Name: 14CO2トラップによるインビトロでのエネルギー基板酸化の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学ぼう、14CO2トラッピング法によるエネルギー基質酸化の測定方法を。骨組織や各種細胞で代謝動態を評価し、代謝性疾患のメカニズム解明に役立つ実験技術です。

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この作業は、NIH助成金R01 AR060456(FL)によって部分的に支援されました。マイケル・ロビンソン博士とエリザベス・クリズマン博士(フィラデルフィア小児病院)がシンチレーションカウンターを惜しみなく助けてくれたことに感謝します。

放射性物質(RAM)の使用には、各機関の指定安全委員会による事前の承認が必要です。このプロトコルで使用されるRAMは、ペンシルベニア大学のEnvironmental Health &amp; Radiation Safety(EHRS)によって承認されています。動物の使用には、在宅施設の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)による事前の承認が必要です。以下の研究は、フィラデルフィア小児病院でIACUCによって承認された。
1. 14種類のC標識基質用原液の調製
<ol><li>11 gのBSAと33.1 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を混合し、BSAが完全に溶解するまで室温で約3時間穏やかに振とうすることにより、4 mMのウシ血清アルブミン(BSA)ストック溶液を作ります。使用前にBSA原液を70°Cの水浴中で温めてください。</li>
	<li>バイアル瓶内の50μCi 14C-オレイン酸塩(エタノール中50μCi/μmol)を空気乾燥し、指定されたRAM作業フードで蓋を8時間外します。312.5 μLのH2Oを加え、次に3.5 mg (11.5 μmol) のオレイン酸ナトリウムを加える。徹底的に混ぜる。</li>
	<li>得られた溶液を水浴中で70°Cに加温する。予温したBSA原液0.9375mLを加えて、10mMの熱いオレイン酸原液(非標識オレイン酸塩に対する1:11.5の比 の14C-オレイン酸を含む)を得た。原液をアリコートし、長期間使用するために-20°Cで保存する。</li>
	<li>解凍直後に14 C-グルコースと14C-グルタミンを使用してください。</li>
</ol>14C標識基質を含む培地の調製
注:媒体中のエネルギー基質の信頼できる濃度を確保するために、カスタムメイドの媒体は、使用直前に新鮮な基質を添加して使用する必要があります。ここでは、グルコース、ピルビン酸、グルタミン、フェノールレッド、または炭酸水素ナトリウムを含まないカスタムメイドの最小必須培地(MEMα)が使用される。しかしながら、最適な培地は、細胞タイプごとに決定されるべきである。
<ol><li>培地粉末8.67gを精製水1Lで再構成する。2.2gの炭酸水素ナトリウムを加えてpH7.4を達成し、0.22μm真空濾過を用いて溶液を濾過する。</li>
	<li>新鮮な成分を加えて、最終濃度5.5 mMグルコース、2 mMグルタミン、1 mMピルビン酸、および10%ウシ胎児血清(FBS)を含む完全培地(cMEMα)を得た。さらに、cMEMαに100 mM L-カルニチンと10 μM HEPESを補給して脂肪酸酸化を促進します。</li>
	<li>使用直前に、新しく調製したcMEMαに 14個のC標識基質を加えてホットメディアを作ります。オレイン酸ホット培地を作るには、10 mMホットオレイン酸ストック溶液をcMEMαに添加し、終濃度100 μMのオレイン酸塩(1:100希釈、最終放射能0.4 μCi/mL)にします。 注:1:11.5のホット:コールドオレイン酸塩の比率を含む10mMのホットオレイン酸塩ストック(ステップ1.3を参照)は、放射性物質の量を最小限に抑えながら、媒体中の100μMの総オレイン酸塩の生理学的レベルを達成するために使用されます。</li>
	<li>70°Cのウォーターバス中で2mLのH2Oに24.36mgのオレイン酸ナトリウムを加えて10mMの非標識オレイン酸ストックを作り、完全に溶解するまで約20分間、70°Cに予温した6mLの4mM BSAストックと素早く混合する。 37°Cの水浴に1時間移し、0.22μmのフィルターでろ過します。アリコートし、長期間使用するために-20°Cで保存してください。</li>
	<li>グルコースを高温培地にするには、終濃度1.333 μM(1:4,125希釈、最終放射能0.4 μCi/mL)に 14C-グルコースを加えます。グルタミンを高温培地にするには、 14C-グルタミンを終濃度2μM(1:1,000希釈、最終放射能0.4μCi/mL)まで加える。</li>
	<li>グルコースおよびグルタミン高温培地に、ステップ2.4からの非標識オレイン酸塩の10 mMストック溶液を補充し、オレイン酸ホット培地と同じ100μMオレイン酸塩の最終濃度を達成する。</li>
</ol>3. 細胞の作製
注:歯槽骨前芽細胞および骨髄マクロファージがここで例として使用されている。ユーザーは、適切なプロトコルに従って選択した細胞タイプを準備する必要があります。酵素活性が異なるロット間で異なる可能性があるため、パイロット実験で消化に使用するコラゲナーゼIIの濃度を最適化します。
<ol><li>頭蓋骨前骨芽細胞の単離と培養<ol>
<li>出生後3-5日目(P3-5)の仔犬を断頭して犠牲にし、ペニシリン - ストレプトマイシン(P / S)を含む氷冷DPBSに移す。</li>
		<li>皮膚および軟部組織を除去することによって頭蓋骨を露出させる。DPBSで周囲の組織を後ろから前へ切り取って中央領域を収集します(図1A)。ピンセットを使用して頭蓋骨の内面と外面を優しく傷つけ、その後の消化時に細胞を解放するのを助けます。</li>
		<li>DPBS中のコラゲナーゼII型2mg/mLおよび4mg/mL溶液を調製し、各溶液を新鮮な0.22μmフィルターで濾過する。洗浄した頭蓋骨をまず2mg/mLのコラゲナーゼ溶液で15分間消化し、消化液を捨てる。洗浄したサンプルを4mg/mLのコラゲナーゼ溶液で3回、15分間消化し、消化液をプールして保存します。</li>
		<li>消化液を70 μmのセルストレーナーでろ過し、ろ液を300 × g</li><li></li><li></li><li></ol></li><li> <ol><li><li></li><li><li></li></ol></li></ol><ol><li><li><li></li><li><li><li></li><li></li></ol><ol><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63568/63568eq01.jpg"><ol><li></li><li><li></li><li></li><li></ol></li></ol>

<ol><li>Hargreaves, M., Spriet, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+energy+metabolism+during+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle energy metabolism during exercise.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).</li>
<li>Jeukendrup, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fat+metabolism+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of fat metabolism in skeletal muscle.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).</li>
<li>Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glucose+fatty-acid+cycle.+Its+role+in+insulin+sensitivity+and+the+metabolic+disturbances+of+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus.</a> Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).</li>
<li>Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucose+uptake+by+muscle.+8.+Effects+of+fatty+acids%2C+ketone+bodies+and+pyruvate%2C+and+of+alloxan-diabetes+and+starvation%2C+on+the+uptake+and+metabolic+fate+of+glucose+in+rat+heart+and+diaphragm+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles.</a> Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).</li>
<li>Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+energy-providing+substrates+in+the+isolated+working+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart.</a> Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).</li>
<li>Cha, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+fatty+acid+metabolism+in+type+2+diabetic+skeletal+muscle+cells+is+reversed+by+PPARgamma+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).</li>
<li>Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+the+osteoblast%3A+implications+for+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+aerobic+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+are+required+for+osteoclast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation.</a> FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).</li>
<li>Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malic+enzyme+couples+mitochondria+with+aerobic+glycolysis+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts.</a> Cell Reports. 32 (10), 108108(2020).</li>
<li>Kim, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+oxidation+by+the+osteoblast+is+required+for+normal+bone+acquisition+in+a+sex-+and+diet-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner.</a> JCI Insight. 2 (16), 92704(2017).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li>
<li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li>
<li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+new+osteoclast+progenitor+with+macrophage+phenotypes+being+able+to+differentiate+into+mature+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li>
<li>Itoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dichloroacetate+effects+on+glucose+and+lactate+oxidation+by+neurons+and+astroglia+in+vitro+and+on+glucose+utilization+by+brain+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).</li>
<li>Oba, M., Baldwin, R. L. 4th, Bequette, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+glucose%2C+glutamate%2C+and+glutamine+by+isolated+ovine+enterocytes+in+vitro+is+decreased+by+the+presence+of+other+metabolic+fuels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels.</a> Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).</li>
<li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li>
<li>Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+fatty+acid+oxidation+rates+in+animal+tissues+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines.</a> Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).</li>
<li>Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+composition+of+adipose+tissue+and+blood+in+humans+and+its+use+as+a+biomarker+of+dietary+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake.</a> Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).</li>
<li>Abdelmagid, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+profiling+of+plasma+fatty+acid+concentrations+in+young+healthy+Canadian+adults%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults.</a> PLoS One. 10 (2), 0116195(2015).</li>
</ol>

著者らは利益相反がないと宣言しています。

このプロトコルは、主要なエネルギー基板の酸化速度を決定するための使いやすい方法を提供します。これは、中央ウェルを含むフラスコを使用し、ゴム栓14、15、16で蓋をする他のプロトコルに代わるより簡単な代替手段である。ここでの実施例研究は細胞培養を用いて行われるが、この方法は、先に説明したように、無傷のミトコンドリアを含む組織外植体または組織ホモジネートに対して容易に適合させることができる17。
このプロトコルで考慮すべきいくつかの重要なステップには、試薬の調製および14CO2トラップ用のチューブのセットアップが含まれる。オレイン酸塩からBSAへの適切な結合を確実にすることは、遊離脂肪酸(FFA)が細胞膜を損傷するのを防ぎ、代謝のための細胞による効率的な取り込みを可能にするために極めて重要である。BSA溶液を完...

真核生物における酸化的リン酸化(OXPHOS)は、栄養素がミトコンドリア内で分解され、酸素の消費を通じてATPの形で化学エネルギーを放出するプロセスである。 トリカルボン酸(TCA)サイクルを介したミトコンドリア内部の様々な基質の異化作用は、少数のATP分子を直接生成するが、むしろ電子伝達体ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)およびフラビンアデニンジヌクレオチド(FAD+)の還元によってエネルギーを貯蔵する。次いで、還元された担体は、ミトコンドリアの内膜に位置するETCによって酸化され、膜を横切ってプロトン濃度勾配を生成する。プロトンは最終的にATP合成酵素を介してミトコンドリアマトリックスに勾配を流れ込み、ATPを生成する。OXPHOSは、エネルギー基質からのATP生産の最も効率的な手段であり、好気性環境で一般的に好ましい。以前は、好気性解糖系 - 酸素が存在する間にグルコースから乳酸を生成する - は病態生理学的であると考えられており、しばしば癌細胞の特徴である。いくつかの正常な細胞型が、まだ完全に解読されていない理由で好気性解糖系を使用することがますます発見されています。
代謝の柔軟性は、細胞または生物が変化するエネルギー需要および利用可能な燃料源に適応する能力である。例えば、骨格筋のエネルギー需要は、主に定常状態ではOXPHOSによって満たされるが、高強度運動中の嫌気性解糖系によって満たされる1。運動時間が長くなるにつれて、グルコースと脂肪酸の酸化は全体的なエネルギー生産に大きく寄与します2。しかしながら、基質の使用は、基質が酸化中に拮抗的に競合するため、入手可能性にのみ依存するものではない。最も顕著なのは、脂肪酸酸化が、ランドル効果3として知られる現象において骨格筋によるグルコース利用を阻害することが示されている。相反効果は、その後の研究4、5によって実証された。さらに、多くの疾患は、基質嗜好の変化および細胞における代謝不柔軟性の発症と関連している。例えば、脂肪酸酸化は、正常対照被験者6と比較してII型糖尿病患者の骨格筋において減少している。疾患設定における代謝変化は、病因に寄与する可能性があるため、激しい調査の対象となっている。
骨格細胞型におけるエネルギー代謝は比較的研究されていないが、近年注目されている7。これまでの研究は、好気性解糖系が歯蓋骨芽細胞における支配的なエネルギー経路であり、TCAサイクルを介したグルコース酸化が破骨細胞形成において役割を果たすことを示している8,9。その他は、骨芽細胞のエネルギー源としての脂肪酸の証拠を提供している10。グルタミン異化作用はまた、前駆細胞11、12からの骨芽細胞分化を支持することが示されている。しかしながら、様々な骨格細胞型による基質利用の包括的な理解は、依然として欠けている。さらに、細胞分化中または病理学的シグナルに応答した細胞代謝の変化は、燃料基質の利用率を変化させると予想される。以下に説明するのは、インビトロで基質酸化をアッセイするための使いやすいプロトコールです。

<table><tbody><tr><td>0.22 以上mフィルター</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>SLGVM33RS</td><td>BSA溶液のろ過に使用</td></tr><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA</td><td>ギブコ</td><td>25200056</td><td>細胞培養プレートから細胞を解離</td></tr><tr><td>1.5mL エッペンドルフチューブ</td><td>PR1MA</td><td>PR MCT17 RB</td><td>反応インキュベーションに使用</td></tr><tr><td>10cmプレート</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>細胞培養に使用</td></tr><tr><td>10mLシリンジ</td><td>BD</td><td>302995</td><td>細胞</td></tr>培養媒体の準備<tr><td>14C-グルコース</td><td>PerkinElmer</td><td>のNEC042X050UC</td>のための長い骨<td></td></tr><tr><td>10% FBS</td><td>アトランタの生物製剤</td><td>S11550</td><td></td></tr>から骨髄を洗い流すのに使用されて 熱い媒体<を作るのに使用<tr><td>>sup14C-グルタミン</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC451050UC</td> 熱いmedia14C-oleate PerkinElmer<td>を作るのに使用</td></tr><tr><td></td><td></td><td>NEC317050UC</td><td>ホットメディアを作るために使用</td></tr><tr><td>23 G ニードル</td><td>BD</td><td>305120</td><td>長骨から骨髄を洗い流すために使用</td></tr><tr><td>24 ウェルプレート</td><td>TPP</td><td>92024</td><td>細胞培養に使用</td></tr><tr><td>70 &mu;m細胞ストレーナー</td><td>MIDSCI</td><td>70CELL</td><td>キャヴァリアル消化中に上清をろ過するために使用される</td></tr><tr><td>アクリジンオレンジ/プロピジウムヨウ化物(AO/PI)色素</td><td>Nexcelom Biosciences</td><td>CS2-0106</td><td>生細胞を染色して種子密度を決定する</td></tr><tr><td>牛血清アブミン</td><td>Proliant Biologicals</td><td>68700</td><td>脂肪酸抱合に使用</td></tr><tr><td>セロメーター オート2000</td><td>Nexcelom Biosciences</td><td></td><td>生細胞の数を決定</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>サーモフィッシャー</td>レ<td>ジェンドマイクロ21R</td><td>細胞のペレット化に使用</td></tr><tr><td>コラゲナーゼII型</td><td>ワーシントン</td><td>LS004176</td><td>組織から細胞を解離させる</td></tr><tr><td>カスタムMEM α</td><td>GIBCO</td><td>SKU: ME 18459P1</td><td>カスタムホットメディアの作成に使用</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>試薬の溶解と希釈、および培養皿の洗浄に使用</td></tr><tr><td>フィルターペーパー</td><td>ミリポアシグマ</td><td>WHA1001090</td><td>トラップ CO2 with sa sodium hydroxide</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>g7528</td><td>カスタム培地の作成に使用</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Traps CO2 細胞培養中に</td></tr><tr><td>L-カルニチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0283</td><td>脂肪酸酸化のために補充</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>g3126</td><td>カスタム培地の製造に使用</td></tr><tr><td>MEM α</td><td>Thermo</td><td>A10490</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>Pecheney プラスチック包装</td><td>PM998</td><td>細胞培養皿のシールに使用</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15140122</td><td>細胞培養の汚染を防止</td></tr><tr><td>過塩素酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244252</td><td>代謝アッセイ中にCO2を放出</td></tr><tr><td>ピルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p5280</td><td>カスタムメディアを作るために使用</td></tr><tr><td>シンチレーションカウンター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>LS6500</td><td>濾紙から放射能を測定</td></tr> シン<tr><td>チレーション液</td><td>MP Biomedicals</td><td>882453</td><td>RAMから放出されたエネルギーを吸収し、光の閃光として再放出</td></tr>します <tr><td>シンチレーションバイアル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>03-337-1</td><td>シンチレーション流体用反応容器</td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>中型水酸化ナトリウム用バランスバッファー</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>58045</td><td>メタボイルクアッセイ中にCO2をトラップ</td></tr>します <tr><td>オレイン酸ナトリウム</td><td>サンタクルス</td><td>SC-215879</td><td>BSA 共役脂肪酸製剤</td></tr><tr><td>真空ろ過 1000</td><td>TPP</td><td>99950</td><td>フィルター cMEM&alpha;</td></tr></tbody></table>

14co2トラップによるインビトロでのエネルギー基板酸化の評価

Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

ミトコンドリアは、エネルギー恒常性を維持するためにアデノシン三リン酸(ATP)を生成するトリカルボン酸(TCA)サイクルと電子輸送鎖(ETC)の機構をホストします。グルコース、脂肪酸、およびアミノ酸は、ほとんどの体細胞においてミトコンドリア呼吸を促進する主要なエネルギー基質である。証拠は、異なる細胞型が特定の基質に対して明確な選好を有し得ることを示している。しかしながら、骨格中の各種細胞による基質利用は詳細に検討されていない。さらに、細胞代謝は生理学的および病態生理学的変化に順応しているため、骨格細胞における基質依存性の直接評価は、骨疾患の病因に関する重要な洞察を提供する可能性がある。
以下のプロトコールは、酸化的リン酸化に続く基質分子からの二酸化炭素放出の原理に基づいている。放射性標識された炭素原子(14C)を含む基質を使用することにより、この方法は、細胞培養における基質酸化速度について、高感度で使いやすいアッセイを提供する。原発性頭蓋骨前骨芽細胞と骨髄由来マクロファージ(BMM)とのケーススタディは、2つの細胞型間で主要な基質の利用率が異なることを示しています。

この例では、CO2 トラップ法を使用して、原発性頭蓋骨前骨芽細胞による基質酸化と、それぞれ in vitro 骨芽細胞または破骨細胞分化に頻繁に使用されるBMMを比較する。初代細胞を継代し、cMEMα中で一晩培養した後、それらは典型的にはコンフルエントの80〜90%に達し、その特徴的な形態を示す。頭蓋骨前骨芽細胞はBMMよりも顕著に大きい(図2)。各細胞型は、ステップ4.1〜4.7に従ってグルコース、グルタミン、およびオレイン酸塩の酸化アッセイに供される。結果は、Eq(1)を用いて分析される。
結果は、各基質の酸化速度がBMMよりも頭蓋骨前骨芽細胞において有意に高く、骨前芽細胞におけるOXPHOSによるより大きなエネルギー産生を示す可能性が高いことを示している(図3)。タツノオトシゴ技術を用いた以前の研究では、OXPHOSが骨芽細胞前部ではATP産生の約60%を占めるが、好気性解糖系がエネル...

このプロトコルは、インビトロで14CO2産生を追跡することによって基板酸化を調べるための使いやすい方法を記載している。

14CO2トラップによるインビトロでのエネルギー基板酸化の評価

Mitochondria host the machinery for the tricarboxylic acid (TCA) cycle and electron transport&#160;chain (ETC), which generate adenosine triphosphate ...

異なるエネルギー基質の使用は、細胞型特異的および疾患指標の両方である。特定の基質の消費量を測定することは、正常な生物学と病理学の両方に光を当てることができます。この技術は特別な機器を必要とせず、スケーリングが容易です。また、以前に公開された方法よりも使いやすいです。基質酸化速度の変化を理解することは、代謝障害に対する食事的および薬理学的介入の開発を可能にするであろう。骨組織で実証されていますが、この技術は、代謝シフトの原因と結果の両方を理解するために、すべての細胞タイプの代謝柔軟性を研究するために容易にカスタマイズできます。生後3〜5日の子犬を犠牲にした後、ペニシリンストレプトマイシン二重抗生物質溶液を含む氷冷D PBSに移す。皮膚および軟部組織を除去することによって頭蓋骨を露出させる。D PBSで周囲の組織を背中から前へ切断して中間領域を採取する。ピンセットを使用して頭蓋骨の内面と外面を優しく傷つけ、その後の消化時に細胞を解放するのを助けます。D PBS中のコラゲナーゼ2型1ミリリットル当たり2ミリグラムおよび4ミリグラムの溶液を調製し、各溶液を新鮮な0.22マイクロメートルフィルターで濾過する。まず、洗浄した頭蓋骨を1ミリリットルのコラゲナーゼ溶液2ミリグラムで15分間消化し、次いで消化液を捨てる。次に、清浄なサンプルを1ミリリットルあたり4ミリグラムのコラゲナーゼ溶液に3回ずつ15分間消化する。その後、消化液を引っ張って保存します。消化液を70マイクロメートルのセルストレーナーでろ過し、ろ液を300RCFで5分間遠心分離します。細胞ペレットを10%FBSおよびペニシリンストレプトマイシン二重抗生物質溶液を含む完全なMEMアルファ培地に再懸濁する。細胞を数えて10センチメートルのプレートに播種する。細胞を摂氏37度のインキュベーターで5%二酸化炭素で3日間培養する。次いで、0.25トリプシンEDTAで摂氏37度で細胞を解離させる。消化後、細胞を数え、10%FBSおよびペニシリンストレプトマイシン二重抗生物質溶液を含む完全なMEMアルファ培地で24ウェル細胞培養プレートに細胞を播種する。基質当たり細胞型当たり少なくとも4ウェルをシードし、プレアッセイ計数のために細胞タイプごとに少なくとも3つの余分なウェルをシードする。細胞を摂氏37度で一晩培養する。8週齢のマウスから筋肉と結合組織を除去し、大腿骨と脛骨を採取した後、鋭いはさみで骨の両端を切り取って捨てる。10%FBSペニシリンストレプトマイシン二重抗生物質溶液、および10%CGM 14 12馴化培地を含む15ミリリットルの完全なMEMアルファ培地を含む23ゲージ針を取り付けたシリンジを備えた新鮮な10センチメートルのペトリ皿に骨髄を洗い流す。シャーレ内の細胞を、5%の二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーター内で培養する。3日後、培養培地を捨て、細胞をD PBSでリンスした。付着した細胞を摂氏37度で0.25%トリプシンEDTAで5分間解離させる。遠心分離後、細胞ペレットをBMM培地に再懸濁する。細胞をカウントし、前述の手順に従って24ウェル細胞培養プレートに細胞を播種する。アッセイを開始する前にBMM培地中で摂氏37度で一晩培養した。余分なウェル内の細胞をD PBSで2回洗浄する。細胞を0.25%トリプシンEDTAで解離させる。20マイクロリットルの消化細胞をD PBSに再懸濁する。20マイクロリットルのアクリジンオレンジとヨウ化プロピジウム色素溶液を用いて、自動細胞カウンターで生細胞数を決定し、その数を記録する。アッセイウェル内の細胞をD PBSで2回洗浄する。500マイクロリットルの高温培地をRAM指定の組織培養フード内の各アッセイウェルに加える。プレートをパラフィルムで密封した後、RAM指定のインキュベーター内で細胞を摂氏37度で4時間インキュベートする。インキュベーション中は、ろ紙を1.5ミリリットルのマイクロ遠心管のキャップ内の面積よりわずかに大きい円形に切り、紙をキャップにぴったりと挿入します。各チューブに1モル過塩素酸100マイクロリットルを加え、キャップの内側に取り付けたろ紙に20マイクロリットルの水酸化ナトリウムを加える。細胞をインキュベートした後、各ウェルから調製したチューブに400マイクロリットルの培養培地を移し、直ちにキャップを閉じる。チューブを室温でチューブラックに1時間放置する。インキュベーション中の平行四辺形は、各チューブにシンチレーションバイアルをセットアップし、4ミリリットルのシンチレーション流体で満たします。ろ紙の各片をシンチレーションバイアルに移し、室温で30分間インキュベートする。組織培養フード、ウォーターバス、冷蔵庫、インキュベーター、シンク、地面、およびその他の作業領域で、RAM汚染の可能性についてワイプテストを実行します。紙ワイプをシンチレーション液を含むシンチレーションバイアルに入れます。シンチレーションバイアル中の炭素14放射活性をシンチレーションカウンターで測定し、読み取り結果を記録します。必要に応じて、放射線安全ガイドラインに従って作業環境を除染する。この図は、原発性頭蓋骨前骨芽細胞による基質酸化をBMMと比較したものである。初代細胞を継代し、完全なMEMアルファ培地中で一晩培養した後、それらは典型的には80〜90%のコンフルエントに達し、その特徴的な形態を示す。頭蓋骨前骨芽細胞はBMMよりも著しく大きい。基質酸化の結果は、各基質の酸化速度がBMMよりも歯槽前骨芽細胞において有意に高く、前骨芽細胞における酸化的リン酸化によるより高いエネルギー産生を示す可能性が高いことを示した。挿入された3番目の紙は、1.7ミリリットルのebinトップチューブキャップよりわずかに大きくする必要があります。この方法は、酸素消費と組み合わせて使用でき、細胞内の酸化的リン酸化および乳酸産生の全体的な速度を決定することができる。このプロトコルは、異なる分化段階または疾患設定中の基質使用を決定するために使用することができる。この知識により、代謝障害に対する介入を開発することができます。

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Biology

生物学

電子常磁性共鳴（EPR）分光法はウシ大動脈内皮細胞および鉄（II）-N-メチル-D-グルカミンジチオ、Feを（MGD）を用いてヒト好中球からのスーパーオキシドラジカルアニオンから一酸化窒素を検出するために採用した...

一酸化窒素とスピントラップを使用して、細胞からの電子常磁性共鳴分光法によるスーパーオキシドアニオンラジカルの検出

このビデオは、14個のC放射性標識基板を使用して、基板酸化中に放出されるCO2の定量化技術を示しています。放出された14CO2をアルカリ溶液に閉じ込め、シンチレーションカウンターで定量化します。異なる基質の酸化は組織間で異なり、組織の病態生理学的状態を反映しています。...

培養細胞における基質酸化アッセイ:トラップされたCO2からの放射性シグナルを測定することにより、細胞内の基質酸化を定量化するIn Vitroアッセイ

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経皮針生検によって得られた骨格筋組織から単離されたミトコンドリアの調製と呼吸計測評価

本稿で、ショウジョウバエのグリセリン thoraxes...

ショウジョウバエのティッシュの最小限の量を使用してのグリセリンの繊維でミトコンドリアの酸素消費量の測定

このプロトコルの目標はオンカラム細胞外の電子受容体を用いたトランス...

C2C12 細胞によるトランス プラズマ膜電子輸送特性の測定

このプロトコルでは、calorespirometry、放熱の呼吸、エネルギー代謝を評価するために非侵襲的アプローチを提供する直接・同時測定をについて説明します。この手法は、総細胞エネルギーの流れを監視することによって好気性と嫌気性経路エネルギー利用への貢献を評価するために使用されます。...

Calorespirometry: 細胞のエネルギー代謝を調査する強力な非侵襲的アプローチ

電子常磁性共鳴 (EPR) 分光法は、フリーラジカルを測定する明確な方法です。選択的スピン プローブは、異なる細胞コンパートメント中のフリーラジカルの検出に使用します。治療、保存、および EPR...

周囲温度、77 K で生体試料の電子常磁性共鳴の使用

このプロトコルは、細胞内の細胞内区画特異的な酸化還元状態の評価を記述する。レドックス感受性蛍光プローブは、無傷の細胞でのレシオメトリック分析を可能にします。...

細胞内膜特異的レドックス感受性緑色蛍光タンパク質を用いた細胞酸化の評価

高分解能呼吸計を用いた酸化的リン酸化の評価は、ミトコンドリアおよび細胞エネルギー代謝の機能解析の不可欠な部分となっている。ここでは、チャンバーおよびマイクロプレートベースの高分解能呼吸計を使用して細胞エネルギー代謝を分析するためのプロトコルを提示し、各デバイスの主な利点について説明します。...

チャンバーおよびプレートベースの呼吸計を使用して細胞および組織の生体エネルギーを評価するための高解像度呼吸法

蛍光センサーと組み合わせた高解像度の呼吸法は、ミトコンドリアの酸素消費量と活性酸素種(ROS)の生成を決定します。本プロトコールは、透過処理された坐骨神経におけるミトコンドリア呼吸数およびROS産生を評価する技術を記載する。...

高解像度呼吸法による坐骨神経のミトコンドリア機能の評価

本研究では、細胞膜を選択的に透過させるプロトコルを提示し、基質や阻害剤の標的的送達を可能にすることで、培養細胞におけるミトコンドリア酸化リン酸化(OXPHOS)を評価し、通常は分析を妨げる形質膜輸送障壁を克服します。この技術を用いて、OXPHOSの機能がムスカリン作動薬およびアンタゴニストによって調節されることを示しました。...

ジトニン透過化されたBE(2)-C神経芽細胞における酸化リン酸化結合のコリン作動位子依存性調節

学ぼう、14CO2トラッピング法によるエネルギー基質酸化の測定方法を。骨組織や各種細胞で代謝動態を評価し、代謝性疾患のメカニズム解明に役立つ実験技術です。

¹⁴_CO2トラップによるインビトロでのエネルギー基板酸化の評価

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