Name: タンパク質リン酸化の定量のための最適化された1分子プルダウンアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 学ぶ 1分子プルダウンアッセイによるタンパク質リン酸化の定量法。抗体標識と固定条件の最適化により緑チャンネルの自己蛍光を低減し、個々のタンパク質のリン酸化状態を解析できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、国立衛生研究所R35GM126934、R01AI153617、およびR01CA248166によってDSLに支援されました。EMBはASERT-IRACDAプログラム(NIH K12GM088021)によって、JARはUNM MARCプログラム(NIH 2T34GM008751-20)によってサポートされました。我々は、NIH P30CA118100が支援するニューメキシコ大学総合がんセンター蛍光顕微鏡共有リソースの使用に感謝の意を表している。私たちは、SiMPullのオリジナルの開発がこの作品に影響を与えたAnkur Jain博士とTaekijip Ha博士に感謝したいと思います。 ES-Cの現在演説:免疫力学グループ、統合癌免疫学研究室、癌研究センター、国立癌研究所、ベセスダ

<ol><li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Signaling+by+Receptor+Tyrosine+Kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases.</a> Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).</li>
<li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reading+protein+modifications+with+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).</li>
<li>Coba, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitters+drive+combinatorial+multistate+postsynaptic+density+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks.</a> Science Signaling. 2 (68), (2009).</li>
<li>Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+modulates+the+affinity+of+light-activated+rhodopsin+for+g+protein+and+arrestin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin.</a> Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).</li>
<li>Stites, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+mechanistic+models+to+integrate+and+analyze+multiple+proteomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets.</a> Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).</li>
<li>Hause, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+binary+interaction+mapping+of+SH2+domains+via+fluorescence+polarization+reveals+novel+functional+diversification+of+ErbB+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors.</a> PLOS ONE. 7 (9), 44471(2012).</li>
<li>Lau, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+encoding+of+the+effect+of+a+partial+agonist+on+individual+opioid+receptors+by+multisite+phosphorylation+and+threshold+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection.</a> Science Signaling. 4 (185), (2011).</li>
<li>Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+and+analysis%3A+next+generation+Western+blotting+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).</li>
<li>Brunner, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+multiple+fragmentation+methods+on+an+orbitrap+fusion+for+top-down+phospho-proteoform+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).</li>
<li>Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Value+of+using+multiple+proteases+for+large-scale+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).</li>
<li>Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MARQUIS%3A+A+multiplex+method+for+absolute+quantification+of+peptides+and+posttranslational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+protein+complexes+using+single-molecule+pull-down%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down.</a> Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).</li>
<li>Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+pull-down+for+studying+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-molecule pull-down for studying protein interactions.</a> Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).</li>
<li>Kim, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pairwise+detection+of+site-specific+receptor+phosphorylations+using+single-molecule+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).</li>
<li>Salazar-Cavazos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+EGFR+phosphorylation+is+regulated+by+adaptor+protein+abundances+and+dimer+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695(2020).</li>
<li>Huyer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+inhibition+of+protein-tyrosine+phosphatases+by+vanadate+and+pervanadate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+lenses+for+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Objective lenses for confocal microscopy.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).</li>
<li>Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHendriks%2C+CLL+%22Dipimage%3A+a+scientific+image+processing+toolbox+for+MATLAB%22">Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB</a>. , (1999).</li>
<li>fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html">https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html</a> (2013).</li>
<li>Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+autofluorescence+on+DNA+microarrays+and+slide+surfaces+by+treatment+with+sodium+borohydride%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride.</a> Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).</li>
<li>Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+single-cell+single-molecule+pull-down%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Toward single-cell single-molecule pull-down.</a> Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).</li>
</ol>

著者らには開示するものは何もありません。

ここで説明するプロトコルは、単一タンパク質レベルでの受容体リン酸化の定量的測定を可能にするように最適化されました。SiMPullプロトコルに対するいくつかの単純だが重要な修正が開発され、NaBH4 処理による自己蛍光の低減や抗体解離を防ぐためのサンプルの後固定など、ホスホチロシン検出の測定の信頼性が向上しました。緑色チャネルマスクを使用して、抗PY抗体との共局在を計算するための受容体位置を同定し、細胞溶解物への抗体の非特異的結合から潜在的なアーチファクトを除去することによって、測定精度も向上させる。2色イメージングを、リン酸化された受容体の画分を検出するために利用した。このシナリオでは、受容体はGFPで遺伝的にタグ付けされ、抗体は遠赤色色素で直接標識されました。SiMPullアプローチは、細胞内タンパク質を含む、特異的抗体が利用可能な他のタンパク質標的に適用される。さらに、変性条件が不要なため、マルチサブユニット受容体/複合体も捕捉することができる。しかしながら、目的のPTMがタンパク質14の構造領域に位置する場合、変性は組み込まれ得る。最終的に、SiMPullは、マ...

膜関連シグナル伝達は、リガンド誘導膜受容体活性化およびシグナルを伝播する下流補助タンパク質の動員の組み合わせによって同調される。受容体細胞質尾部における重要なチロシンのリン酸化は、シグナル伝達複合体、またはシグナル伝達体1,2の形成を開始するのに重要である。したがって、生物学における重要な問題は、シグナル伝達パートナーを募集し、細胞転帰を決定するために、リン酸化パターンがどのように作成され、維持されるかである。これには、シグナル伝達3,4,5,6,7の組成を指示することによってシグナル伝達出力を操作する手段を提供できる存在量および特定のホスホチロシンパターンの両方における受容体リン酸化の不均一性を理解することが含まれる。しかしながら、タンパク質リン酸化を疑問視する現在の方法には限界がある。ウェスタンブロット分析は、タンパク質リン酸化の傾向を記述するのには優れていますが、半定量的8であり、数千から数百万の受容体が一緒に平均化されるため、システムの不均一性に関する情報を提供しません。ウェスタンブロットは、特定のチロシンに対するホスホ特異的抗体を使用してサンプルをプロービングすることを可能にするが、同じタンパク質内のマルチサイトリン酸化パターンに関する情報を提供することはできない。定量的ホスホプロテオミクスはホスホチロシンの存在量について報告するが、目的の残基が酵素消化によって生成されるのと同じペプチド(典型的には7〜35アミノ酸)内に位置する必要があるため、マルチサイトリン酸化を検出することには限界がある9、10、11。
上記の制限を克服するために、単一分子プルダウン(SiMPull)アッセイは、一分子レベルでインタクトな受容体のリン酸化状態を定量化するように適合されている。SiMPullは、Jainらによって高分子複合体を尋問するための強力なツールとして最初に実証された12,13。SiMPullでは、高分子複合体を抗体官能化ガラスカバースリップ上で免疫沈降(IP)し、次いでタンパク質サブユニット数および複合体成分12とのco-IPについて一分子顕微鏡を通して分析した。SiMBlotと呼ばれるKimら14による改変は、変性タンパク質のリン酸化を分析するためにSiMPullのバリエーションを使用した最初の改変であった。SiMBlotプロトコルは、NeutrAvidinコーティングされたカバースリップを使用してビオチン化細胞表面タンパク質を捕捉することに依存しており、その後、リン酸化についてリン酸化についてリン酸化がプローブされる14。これらの進歩にもかかわらず、翻訳後修飾の定量化をより堅牢にし、より広い範囲のタンパク質に適用できるようにするには、改善が必要でした。
本プロトコールは、リガンド条件および発癌性変異の範囲に応答してインタクトな上皮成長因子受容体(EGFR)のリン酸化パターンを定量するために使用された最適化されたSiMPullアプローチを記載する15。この研究はEGFRに焦点を当てていますが、このアプローチは、高品質の抗体が利用可能な目的の膜受容体および細胞質ゾルタンパク質(POI)に適用することができます。このプロトコルには、サンプルの自己蛍光を低減する手順、最大 20 個のサンプルを同時に調製して最小限のサンプル量を必要とするサンプルアレイ設計、抗体標識および固定条件の最適化が含まれています。リン酸化タンパク質の単一分子検出および定量のために、データ解析アルゴリズムが開発されています。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>MTC Bio</td><td>C2000</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl</td><td></td><td></td><td>T50 バッファー</td></tr><tr><td>100 mm 組織培養皿</td><td>CELLTREAT</td><td>229620</td><td>ピラニアエッチングガラス/アレイの保管</td></tr><tr><td>15 mL 円錐管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% パラホルムアルデヒド水性溶液</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>15710</td><td>危険</td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td></td><td></td><td>機能化 ガラス貯蔵/KOH再利用</td></tr><tr><td>50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl</td><td></td><td></td><td>溶解バッファー コンポーネント</td></tr><tr><td>60 mm 組織培養皿</td><td>コーニング</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>8% グルタルアルデヒド水溶液</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>16020</td><td>危険な</td></tr><tr><td>アセトン(C3H6O)</td><td>ミリポアシグ</td><td>マ270725</td><td>危険な</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-20006</td><td></td></tr><tr><td>アニマルフリー組換えヒトEGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human EGFR(外部ドメイン)&ndash;Biotin</td><td>Leinco Technologies, Inc</td><td>E101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p-Tyr 抗体 (PY99) Alexa Fluor 647</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7020 AF647</td><td></td></tr><tr><td>Bath-sonicator</td><td>Branson</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SVA, MW 5,000</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>ゴールドバイオテクノロジー</td><td>A-420-1</td><td>タイロードの緩衝液 成分</td></tr><tr><td>ブフナー漏斗</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブンゼンバーナー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム (CaCl2)</td><td>ミリポア シグマ</td><td>C4901</td><td>チロードの緩衝液</td></tr><tr><td>成分 細胞スクレーパー</td><td>バイオワールド</td><td>30900017-1</td><td></td></tr><tr><td>円錐形ろ過フラスコ</td><td>フィッシャーScientific</td><td>S15464</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>WHEATON</td><td>900470</td><td></td></tr><tr><td>Countess II 自動セルカウンター</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 24 x 60 #1.5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63793</td><td></td></tr><tr><td>DipImage</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>https://diplib.org/ DMEM</td><td>Caisson Labs</td><td>DML19-500</td><td></td></tr><tr><td>emCCDカメラ</td><td>Andor iXon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Optima</td><td>Bio-Techne</td><td>S12450H</td><td>Heat Inactivated</td></tr><tr><td>Fusion 360 software</td><td>Autodesk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geneticin G418 Disulfate</td><td>Caisson Labs</td><td>G030-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid (CH3COOH)</td><td>JT Baker</td><td>JTB-9526-01</td><td>危険</td></tr><tr><td>ガラス血清ピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス攪拌ロッド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルコース (D-(+)-グルコース)</td><td>ミリポア Sigma</td><td>D9434</td><td>チロード緩衝液成分</td></tr><tr><td>停止ホスフォターゼおよびプロテアーゼ阻害剤 カクテル (100X)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>78446</td><td>溶解緩衝液</td></tr><tr><td>成分 HEPES</td><td>ミリポアシグマ</td><td>H3375</td><td>チロードの緩衝成分</td></tr><tr><td>塩酸(HCl)</td><td>VWR</td><td>BDH7204-1</td><td>有害</td></tr><tr><td>過酸化水素(H2O2) (3%)</td><td></td><td>HX0645</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素(H2O2) (30%)</td><td>EMD Millipore</td><td>HX0635-2</td><td></td></tr><tr><td>アイスIGEPAL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CA-630 (NP-40)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I8896</td><td>溶解緩衝液 成分</td></tr><tr><td>ImmEdge 疎水性バリアペン</td><td>ベクトル研究所</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>イマーゾール 518F 浸漬油</td><td>ツァイス</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>社内真空ライン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物 (MgCl2-6H2O)</td><td>MPBio</td><td>2191421</td><td>Tyrode's Buffer Component</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox</td></tr><tr><td>メタノール (CH3OH)</td><td>IBIS Scientific</td><td>MX0486-1</td><td>危険な</td></tr><tr><td>Milli-Q 水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mix-n-Stain CF染料抗体の分類のキット</td><td>Biotium</td><td>92245</td><td>提案された抱合のキット</td></tr><tr><td>mPEG</td><td>Laysan生物</td><td>mPEG-スクシンイミジルの吉草酸エスカレート、MW 5,000</td><td></td></tr><tr><td>N-(2-アミノエチル)-3-アミノプロピルトリメトキシシラン</td><td>UCTユナイテッドケミカル</td><td>A0700</td><td></td></tr>危険な<tr><td>ナノグリッド</td><td>Miraloma Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin Biotin結合タンパク質</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>窒素 (圧縮ガス)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NVIDIA GPU と CUDA</td><td></td><td></td><td>https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html</td></tr><tr><td>オリンパス iX71 顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム M シーリング フィルム</td><td>ラボ デポ</td><td>HS234526C</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL06</td><td></td></tr><tr><td>PC-200 アナログホットプレート</td><td>Corning</td><td>6795-200</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2236BF</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>529552</td><td>チロードの緩衝液成分</td></tr><tr><td>水酸化カリウム (KOH)</td> <td>ミリポア シグマ</td><td>1050330500</td><td>危険な</td></tr><tr><td>プレミアム PLA フィラメント、直径 1.75 mm</td><td>レイズ 3D</td><td>PMS:2035U/RAL:3028</td><td>印刷温度範囲: 205-235 °C;C</td></tr><tr><td>Pro2 3Dプリンター</td><td>レイズ3D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パイレックス1Lビーカー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パイレックス100mL保存ボトルコー</td><td>ニング</td><td>1395-100CH</td><<td>sub>3OH / C3H6O再利用</td></tr>パイ<tr><td>レックス250mLビーカー</td><td></td><td></td><td></td></tr>パイ<tr><td>レックス4Lビーカー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クワッドビュー画像スプリッター</td><td>フォトメトリクス</td><td>モデル QV2</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>EP-5415R</td><td></td></tr><tr><td>RevCount セルカウンター、EVE セルカウンティングスライド</td><td>VWR</td><td>10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Semrock 発光フィルター:青 (445/45 nm)、緑 (525/45 nm)、赤 (600/37 nm)、遠赤 (685/40 nm)</td><td>Semrock</td><td>LF405/488/561/635-4X4M-B-000</td><td></td></tr><tr><td>セロロジカルピペットコントローラー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>血清学的ピペットは</td><td></td><td></td><td></td></tr>、<tr><td>重炭酸ナトリウム(NaHCO3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td>危険な</td></tr>水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)Millipore Sigma 452874 Tyrode」https://github.com/LidkeLab/smite.git <tr><td></td>を<td>打つ単一分子分析パッケージ</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>緩衝液成分</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td> <td>ミリポアシグマ</td><td>S9625</td><td>連続熱・pHサイクルによる活性化</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>VWR</td><td>BDH3247-1</td><td></td></tr><tr><td>オルトバナジン酸ナトリウム (Na3VO4)</td> <td>ミリポアシグマ</td><td>S6508</td><td>有害</td></tr><tr><td>硫酸 (H2SO4)</td><td>ミリポアシグ</td><td>マ 258105</td><td>危険な</td></tr><tr><td>テトラスペック マイクロスフェア</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>T7279</td><td>マルチ蛍光ビーズ</td></tr><tr><td>トリス(トリズマ)ベース</td><td>ミリポアシグマ</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルーステイン、0.4%</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA 0.05%</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25300120</td><td></td></tr></tbody></table>

タンパク質リン酸化の定量のための最適化された1分子プルダウンアッセイ

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

リン酸化は、タンパク質機能を調節し、細胞シグナル伝達の結果を導く必要な翻訳後修飾である。タンパク質リン酸化を測定する現在の方法は、個々のタンパク質にわたるリン酸化の不均一性を維持することができない。単一分子プルダウン(SiMPull)アッセイは、ガラスカバースリップ上のタンパク質の免疫沈降とそれに続く単一分子イメージング を介して 高分子複合体の組成を調査するために開発されました。現在の技術は、単一分子レベルでの全長膜受容体のリン酸化状態の堅牢な定量化を提供するSiMPullの適応である。このようにして何千もの個々の受容体をイメージングすると、タンパク質リン酸化パターンを定量化することができます。現在のプロトコルは、サンプル調製からイメージングまで、最適化されたSiMPull手順を詳述しています。ガラス調製および抗体固定プロトコルの最適化により、データ品質がさらに向上します。現在のプロトコルは、サンプル内でリン酸化された受容体の割合を計算する単一分子データ分析のためのコードを提供します。この研究は上皮成長因子受容体(EGFR)のリン酸化に焦点を当てているが、プロトコルは他の膜受容体および細胞質ゾルシグナル伝達分子に一般化することができる。

SiMPullプロセスを描いた漫画を 図1Aに示します。カバースリップは、ビオチン化抗EGFR抗体のアンカーとしてNeutrAvidinを使用して官能化され、全タンパク質溶解物からEGFR-GFPを捕捉します。非結合タンパク質を洗い流した後、リン酸化受容体を抗ホスホチロシン(anti-PY)抗体で標識する15。 図1B は疎水性アレイの画像を示しており、複数のサンプルを準備し、同じカバースリップ上に画像化することができます。このサンプルホルダーの利点の1つは、約10μLの最小限のサンプル量で済むことです。カバースリップは、顕微鏡ステージに直接配置することで画像化できます。ただし、カバースリップホルダーを使用してカバースリップを安定させると便利です。 図 1B に示すカバースリップ ホルダーは 3D プリンターを使用して作成され、青写真は 補足コーディング ファイル 5 に用意され...

本プロトコルは、改良された一分子プルダウン(SiMPull)アッセイを用いてタンパク質リン酸化を定量するためのサンプル調製およびデータ分析について記載する。

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

このSiMPullプロトコルは、抗体の標識および固定条件を改善し、緑色チャネルに見られる自己蛍光を低減し、堅牢な単一分子分析アルゴリズムを提供することにより、タンパク質リン酸化の定量を可能にします。SiMPullの主な利点は、個々のインタクトなタンパク質のリン酸化状態を調べることができることです。この方法では、ウェスタンブロッティングや質量分析などの従来の技術ではアクセスできない新しい情報を得ることができます。私たちは、プロトコルの実証を支援する研究者のチームを持っています。まず、ジュリアン・ロホがカバーガラスをピラニアエッチングする方法を紹介します。レイチェル・グラッタンは、カバーガラスのコーティングの手順を示します。エリザベス・ベイリーが配列と画像サンプルの描画方法を紹介します。まず、ピラニアは、反応ビーカーを5分ごとに30分間穏やかに攪拌することによって、カバースリップをエッチングする。ピラニア溶液に弱塩基を徐々に添加して中和した。ガラス棒で、エッチングされたカバースリップをブフナー漏斗に移し、二重蒸留水で5分間すすいでください。次に、カバースリップをガラスのコプリン瓶に入れ、メタノールで覆います。蓋をシールフィルムで密封し、10分間超音波処理する。超音波処理後、メタノールをガラス貯蔵瓶に空にする。アセトンでこの手順を繰り返します。カバースリップをコプリン瓶の二重蒸留水で3回すすいでください。カバースリップから水を排水し、ブンゼンバーナーの炎を振って乾かします。カバースリップを乾燥したコプリン瓶に入れます。次いで、アミノシラン溶液をコップリンジャーに加え、カバースリップアミノシラン化を行う。光から保護するためにシーリングフィルムを覆い、塗布します。カバースリップをメタノールですすぎ、使用済みの溶液を捨てます。再び、カバースリップを二重蒸留水で3回、それぞれ2分間すすいでください。余分な水分を軽くたたき、空気を10分間完全に乾燥させます。次に、疎水性バリアペンでグリッド配列を描きます。カバースリップに識別子を付けて、適切な向きを識別します。インクが乾いたら、カバースリップを加湿したチャンバーに置きます。153ミリグラムのmPEGと3.9ミリグラムのビオチン-PEGを609マイクロリットルの10ミリモルの炭酸水素ナトリウムとボルテックスに再懸濁する。室温で1分間から10, 000 x gで遠心分離し、気泡を除去した。1平方あたり10〜15マイクロリットルのこの溶液を塗布して、オーバーフローすることなくアレイを完全に覆う。カバーを暗所の湿度室に滑り込ませ、室温で3〜4時間保管してください。次に、二重蒸留水で満たされた3つのビーカーに10秒間順番に浸漬して、カバースリップを洗浄します。窒素ガスを使用してカバースリップからすべての水分を取り除きます。カバーを窒素で満たされた50ミリリットルの円錐形チューブに背中合わせに保管し、シーリングフィルムでシールします。チューブをシーリングフィルムで包み、マイナス20°Cに置きます。ビオチン-PEG官能化アレイを冷凍庫から取り出し、室温に平衡化します。アレイを上に向けてカバースリップを、封止フィルムで裏打ちされた100ミリメートルの組織培養皿の上に置きます。アレイの各正方形をPBS中の水素化ホウ素ナトリウム1ミリリットル当たり10ミリグラムと共に室温で4分間インキュベートする。PBSで3回洗う。次に、T50中のNeutrAvidinのミリリットル当たり0.2ミリグラムで5分間インキュベートし、続いてT50 BSAで3回洗浄する。T50 BSA中のビオチン化POI特異的抗体1ミリリットルあたり2マイクログラムのインキュベーションを10分間繰り返し、次いで洗浄を行った。まず、溶解液をピペッティングにより混合して解凍する。溶解液1マイクロリットルを氷冷T50 BSA PPIの100マイクロリットルに希釈する。アレイ上の溶解物を10分間インキュベートし、続いて洗浄した。氷冷T50 BSA PPI中でAF647結合抗ホスホチロシン抗体を調製し、アレイ上で1時間インキュベートする。目標に一滴の油を堆積させる。ナノグリッドをステージ上に置き、イメージングします。透過白色光を使用して、グリッドパターンに焦点を合わせます。グリッドの一連の20枚の画像を取得し、ピクセルが飽和していないことを確認し、画像シリーズを基準として保存します。ナノグリッドの焦点を離して風通しの良いパターンを作成し、ゲインキャリブレーションのために一連の20枚の画像を取得し、画像をゲインとして保存します。次に、カメラへのすべての光を遮断することによってカメラオフセット用の一連の20枚の画像を取得し、画像の背景を保存します。簡単な画像を取得するには、まずオイル対物をきれいにし、目的のオイルを追加堆積させます。カバースリップアレイを顕微鏡ステージに固定します。各サンプルの画像を、まず遠赤色チャネルで取得し、続いて低波長の蛍光色素分子で取得します。バッファー レベルを 30 ~ 45 分ごとに確認し、必要に応じて補充します。この技術を用いて、EGFR-GFPを全タンパク質溶解物から捕捉した。疎水性インクの自家蛍光を、試料の焦点面を見出すためのガイドとして使用した。生データ画像は、カメラチップ上で分離されたスペクトルチャネルで取得された。緑と遠赤のチャンネルのオーバーレイは、データ集録のためにさらに調べられました。チャネル登録は、ナノグリッドから取得した画像に対して行った。基準画像のオーバーレイは、不完全な登録を示した。アライメントは、遠赤と緑のチャネル座標に局所加重平均変換を適用し、後続のSiMPullデータを登録するために使用することによって行われました。GFPチャネルおよびAF647チャネルからの背景光子数より上の単一エミッタをボックス化し、位置を特定するためにガウス局在化を実施した。F647におけるEGFR-GFPの共局在化は、リン酸化受容体を同定するために行われた。共局在化の割合を、リン酸化受容体の画分を決定するために使用した。バックグラウンド検出は、ピラニアエッチングガラスを水素化ホウ素ナトリウムで処理したときに減少した。溶解液中のEGFR−GFPのロバストな結合は、最小限の非特異的PY99−AF647結合で観察され、この技術を用いた表面官能化の保持を示した。SiMPullは、タンパク質のリン酸化に関する情報を提供し、幅広い自己シグナル伝達の質問に対処できます。これにより、正常状態と疾患状態の両方でのシグナル伝達の理解を深めることができます。

an-optimized-single-molecule-pull-down-assay-for-quantification

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

冷凍融解、尿素solubilziation、HILIC分画とリン酸化ペプチドのIMAC濃縮を用いた定量的リン酸化の手順の説明。...

脂肪酸の定量的なPhosphoproteomicsは刺激を受けてサッカロマイセスセレビシエ</em

このビデオでは、単一分子プルダウンアッセイを用いたタンパク質リン酸化の高感度定量技術を示しています。ポリエチレングリコール-ビオチンの官能基化と標識抗体の使用により、リン酸化チロシンの検出が特異的に増加します。...

タンパク質リン酸化分析のための単一分子プルダウンアッセイ:細胞溶解物中のタンパク質リン酸化を定量するハイスループット技術

ここでは植物性タンパク質複合体の精製および特性評価のためのプロトコルを記述します。私たちは、複雑な内部に単一のタンパク質を免疫沈降によって、私たちはその翻訳後修飾とその相互作用パートナーを識別できることを実証している。...

植物タンパク質複合体の翻訳後修飾の同定

精製された細菌のヒスチジンキナーゼの自己リン酸化を定量化するために使用できる最適化されたニトロセルロース結合アッセイを報告し、実演します。私たちの分析法は、従来のSDS-PAGEベースの技術に比べていくつかの利点があり、これらの重要なタンパク質を特徴付けるための貴重な代替手段を提供します。...

ニトロセルロース結合アッセイを用いて細菌ヒスチジンキナーゼ自己リン酸化の定量化

プロテインキナーゼは高度に進化したシグナリング酵素であり、細胞間および細胞内シグナル伝達にとって重要な足場である。本発明者らは、細胞シグナル伝達調節の解明を助ける信頼できる方法である放射性標識アデノシン三リン酸（[γ- 32 P] ATP）の使用によるキナーゼ活性を測定するためのプロトコールを提示する。...

放射性標識ATPによるタンパク質キナーゼ活性のアッセイ

ペプチド競合アッセイは、種々の分子および免疫学的実験において広く使用されている。本稿では、in vitroオリゴペプチド競合キナーゼアッセイの詳細な方法と、特定のリン酸化部位を見出すのに有用な関連する検証手順について説明します。...

リン酸化部位決定のためのオリゴペプチド競合アッセイ

我々は、堅牢な生化学的アプローチを用いた新しいキナーゼタンパク質を特徴付けた:異なる細胞株および組織上の専用の特異的抗体を用いたウェスタンブロット分析、共免疫沈殿実験による相互作用、西洋で検出されたキナーゼ活性ホスホ特異的抗体およびγ[32P]ATP標識を用いたブロット。...

新しいキナーゼタンパク質の堅牢な生化学的アプローチを用いて分子レベルでの特性解析

このプロトコルは、小さなDNAおよびRNA基質上のポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)のキナーゼ活性を測定するための非放射性アッセイを記述する。...

小ヌクレオチド基質のポリヌクレオチドリン酸化を測定する非放射性アッセイ

時間分解フェルスター共鳴エネルギー移動細胞ベースのアッセイプロトコルは、384ウェルフォーマットの細胞溶解物中の内因性リン酸化シグナルトランスデューサおよび転写活性化剤(STAT)1/3/4/5/6タンパク質の単純、特異的、高感度、および堅牢な定量のために記載されています。...

ヒト細胞中の内因性リン酸化STATタンパク質の測定のための時間分解フェルスター共鳴エネルギー移動アッセイ

ここでは、細胞および組織からの内因性リンタンパク質ホスファターゼおよびそれらの相互作用タンパク質の濃縮、ならびに質量分析ベースのプロテオミクスによるそれらの同定および定量のためのプロトコルを提示する。...

リンタンパク質ホスファターゼとそのインターアクターを同定するための質量分析ベースのアプローチ

学ぶ 1分子プルダウンアッセイによるタンパク質リン酸化の定量法。抗体標識と固定条件の最適化により緑チャンネルの自己蛍光を低減し、個々のタンパク質のリン酸化状態を解析できます。

タンパク質リン酸化の定量のための最適化された1分子プルダウンアッセイ

さらに動画を探す