と非標準的な蛍光アミノ酸で標識されたタンパク質との間のフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)として測定されます。...

インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定

ここでは、高速モジュラーフォトメトリーシステムを用いた誘導多能性幹細胞由来心筋細胞からの作用電位の光学的獲得および特性評価について述べている。...

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

学ぶ蛍光ベースの膜電位アッセイを用いて、Calu-3およびCaco-2上皮細胞株における内因性イオンチャネルの高スループット機能解析を行う方法。この技術は囊胞性線維症治療薬のスクリーニングに貢献します。

2つの上皮細胞株における2つの内因性イオンチャネルのハイスループット機能研究のための膜電位の蛍光ベースのアッセイ(英語)

さらに動画を探す