タンパク質リン酸化の定量のための最適化された1分子プルダウンアッセイ
2022年6月6日
本プロトコルは、改良された一分子プルダウン(SiMPull)アッセイを用いてタンパク質リン酸化を定量するためのサンプル調製およびデータ分析について記載する。
このSiMPullプロトコルは、抗体の標識および固定条件を改善し、緑色チャネルに見られる自己蛍光を低減し、堅牢な単一分子分析アルゴリズムを提供することにより、タンパク質リン酸化の定量を可能にします。SiMPullの主な利点は、個々のインタクトなタンパク質のリン酸化状態を調べることができることです。この方法では、ウェスタンブロッティングや質量分析などの従来の技術ではアクセスできない新しい情報を得ることができます。
私たちは、プロトコルの実証を支援する研究者のチームを持っています。まず、ジュリアン・ロホがカバーガラスをピラニアエッチングする方法を紹介します。レイチェル・グラッタンは、カバーガラスのコーティングの手順を示します。
エリザベス・ベイリーが配列と画像サンプルの描画方法を紹介します。まず、ピラニアは、反応ビーカーを5分ごとに30分間穏やかに攪拌することによって、カバースリップをエッチングする。ピラニア溶液に弱塩基を徐々に添加して中和した。
ガラス棒で、エッチングされたカバースリップをブフナー漏斗に移し、二重蒸留水で5分間すすいでください。次に、カバースリップをガラスのコプリン瓶に入れ、メタノールで覆います。蓋をシールフィルムで密封し、10分間超音波処理する。
超音波処理後、メタノールをガラス貯蔵瓶に空にする。アセトンでこの手順を繰り返します。カバースリップをコプリン瓶の二重蒸留水で3回すすいでください。
カバースリップから水を排水し、ブンゼンバーナーの炎を振って乾かします。カバースリップを乾燥したコプリン瓶に入れます。次いで、アミノシラン溶液をコップリンジャーに加え、カバースリップアミノシラン化を行う。
光から保護するためにシーリングフィルムを覆い、塗布します。カバースリップをメタノールですすぎ、使用済みの溶液を捨てます。再び、カバースリップを二重蒸留水で3回、それぞれ2分間すすいでください。
余分な水分を軽くたたき、空気を10分間完全に乾燥させます。次に、疎水性バリアペンでグリッド配列を描きます。カバースリップに識別子を付けて、適切な向きを識別します。
インクが乾いたら、カバースリップを加湿したチャンバーに置きます。153ミリグラムのmPEGと3.9ミリグラムのビオチン-PEGを609マイクロリットルの10ミリモルの炭酸水素ナトリウムとボルテックスに再懸濁する。室温で1分間から10, 000 x gで遠心分離し、気泡を除去した。
1平方あたり10〜15マイクロリットルのこの溶液を塗布して、オーバーフローすることなくアレイを完全に覆う。カバーを暗所の湿度室に滑り込ませ、室温で3〜4時間保管してください。次に、二重蒸留水で満たされた3つのビーカーに10秒間順番に浸漬して、カバースリップを洗浄します。
窒素ガスを使用してカバースリップからすべての水分を取り除きます。カバーを窒素で満たされた50ミリリットルの円錐形チューブに背中合わせに保管し、シーリングフィルムでシールします。チューブをシーリングフィルムで包み、マイナス20°Cに置きます。
ビオチン-PEG官能化アレイを冷凍庫から取り出し、室温に平衡化します。アレイを上に向けてカバースリップを、封止フィルムで裏打ちされた100ミリメートルの組織培養皿の上に置きます。アレイの各正方形をPBS中の水素化ホウ素ナトリウム1ミリリットル当たり10ミリグラムと共に室温で4分間インキュベートする。
PBSで3回洗う。次に、T50中のNeutrAvidinのミリリットル当たり0.2ミリグラムで5分間インキュベートし、続いてT50 BSAで3回洗浄する。T50 BSA中のビオチン化POI特異的抗体1ミリリットルあたり2マイクログラムのインキュベーションを10分間繰り返し、次いで洗浄を行った。
まず、溶解液をピペッティングにより混合して解凍する。溶解液1マイクロリットルを氷冷T50 BSA PPIの100マイクロリットルに希釈する。アレイ上の溶解物を10分間インキュベートし、続いて洗浄した。
氷冷T50 BSA PPI中でAF647結合抗ホスホチロシン抗体を調製し、アレイ上で1時間インキュベートする。目標に一滴の油を堆積させる。ナノグリッドをステージ上に置き、イメージングします。
透過白色光を使用して、グリッドパターンに焦点を合わせます。グリッドの一連の20枚の画像を取得し、ピクセルが飽和していないことを確認し、画像シリーズを基準として保存します。ナノグリッドの焦点を離して風通しの良いパターンを作成し、ゲインキャリブレーションのために一連の20枚の画像を取得し、画像をゲインとして保存します。
次に、カメラへのすべての光を遮断することによってカメラオフセット用の一連の20枚の画像を取得し、画像の背景を保存します。簡単な画像を取得するには、まずオイル対物をきれいにし、目的のオイルを追加堆積させます。カバースリップアレイを顕微鏡ステージに固定します。
各サンプルの画像を、まず遠赤色チャネルで取得し、続いて低波長の蛍光色素分子で取得します。バッファー レベルを 30 ~ 45 分ごとに確認し、必要に応じて補充します。この技術を用いて、EGFR-GFPを全タンパク質溶解物から捕捉した。
疎水性インクの自家蛍光を、試料の焦点面を見出すためのガイドとして使用した。生データ画像は、カメラチップ上で分離されたスペクトルチャネルで取得された。緑と遠赤のチャンネルのオーバーレイは、データ集録のためにさらに調べられました。
チャネル登録は、ナノグリッドから取得した画像に対して行った。基準画像のオーバーレイは、不完全な登録を示した。アライメントは、遠赤と緑のチャネル座標に局所加重平均変換を適用し、後続のSiMPullデータを登録するために使用することによって行われました。
GFPチャネルおよびAF647チャネルからの背景光子数より上の単一エミッタをボックス化し、位置を特定するためにガウス局在化を実施した。F647におけるEGFR-GFPの共局在化は、リン酸化受容体を同定するために行われた。共局在化の割合を、リン酸化受容体の画分を決定するために使用した。
バックグラウンド検出は、ピラニアエッチングガラスを水素化ホウ素ナトリウムで処理したときに減少した。溶解液中のEGFR−GFPのロバストな結合は、最小限の非特異的PY99−AF647結合で観察され、この技術を用いた表面官能化の保持を示した。SiMPullは、タンパク質のリン酸化に関する情報を提供し、幅広い自己シグナル伝達の質問に対処できます。
これにより、正常状態と疾患状態の両方でのシグナル伝達の理解を深めることができます。
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概要
このSiMPullプロトコルは、抗体ラベリングと固定条件を改善することでタンパク質リン酸化の定量化を可能にします。緑色チャネルの自己蛍光を減少させ、堅牢な単分子解析アルゴリズムを提供します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生化学
- タンパク質分析
背景
- タンパク質リン酸化は重要な翻訳後修飾です。
- ウェスタンブロッティングや質量分析などの従来の技術には限界があります。
- 単分子解析はタンパク質の挙動に新たな洞察を提供します。
- このプロトコルはリン酸化定量化の精度を向上させることを目的としています。
研究の目的
- 単分子レベルでのタンパク質リン酸化を定量化する。
- 抗体ラベリングと固定の信頼性を向上させる。
- 従来の分析技術を上回る方法を提供する。
使用された方法
- 単分子プルダウン（SiMPull）アッセイ。
- 改良された抗体ラベリング技術。
- 自己蛍光を減少させるための最適化された固定条件。
- 堅牢な単分子解析アルゴリズム。
主な結果
- タンパク質リン酸化の定量化の向上。
- 緑色チャネルでの自己蛍光の成功的な減少。
- 研究者チームによるプロトコルのデモンストレーション。
- 個々のタンパク質のリン酸化状態を調査する能力。
結論
- SiMPullプロトコルはタンパク質分析に大きな進歩をもたらします。
- 以前はアクセスできなかったリン酸化に関する詳細な洞察を可能にします。
- この方法は特定の応用で従来の技術に取って代わる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantifying protein phosphorylation at the single-molecule level addresses a critical gap in understanding signaling heterogeneity and mechanistic pathway activation in drug discovery. The optimized SiMPull assay enables robust, quantitative assessment of receptor phosphorylation, supporting predictive confidence in target validation and early discovery decisions. This capability enhances portfolio triage by providing high-resolution data on posttranslational modifications relevant to disease biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of phosphorylation status for individual membrane receptors, clarifying pathway activation.
- Supports biological de-risking by revealing heterogeneity in posttranslational modification across protein populations.
- Improves predictive confidence for target engagement and functional validation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, quantitative single-molecule readouts for downstream screening workflows.
- Standardizes assay conditions through optimized antibody labeling and fixation protocols.
- Facilitates reproducible, scalable quantification of phosphorylation for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phosphorylation measurements with disease-relevant signaling pathways for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic de-risking.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative modification data.
Pipeline & Workflow Integration
The SiMPull assay integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical research, providing a reusable platform for quantitative posttranslational analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying phosphorylation at the single-molecule level.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay readiness and compound screening.
- Analytics: Provides robust statistical measurements of phosphorylation fractions across thousands of receptors.
- Translational Research: Enables alignment of signaling data with disease models for biomarker continuity.
- Enterprise Reuse: Offers a generalizable protocol adaptable to diverse membrane receptors and signaling proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of phosphorylation assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-resolution modification data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule imaging and quantitative data analysis.
- Demands specialized instrumentation for fluorescence imaging and robust computational infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of antibody labeling and fixation protocols.
- Adaptable to various model systems with protocol optimization for different protein targets.
- Practical limitations include the need for high-quality reagents and careful control of autofluorescence.
