Name: 細胞DNA損傷を評価するためのハイスループットコメットアッセイアプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 学ぶ ハイスループットコメットアッセイ法による細胞DNA損傷評価。25サンプルを同時処理し、ゲル保護と冷却電気泳動を組み合わせた遺伝毒性研究の効率化手法です。

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この出版物で報告された研究は、部分的に、国立衛生研究所の国立環境衛生科学研究所によって賞番号1R41ES030274でサポートされました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

<ol><li>Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+DNA+damage%3A+mechanisms%2C+mutation%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease.</a> The FASEB Journal. 17 (10), 1195-1214 (2003).</li>
<li>Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogens+and+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Carcinogens and DNA damage.</a> Biochemical Society Transactions. 46 (5), 1213-1224 (2018).</li>
<li>Evans, M. D., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+contributing+to+the+outcome+of+oxidative+damage+to+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Factors contributing to the outcome of oxidative damage to nucleic acids.</a> Bioessays. 26 (5), 533-542 (2004).</li>
<li>Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+DNA+damage+and+disease%3A+induction%2C+repair+and+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Mutatation+Research%22%5BJournal%5D)">Oxidative DNA damage and disease: induction, repair and significance.</a> Mutatation Research. 567 (1), 1-61 (2004).</li>
<li>Miyamae, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+lesions+induced+by+chemical+mutagens+using+the+single-cell+gel+electrophoresis+%28comet%29+assay.+2.+Relationship+between+DNA+migration+and+alkaline+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Mutatation+Research%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA lesions induced by chemical mutagens using the single-cell gel electrophoresis (comet) assay. 2. Relationship between DNA migration and alkaline condition.</a> Mutatation Research. 393 (1-2), 107-113 (1997).</li>
<li>Angelis, K. J., Dusinská, M., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+gel+electrophoresis%3A+detection+of+DNA+damage+at+different+levels+of+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Single cell gel electrophoresis: detection of DNA damage at different levels of sensitivity.</a> Electrophoresis. 20 (10), 2133-2138 (1999).</li>
<li>Duarte, T. L., Cooke, M. S., Jones, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+reveals+new+protective+roles+for+vitamin+C+in+human+skin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling reveals new protective roles for vitamin C in human skin cells.</a> Free Radical Biology & Medicine. 46 (1), 78-87 (2009).</li>
<li>Karbaschi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+cells+from+apoptosis+increases+DNA+repair+in+UVB+exposed+cells%3A+implications+for+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Research%22%5BJournal%5D)">Rescue of cells from apoptosis increases DNA repair in UVB exposed cells: implications for the DNA damage response.</a> Toxicology Research. 4 (3), 725-738 (2015).</li>
<li>Wu, J. H., Jones, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+DNA+interstrand+crosslinks+using+the+modified+alkaline+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessment of DNA interstrand crosslinks using the modified alkaline comet assay.</a> Methods in Molecular Biology. 817, 165-181 (2012).</li>
<li>Merk, O., Speit, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+crosslinks+with+the+comet+assay+in+relationship+to+genotoxicity+and+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Detection of crosslinks with the comet assay in relationship to genotoxicity and cytotoxicity.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 33 (2), 167-172 (1999).</li>
<li>Spanswick, V. J., Hartley, J. M., Hartley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+DNA+interstrand+crosslinking+in+individual+cells+using+the+Single+Cell+Gel+Electrophoresis+%28Comet%29+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of DNA interstrand crosslinking in individual cells using the Single Cell Gel Electrophoresis (Comet) assay.</a> Methods in Molecular Biology. 613, 267-282 (2010).</li>
<li>Saha, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+DNA+repair+capacity+in+whole+blood+of+patients+with+head+and+neck+cancer+and+healthy+donors+by+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Quantification of DNA repair capacity in whole blood of patients with head and neck cancer and healthy donors by comet assay.</a> Mutation Research. 650 (1), 55-62 (2008).</li>
<li>Giovannelli, L., Pitozzi, V., Riolo, S., Dolara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+DNA+breaks+and+oxidative+damage+in+polymorphonuclear+and+mononuclear+white+blood+cells%3A+a+novel+approach+using+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutatation+Research%22%5BJournal%5D)">Measurement of DNA breaks and oxidative damage in polymorphonuclear and mononuclear white blood cells: a novel approach using the comet assay.</a> Mutatation Research. 538 (1-2), 71-80 (2003).</li>
<li>Al-Salmani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+method+for+the+collection%2C+storage%2C+and+comet+assay+analysis+of+DNA+damage+in+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Simplified method for the collection, storage, and comet assay analysis of DNA damage in whole blood.</a> Free Radical Biology & Medicine. 51 (3), 719-725 (2011).</li>
<li>Akor-Dewu, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucocytes+isolated+from+simply+frozen+whole+blood+can+be+used+in+human+biomonitoring+for+DNA+damage+measurement+with+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Function%22%5BJournal%5D)">Leucocytes isolated from simply frozen whole blood can be used in human biomonitoring for DNA damage measurement with the comet assay.</a> Cell Biochemistry and Function. 32 (3), 299-302 (2014).</li>
<li>Ge, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CometChip%3A+a+high-throughput+96-well+platform+for+measuring+DNA+damage+in+microarrayed+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">CometChip: a high-throughput 96-well platform for measuring DNA damage in microarrayed human cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e50607(2014).</li>
<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Reseach+Communications%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Reseach Communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Karbaschi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+major+steps+in+the+conventional+protocol+for+the+alkaline+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the major steps in the conventional protocol for the alkaline comet assay.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 6072(2019).</li>
<li>Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+the+high-throughput+processing+of+slides+for+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay.</a> Scientific Reports. 4 (1), 7200(2014).</li>
<li>Karbaschi, M., Cooke, M. S. Chilling apparatus. USA patent. , 10690574 (2020).</li>
<li>Cooke, M. S., Karbaschi, M. Method and apparatus for performing electrophoresis. USA patent. , 20160195494 (2019).</li>
<li>Ji, Y., Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+infection+of+cultured+cells+induces+oxidative+stress+and+attenuates+cellular+base+excision+repair+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutatation+Research%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma infection of cultured cells induces oxidative stress and attenuates cellular base excision repair activity.</a> Mutatation Research. 845, 403054(2019).</li>
<li>Møller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+Information+for+Reporting+on+the+Comet+Assay+%28MIRCA%29%3A+recommendations+for+describing+comet+assay+procedures+and+results%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Minimum Information for Reporting on the Comet Assay (MIRCA): recommendations for describing comet assay procedures and results.</a> Nature Protocols. 15 (12), 3817-3826 (2020).</li>
<li>Almeida, G. M., Duarte, T. L., Steward, W. P., Jones, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+oxaliplatin-induced+DNA+crosslinks+in+vitro+and+in+cancer+patients+using+the+alkaline+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Detection of oxaliplatin-induced DNA crosslinks in vitro and in cancer patients using the alkaline comet assay.</a> DNA Repair (Amst). 5 (2), 219-225 (2006).</li>
<li>Moneef, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+using+the+alkaline+comet+assay+predict+bladder+cancer+cell+radiosensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Measurements using the alkaline comet assay predict bladder cancer cell radiosensitivity.</a> British Journal of Cancer. 89 (12), 2271-2276 (2003).</li>
<li>Bowman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay+measures+of+DNA+damage+are+predictive+of+bladder+cancer+cell+treatment+sensitivity+in+vitro+and+outcome+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Comet assay measures of DNA damage are predictive of bladder cancer cell treatment sensitivity in vitro and outcome in vivo.</a> International Journal of Cancer. 134 (5), 1102-1111 (2014).</li>
<li>Abdulwahed, A. M. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Investigation+of+DNA+Damage+and+Genomic+Organization+in+the+Cellular+Response+to+Platinum+Chemotherapy%22">Investigation of DNA Damage and Genomic Organization in the Cellular Response to Platinum Chemotherapy</a>. , Florida International University. Doctor of Philosophy thesis (2020).</li>
<li>Olive, P. L., Banáth, J. P., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+radiation-induced+DNA+damage+and+repair+in+tumor+and+normal+cells+measured+using+the+%26%2334%3Bcomet%26%2334%3B+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the &#34;comet&#34; assay.</a> Radiation Research. 122 (1), 86-94 (1990).</li>
<li>Kumaravel, T. S., Vilhar, B., Faux, S. P., Jha, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+Assay+measurements%3A+a+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Comet Assay measurements: a perspective.</a> Cell Biology and Toxicology. 25 (1), 53-64 (2009).</li>
<li>Ji, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Formation+and+Repair+of+Environmetally-induced+damage+to+Mitochondrial+and+Nuclear+Genomess%22">Formation and Repair of Environmetally-induced damage to Mitochondrial and Nuclear Genomess</a>. , Florida International University. Doctor of Philosophy thesis (2020).</li>
</ol>

クック博士とカルバスキ博士は、ここに記載されている技術に関連する3つの特許の発明者です。

この研究は、現在の装置によって提供される汎用性を実証しており、コメットアッセイのさまざまな代表的な一般的なバリアント(すなわち、アルカリ、酵素修飾、血液、およびICL、およびその他のバリアントも適しています)でハイスループットを達成するために使用できます。さらに、本アプローチはいくつかの利点をもたらす20,21:(a)複数のスライドを並行して操作することによりアッセイの実行時間が短縮される(処理時間が60%減少する)。(b)ゲルの損傷のリスク、したがって実験のリスクが減少します。(c)試薬要件が減少している(例えば、電気泳動タンクの容積が従来のタンクよりも小さい)。(d)スライドの実行数が増えます。1つのタンクは、単一の従来のタンクと比較して、実行されるスライドの数を20%増加させることができます。ただし、複数の電気泳動タンクを同じ電源から並列に実行またはスレーブ化(つまり、単一の電源によって制御される複数のタンク)することができ、製氷皿を備えた単一の従来のタンクよりも小さいベンチトップフットプリントが必要です。(e)スライドの垂直方向と一体型冷却により、タンクの設置面積が減少します(ラボスペースを節約)。HTPタンクは、冷蔵室でプロセスを実行することなく最適なバッファ温度を維持するために1つの凍結冷却パックを収めることができるスライド式引き出しを備えた高性能セラミック冷却ベースで構成されています。
さらに、当社が開発した冷却プレートは、26枚のコメットスライドを収容し、コメットアッセイスライド上の低融点アガロースの迅速な凝固を可能にし、アガロースゲルが固化した後のスライドの取り出しを容易にします。上記の革新により、コメットアッセイプロセスがより簡単かつ簡単になります。
他のハイスループットアプローチ(12ゲルコメットアッセイ、CometChip、96ミニゲルフォーマットなど)が開発されていますが25、多くの科学者は従来の顕微鏡スライド(市販のプレコートスライド、またはその他の特殊なスライドを含む)の使用を好みます。現在のアプローチは、あらゆる種類の顕微鏡スライドに対応できるため、これらのスライドを使用した実験は、スライドの処理と処理を高速化してスケールアップできます。上記のように、HTPコメットシステムは多くの利点をもたらしますが、1つの注目すべき制限があります:現在のアプローチは、従来の水平タンクと比較して、実行されるサンプルの数の20%の増加しか提供しません(スライドの処理ははるかに高速ですが)。コメットチップと96ミニゲルフォーマットは、より多くのサンプルを実行します。これまでのところ、現在のアプローチがCometChipまたは96ミニゲルフォーマットに対応できるかどうかはわかりませんが、対応できると予測しています。上記のように、タンクを単一の電源に奴隷化することで、サンプルの数をさらに増やすことができます。すべてのアプローチと同様に、サンプルをロードして顕微鏡で分析している間にゲルが失われたり損傷したりする可能性がありますが、これはオペレーターのエラーによるものであり、現在のアプローチではこの可能性は最小限に抑えられています。
HTPコメットシステムの使用は、DNA損傷の分析に大いに役立ち、分子疫学、男性生殖科学、遺伝毒性学研究、環境毒性学などの幅広いアプリケーションでのコメットアッセイの使用を容易にします。これは、使い慣れた費用対効果の高い従来の顕微鏡スライドから離れることなく、スループットの向上と使いやすさのすべての利点を享受したいユーザーに特に当てはまります。

細胞は、DNAを損傷する可能性のある内部および外部環境から生じる薬剤に継続的にさらされています1,2。この損傷は細胞機能の異常を引き起こす可能性があるため3、DNA損傷は、癌、神経変性疾患、心血管疾患、老化など、多くの主要なヒト疾患の発症に重要な役割を果たす可能性があります4。コメットアッセイ(シングルセルゲル電気泳動とも呼ばれます)は、細胞のDNA損傷を検出および定量するためのますます普及している方法です。
最も単純なアルカリコメットアッセイ(ACA)は、アルカリ条件下で一本鎖切断になるアプリン/アピリミジン部位およびアルカリ不安定部位(ALS)とともに、鎖切断(SB、シングルおよびダブルの両方)を検出します5。中性pHコメットアッセイは、率直な一本鎖および二本鎖の切断を評価することができます6。さらに、ACAは、多数のDNA修復酵素と組み合わせて、かなりの範囲のタイプのDNA損傷、例えば酸化プリン(ヒト8-オキソグアニンDNAグリコシラーゼ1;hOGG17の使用によって同定される)を検出することができる。酸化ピリミジン(エンドヌクレアーゼIIIを使用;EndoIII)およびシクロブタンピリミジン二量体(T4エンドヌクレアーゼVを使用;T4endoV)8.コメットアッセイは、シスプラチン9,10,11などの架橋剤によって誘発されるDNA病変を評価するためにも使用できます。アッセイの正式名称、すなわちシングルセルゲル電気泳動によって示されるように、アッセイは分析中の細胞が単一細胞懸濁液であることに依存しています。最も一般的には、これらは培養細胞であるが全血から単離され得るが12、13、または全血自体を使用することができる14、15。あるいは、固体組織から単一細胞懸濁液を生成してもよい。
いくつかの例外、特にEnglewardラボ16からのCometChipレポートを除いて、全体的なコメットアッセイプロトコルは、アッセイの発明者によって最初に記述されたものから劇的に変更されていません(Östling and Johansson 17およびSingh etal.18)。コメットアッセイには多くのステップが含まれます(図1)。これらのステップの多くは、細胞を含む薄いアガロースゲルを一度に1スライドずつ移動させるため、ゲルの損傷または損失のリスクをもたらし、実験の成功を危うくします。その結果、コメットアッセイは、特にかなりの数のスライドが実行されている場合、時間がかかる可能性があります。通常、最大40枚のスライドが大きな(33 cm x 59 cm x 9 cm)電気泳動タンクで実行され、冷却用のウェットアイスが入ったさらに大きなトレイ内に配置されます。最近、溶解ステップの期間を短縮し、染色前にスライドを乾燥させないことで、アッセイの実行時間を1日に短縮できることが報告されています19。
本著者らは、高スループットアルカリコメットアッセイ(HTP ACA)への新規アプローチを以前に報告しており、そこでは、複数の(25のバッチ)コメットアッセイ顕微鏡スライドを、コメットアッセイプロセス全体を通して同時に操作することができる20、21、22。この特許取得済みのアプローチは、顕微鏡スライドを個別に操作する必要がなくなるため、サンプル含有ゲルの損傷や損失のリスクを最小限に抑え、顕微鏡スライドを使用するコメットアッセイのすべてのバリエーションに適用できます。スライド入りラックは、操作中にゲルを保護し、その結果、サンプル処理がより迅速かつ効率的になります。スライドは、水平方向ではなく垂直方向に保持されたラック内で電気泳動を受けることもできます。これと一体型の冷却により、電気泳動槽の設置面積が大幅に削減され、ウェットアイスが不要になります。まとめると、これは従来の手順よりも大幅に改善されています。使用した機器を図2に示します。ここで説明するプロトコルは、この新しいアプローチを使用して、アルカリ不安定部位(ALS)、DNA鎖間架橋(ICL)、およびさまざまなDNA修復酵素の基質の検出のための培養細胞および全血14への代表的なアプリケーションを実証します。

<table><tbody><tr><td>22 x 22 mmガラスカバースリップ</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH, USA</td><td>631-0124</td><td></td></tr><tr><td>A2780</td><td>ECACC,&nbsp; ルイ、ミズーリ州、 &nbsp;米国</td><td>93112519</td><td></td></tr><tr><td>濃硝酸 (OptimaTM グレード)</td> <td>フィッシャー サイエンティフィック フェア ローン、ニュージャージー州、米国</td><td>A467-250</td><td></td></tr><tr><td>カメラを搭載した蛍光顕微鏡</td><td>ツァイス、イェーナ、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>新鮮なヒト全血</td><td>Zen Bio Inc</td><td>SER-WB10ML</td><td>商業用ヒト全血サンプル</td></tr><tr><td>GraphPad プリズム</td><td>GraphPad ソフトウェア、カリフォルニア州サンディエゴ</td><td></td><td>データ解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>HTP Comet Assay system</td><td>Cleaver Scientific</td><td>COMPAC-&nbsp;50</td><td></td></tr><tr><td>ヒト ケラチノサイト (HaCaTs)</td><td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA</td><td>販売終了</td><td>他社から購入可能 ADDEXBIO TECHNOLOGIES Cat# T0020001</td></tr><tr><td>過酸化水素 (H2O2) 30% 水中</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、ハンプトン、 ニューハンプシャー州,</td><td>米国 BP2633-500</td><td></td></tr><tr><td>ICP-MS iCAP RQ ICP-MS システム</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>IQLAAGGAAQFAQKMBIT</td><td></td></tr><tr><td>画像およびデータ解析ソフトウェア</td><td>Perceptive Instrument, Bury St Edmunds, England, UK</td><td>125525</td><td>ImageJ</td></tr><tr><td>Internal Standard Mix</td><td>SPEX Certiprep, Metuchen、ニュージャージー州、米国</td><td>CL-ISM1-500</td><td>Bismuch (同位体監視 209 Bi)-10 & microのconcnetration;g/mL in 5% HNO3</td></tr><tr><td>Low Melting Point Agarose</td><td>Invitrogen Waltham, MA, USA</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA (エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム)</td> <td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (塩化ナトリウム)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>701-058108</td><td>DNA濃度測定用</td></tr><tr><td>Nanodrop Nanopure Infinity Ultrapure Water System (Barnstead Nanopure)</td><td>Thermo Scientific,&nbsp; Waltham, MA, USA</td><td>D11901</td><td>超純水 (16 M&Omega; cm-1)</td></tr><tr><td>NaOH (水酸化ナトリウム)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Normal melting point Agarose</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH, USA</td><td>16520100</td><td>プレコーティングスライド用</td></tr><tr><td>OCI-P5X</td><td>マイアミ大学, Miami, FL, USA</td><td>N/A</td><td>Live Tumor Culture Core 施設は、細胞プラチナ</td></tr><tr><td>(Pt) 参照標準を提供し</td>ました <td>SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA</td><td>PLPT3-2Y</td><td>(1000 &micro;10% HCl) 含有 Bismuch</td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム (水で 1.0 mg/mL)</td> <td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>12-541BP486410ML</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit</td><td>Qiagen Valencia, CA, USA</td><td>51304</td><td>DNA extraction Kit</td></tr><tr><td>Single-frosted glass microscope slides</td><td>Fisher Scientific, Hampton, ニューハンプシャー州、米国</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>SKOV3</td><td>ECACC、 ルイ、ミズーリ州、 USA</td><td>91091004</td><td></td></tr><tr><td>スライドボックス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、 ハンプトン、ニューハンプシャー州、米国</td><td>03-448-2</td><td>耐光性、形成不定損傷から細胞を保護し、蛍光染料の退色を防ぐ</td></tr><tr><td>スライド冷却プレート</td><td>クリーバーサイエンティフィック、 ラグビー、 イングランド、 英国</td><td>CSL-チルプレート</td><td></td></tr><tr><td>トリートメントディッシュ</td><td>Cleaver Scientific、 ラグビー、イングランド、 UK</td><td>STAINDISH4X</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>Sigma Aldrich、 ミズーリ州セントルイス、 USA</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH, USA</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン EDTA (0.5%)</td><td>Invitrogen Gibco, Waltham, MA, USA</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Slide Carrier</td><td>Cleaver Scientific, Rugby, England, UK</td><td>COMPAC-25</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞dna損傷を評価するためのハイスループットコメットアッセイアプローチ

A High-Throughput Comet Assay Approach for Assessing Cellular DNA Damage

細胞は、内部および外部環境から生じる薬剤に絶えずさらされており、DNAに損傷を与える可能性があります。この損傷は異常な細胞機能を引き起こす可能性があるため、DNA損傷は、おそらく、癌、神経変性疾患、心血管疾患、老化など、すべての主要なヒト疾患の発症に重要な役割を果たす可能性があります。シングルセルゲル電気泳動(すなわち、コメットアッセイ)は、in vitro および in vivo の両方で、広範囲のタイプのDNA損傷(例えば、一本鎖および二本鎖切断、アルカリ不安定部位、DNA-DNA架橋、および特定の修復酵素、酸化プリン、およびピリミジンと組み合わせて)の形成および修復を研究するための最も一般的で高感度な方法の1つです。 システムズ。ただし、従来のアッセイのサンプルスループットが低く、サンプル後処理が面倒なため、可能な限り幅広いアプリケーションが制限されています。彗星の「スコアリング」がますます自動化されるにつれて、制限は現在、かなりの数の彗星スライドを処理する能力です。ここでは、コメットアッセイ(HTPコメットアッセイ)のハイスループット(HTP)バリアントが開発されており、分析されるサンプルの数が大幅に増加し、アッセイの実行時間、個々のスライド操作の数、試薬の要件、およびゲルへの物理的損傷のリスクが減少します。さらに、電気泳動タンクの設置面積は、スライドの垂直方向と一体型冷却により大幅に減少します。また、ここで報告されているのは、コメットアッセイスライドを冷却するための新しいアプローチであり、コメットゲルの固化を便利かつ効率的に促進します。ここでは、代表的なコメットアッセイ法へのこれらの装置の適用について説明した。これらの単純な革新は、コメットアッセイの使用と、曝露生物学、生態毒性学、バイオモニタリング、毒性スクリーニング/試験などの研究分野への応用、および病因の理解を大いにサポートします。

HTP ACAの電気泳動電圧の最適化 ヒトケラチノサイト(HaCaTs;資料表)異なる線量の紫外線A放射線(UVA)を照射した(5または10J / cm2;図6A)、UVB(0.5または1 J / cm2;図6B)、または50μMH2O2で処理して損傷を誘発する(図6C)。電気泳動の3つの異なる電圧をテストして、電気泳動に最適な電圧を決定しました。3つのDNA損傷処理すべての結果から、すべての電圧が線形の線量反応を生成する一方で、最も感度の高い応答は1.19 V / cmで得られたことが明らかになりました。HaCaTは、電気泳動中に1.19 V / cmを使用した場合、1 V / cmおよび1.09 V / cmと比較して最も高いベースラインDNA損傷を示しました(図6A-C)。さらに、1.19 V / cmを使用すると、すべての損傷処理に続いて、最大の%テールDNAが見られます(図6)31。
Fpg修飾HTP ACAを用いたヒト全血中のDNA損傷の検出 ヒトホールド血液(材料表)に異なる用量の10J / cm2 UVAを照射して損傷を誘発した。4つの異なる濃度のFpg(1、2、4または8 U / mL)を使用して、HTP ACAでの酵素処理に最適な濃度を決定しました。結果は、4 U / mL Fpgで最適なレベルのDNA損傷が明らかになったことを示しました(図7A)。UVA照射血液サンプルからの代表的な彗星画像(図7B)。
ICL修飾HTP ACAを用いた代表的な卵巣癌細胞株におけるDNA ICLの検出 卵巣癌細胞株(SKOV-3;資料表)200μMシスプラチンの組み合わせおよび/またはその後の50μM H 2 O2による処理を氷上で30分間処理した。未ばく露細胞には顕著な損傷は認められなかった(図8A)。H2O2単独への曝露は、有意なMOTMを生成した(図8B)。対照的に、ICLが誘導された細胞はMOTMの減少を示した(図8C)28。
代表的な卵巣癌細胞株におけるシスプラチン誘導性DNA ICLの形成と修復 ICL修飾HTP ACAを使用して、卵巣癌細胞株におけるシスプラチンによって誘導されるDNA ICL形成および修復の時間経過を決定しました(A2780; 資料表)。細胞を100 μMシスプラチンで1時間処理した後、シスプラチンフリー培地(10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)を添加したRPMI 1640培地)でその後の経時変化のためにインキュベートしました。さまざまな時点で、ICLのレベルを確立するためにICL修飾HTP ACAが実行されました(図9)28。シスプラチン処理前にICLは検出されなかった。しかし、100 μMシスプラチンによる1回の治療後、ICLレベルは有意に増加し、12時間でピークに達し、その後、レベルは30時間後にゼロに戻りました。
DNA ICLとDNAプラチナレベルの相関 3つの卵巣癌細胞を100 μMシスプラチンで処理して、異なるレベルのDNA-ICLを誘導した後、ICL修飾HTP ACAおよび誘導結合質量分析(ICP-MS;詳細については 補足ファイル を参照)による分析を行いました。 図10に示すように、3つの細胞株では異なるレベルのDNA-ICLが誘導され、DNAでは異なるレベルのPtが誘導されました。DNA ICLレベルとプラチナ濃度との間に正の相関(R2 = 0.9235)が観察され、DNAプラチナレベルと対応するICL28との関連が示された。
マイコプラズマ感染および非感染BE-M17細胞における塩基切除修復 マイコプラズマ感染および非感染BE-M17細胞を50μM H 2 O 2で30分間処理し、完全な培地(10%(v/v)FBSを添加したダルベッコ改変イーグル培地)とともに異なる期間(0分、30分、1時間、2時間、6時間、24時間、または30時間)インキュベートし、その間に細胞を修復させた。各時点で、細胞を回収し、-80°Cで凍結し、10%DMSO含有培地中で、hOGG1修飾HTP ACAを行う前に(ステップ6)。30分後、SB/ALSのレベルは非感染細胞で21%TD(パーセンテージテールDNA)に減少しましたが、感染細胞は49%TDを示しました(図11A)。~15時間後、SB/ALSのレベルは、感染細胞と非感染細胞の両方でベースラインに戻りました。酸化プリン体の場合、感染していないBE-M17は、30時間以内にベースラインに戻る前に、最初は損傷のわずかな増加を示しました(図11B)。対照的に、感染細胞は酸化プリンの持続的で有意な増加を示し、それは上昇したままであり、30時間後もベースラインレベルに戻りませんでした(図11B)23。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63559/63559fig01.jpg"> 図1:従来のアルカリコメットアッセイ手順の概要 。 (i)培養細胞の単一細胞懸濁液または全血サンプルを0.6%(w / v)LMPアガロースと混合します。(ii)セル/アガロース混合物をプレコート顕微鏡スライドに塗布し、固まるまでカバーガラスで覆います。(iii)細胞を高pH溶解バッファーを使用して一晩溶解し、核様体を形成してから、(iv)ddH2Oで洗浄する。 (v)細胞DNAを高pH電気泳動バッファーで巻き戻します。鎖切断の存在は、DNAが弛緩してほどけることを可能にし、そして電気泳動下で、DNAは核様体から引き出されて尾を形成する。次いで、スライドを(vi)排水し、乾燥させ、(vii)中和し、(viii)ddH2Oで洗浄してから(ix)一晩乾燥する。次に、スライドを(x)ddH2Oで再水和し、(xi)染色し、(xii)洗浄し、最後に(xiii)典型的には蛍光顕微鏡および画像解析ソフトウェアを用いてスコアリングおよび分析する。この図は、以前の出版物20から複製されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63559/63559fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63559/63559fig02.jpg"> 図2:ハイスループットコメット電気泳動システムを構成する材料。 HTP電気泳動タンク、HTPラック、および溶解、洗浄、中和、および染色のための皿が示されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63559/63559fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63559/63559fig03.jpg"> 図3:コメットアッセイスライドとHTPラック(顕微鏡スライドキャリア)の代表的な画像 。 (A)正しい向きのために、顕微鏡スライドのプレコート面は、顕微鏡スライドの右隅にある黒い点で認識されます。(B)HTPラックの画像は、スライドが垂直方向にしっかりと保たれ、キャリアにタブを付けて電気泳動タンク内でその向きを固定する方法を示しています。各キャリアは最大25枚のスライドを収容できます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63559/63559fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63559/63559fig04.jpg"> 図4:サンプルスライドとフリーザーパックを所定の位置に置いた冷却プレートの表現。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63559/63559fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63559/63559fig05.jpg"> 図5:スコアリング中に撮影された代表的な彗星のスクリーンショット。 HaCaTs(A)は処理せず、(B)HTP ACAを実施する前に1J / cm2UVB で処理します。ほとんどのソフトウェアパッケージはさまざまな彗星のエンドポイントを計算できますが、最も一般的なものは、これらの画像に基づく%テールDNA(推奨)またはテールモーメントです(青:頭の始まり、緑:頭の中央、紫:尾の終わり)。スケールバーは10μmです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63559/63559fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63559/63559fig06.jpg"> 図6:HTP ACAを用いて決定された、テールDNA百分率に対する電気泳動電圧の影響を示す代表的なグラフ。細胞を、HTP ACAの前に(A)5または10 J/cm 2 UVA、(B)0.5または1.0 J/cm 2 UVB、または(C)50 μM H 2 O 2に、電気泳動電圧を1、1.09、または1.19 V / cmのいずれかで曝露しました。データは、n=2重複実験31からの200回の決定の平均を表す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63559/63559fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63559/63559fig07.jpg"> 図7:Fpg修飾HTP ACAによって分析されたヒト血液の代表的なグラフおよび彗星画像。 ヒト血液サンプルは、溶解ステップの前に氷上に10 J / cm2 UVAまたは偽照射(「ctrl」)を照射しました。電気泳動前の酵素処理には、異なる濃度のFpg(1、2、4、または8 U / mL)を使用しました。 (A) データは、n = 3回の実験からの300回の決定の平均±SEMを表します。 (B) 10J/cm2UVA 照射血液試料中のFpg濃度ごとの彗星の代表的な画像。スケールバーは10μmです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63559/63559fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63559/63559fig08.jpg"> 図8:シスプラチン処理後のICL検出を示す代表的な彗星画像。 (A)何も処理せずにコントロール細胞、(B)H2O2(50μM)のみで処理した細胞、(C)H2O2(50μM)およびシスプラチン(200μM)で処理した細胞、(B)よりも短い尾部、ICL28の存在による。スケールバーは10μmです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63559/63559fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63559/63559fig09.jpg"> 図9:シスプラチン誘発性ICL形成と修復の速度論の実証。 A2780細胞を培養液中の100 μMのシスプラチンで1時間処理した。次いで、シスプラチン含有培地を除去し、ICL修飾HTP ACAによる分析の前に、細胞を様々な時点にわたって培養した。データは、n=3実験28からのSEMの平均±を表す。 P &lt; 0.0001 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63559/63559fig09large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63559/63559fig10v2.jpg"> 図10:DNA ICLと白金濃度の相関。 DNA ICLはICL修飾HTP ACAによって決定され、プラチナレベルは3つの卵巣癌細胞株においてICP-MS(単一四角形運動エネルギー識別、SQ-KED)によって測定された。R2 = 0.9235。DNA28のプラチナレベルを定量するためのICP-MS方法論の補足ファイルを参照してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63559/63559fig10v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63559/63559fig11.jpg"> 図11:マイコプラズマ感染細胞と非感染BE-M17細胞におけるhOGG1修飾コメットアッセイによって決定されたDNA損傷と修復を示す代表的なグラフ。50μMH2O2で30分間処理した後、細胞を異なる期間(0、30分、1時間、2時間、6時間、24時間、または30時間)修復させた。hOGG1修飾HTP ACAは、感染した(赤いデータポイント)および感染していない(黒いデータポイント)BE-M17細胞における(A)SB / ALSおよび(B)酸化プリンを測定するために使用されました。データは、n = 2回の重複実験からの200回の決定の平均を表す。この図は、以前の出版物23からの許可を得て複製されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63559/63559fig11large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>試薬</td>
			<td colspan="2">ストックソリューション</td>
			<td>実用的なソリューション</td>
		</tr><tr><td>溶解バッファー</td>
			<td colspan="2">100 mM Na 2 EDTA、2.5 M NaCl、および ddH2O 中の 10 mM トリス塩基;10 M NaOHでpHを10に調整します</td>
			<td>溶解ストック溶液中の1%トリトンX-100</td>
		</tr><tr><td>電気泳動バッファー</td>
			<td colspan="2">ddH 2 O 中の 10 M NaOH および 200 mMNa2EDTA</td>
			<td>300 mM NaOHおよび1 mM Na2EDTA;pH &gt; 13</td>
		</tr><tr><td>中和バッファー</td>
			<td colspan="2">0.4 m トリス ベース in ddH2O;塩酸でpHを7.5に調整する</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>染色バッファー</td>
			<td colspan="2">1 mg/mL ヨウ化プロピジウム</td>
			<td>2.5 μg/mL ヨウ化プロピジウム ddH2O</td>
		</tr></tbody></table>表1:HTP ACAに使用される試薬の組成。 溶解、電気泳動、中和、および染色バッファーのストック濃度と使用濃度を示します。
補足ファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63559/Supplementary%20information.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

コメットアッセイは、DNA損傷を検出するための一般的な手段です。この研究では、コメットアッセイの代表的なバリアントでスライドを実行するためのアプローチについて説明します。このアプローチにより、サンプル数が大幅に増加し、アッセイの実行時間、スライド操作の回数、およびゲルの損傷のリスクが軽減されました。

細胞DNA損傷を評価するためのハイスループットコメットアッセイアプローチ

Cells are continually exposed to agents arising from the internal and external environments, which may damage DNA. This damage can cause aberrant cell ...

コメットアッセイは、遺伝毒性の評価に広く使用されています。私たちのプロトコルは、標準的なコメットアッセイに比べて多くの方法論的利点を提供します。当社の技術は、標準的な彗星スライドを垂直に保持し、専用のラックで25個のバッチで処理することに重点を置いています。これには電気泳動が含まれるため、タンクは小さく、使用するバッファーが少なく、冷却機能が統合されています。ラックに保持されているため、スライド上の繊細なゲルはより保護され、25秒で溶液から溶液へと移動します。私たちの血液彗星プロトコルを使用すると、研究者は血液のピン刺しを使用して、人間、他の種、およびさまざまな潜在的に遺伝毒性のある環境曝露のDNA損傷を研究できます。顕微鏡スライドをコメットゲルの固体支持体として使用するコメットアッセイのさまざまなフォーマットは、いずれも私たちのアプローチに適しています。この手法の重要な部分は、LMPアガロースと混合した後にサンプルをロードすることです。サンプルは泡を立てずにすばやくロードし、固化する前にすぐにカバースリップで覆う必要があります。まず、PBSで0.6%低融点アガロースを調製し、摂氏37度の水浴に入れます。プレコートされたスライドのつや消しの端に、油性マーカーまたは鉛筆を使用して、名前、日付、および処理情報のラベルを付けます。平らなベンチに冷却プレートを置き、2つの凍結冷却パックを金属表面の下のスライド引き出しに挿入します。次に、スライドを冷却プレートに置き、1〜2分間プレチルします。遠心分離してサンプルチューブから上清を取り除き、すぐに氷上に戻します。セルペレットを200マイクロリットルの0.6%低融点アガロースで再懸濁し、ピペッティングで混合します。次に、80マイクロリットルのアガロース含有細胞を冷やしたスライドに加え、ゲルの上にカバースリップをすばやく置きます。ゲルを冷却プレートに1〜2分間セットします。その間に、溶解バッファーの500ミリリットルの作業溶液を調製し、それを溶解皿に注ぎます。ゲルが固まったら、親指と人差し指でスライドをそっと持ち、カバースリップをゲルからスライドさせて、カバースリップをすばやく取り外します。次に、スライド上のすべての黒い点マークが同じ方向を向くようにスライドキャリア内にスライドを配置します。スライドキャリアを溶解皿の中に置きます。溶解皿の蓋を閉めて、インキュベーションのために置きます。ゲルを乱すことなく、スライドキャリアを溶解皿から慎重に取り外します。スライドキャリアを、氷冷した二重蒸留水があらかじめ入った洗浄皿にそっと置きます。スライドが完全に水没していることを確認し、セットアップを30分間そのままにします。電気泳動タンクの下に凍結冷却パックを置き、最適なバッファー温度を維持します。次に、氷冷電気泳動作業溶液をタンクに加え、スライドキャリアをタンクに移します。細胞含有ゲルがカソードの方を向くようにスライドの向きを合わせます。スライドを電気泳動タンクで20分間インキュベートし、DNAをほどきます。次に、電源を入れて、1.19ボルト/センチメートルで20分間電気泳動を実行します。電気泳動が完了したら、電源を切り、スライドキャリアを電気泳動タンクから取り外します。スライドキャリアをティッシュペーパーに30秒間排出します。次に、スライド担体を中和緩衝液の入った皿に入れ、20分間放置します。これに続いて、氷冷した二重蒸留水を入れた洗浄皿に入れ、20分間放置します。洗浄後、スライドキャリアを水から取り出し、スライドを摂氏37度のインキュベーター内で1時間乾燥させます。スライドをリハイドレートするには、スライドキャリアを氷冷した二重蒸留水を含む洗浄皿に移し、30分間放置します。次いで、スライド担体を、1ミリリットル当たり2.5マイクログラムのヨウ化プロピジウム溶液を含む染色皿に入れる。染色皿の蓋を閉め、室温で暗所で20分間インキュベートします。インキュベーション後、スライド担体を別の皿に移し、氷冷二重蒸留水で20分間洗浄する。スライドキャリアを皿から取り出し、摂氏37度のインキュベーターまたは室温で暗所で完全に乾かします。スライドが完全に乾いたら、画像分析の準備ができるまで暗所のスライドボックスに保管します。ヒトケラチノサイトに異なる用量のUVAおよびUVBを照射するか、または50マイクロモルの過酸化水素で処理してDNA損傷を誘発した。最適な電圧は1.19ボルトセンチメートルで、最も敏感な応答と尾のDNAの最大の割合を誘発します。ヒト全血に異なる用量のUVAを照射し、異なる濃度のFpgで処理した。 ハイスループットアルカリコメットアッセイは、Fpgのミリリットルあたり4単位のDNA損傷の最適レベルが誘発されることを明らかにした。卵巣癌細胞株SK-OV-3をシスプラチンと過酸化水素の組み合わせで処理した。ばく露されていない細胞は損傷を示さなかった。過酸化水素のみへの曝露は、DNA鎖内架橋が誘導された細胞と比較して有意な平均オリーブテールモーメントを生成しました。100マイクロモルのシスプラチンで処理した後、DNA鎖内架橋は12時間でピークで増加し、その後、レベルは30時間後にゼロに減少しました。 電気泳動の前に、アイスパックを電気泳動タンクに入れ、スライドを20分間インキュベートしてDNAを巻き戻すことが不可欠です。このステップは、損傷したDNAが電流で移動するのを助けます。スライドを垂直に配置してアッセイを実行することで、コメットアッセイを自動化することができました。さらに、私たちの技術は研究のための彗星アッセイを簡素化しました。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、ドキソルビシン処理細胞における一本鎖および二本鎖DNA切断を定量するためのアルカリ性単一細胞電気泳動アッセイを実演します。アルカリ性条件では、DNA塩基対間の水素結合が破壊され、DNA鎖が完全にほどかれて分離します。これにより、電気泳動時にアガロースゲル中の損傷していないDNA断片と損傷したDNA断片の異なる移動が可能になり、円形の彗星頭を形成する損傷していないDNA断片がゆっくりと移動し、損傷したDNA断片が細長い彗星尾を形成する彗星型の構造が明らかになります。...

アルカリ性単一細胞ゲル電気泳動:化学療法後の個々の癌細胞におけるDNA損傷の定量的推定のための高感度技術

このビデオは、有害物質にさらされた後のDNA損傷を検出するための彗星アッセイを示しています。アルカリ性条件下では、DNAは巻き戻されて変性し、電気泳動では、損傷していないDNAと損傷したDNAがアガロースゲル内で異なる方法で移動し、彗星状の構造を形成します。ゆっくりと移動する損傷を受けていないDNAは円形の彗星の頭を形成し、急速に移動する損傷したDNA断片は細長い彗星の尾を形成します。...

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