Name: 細胞および組織におけるグルコース取り込みの間接的尺度としての細胞外グルコース枯渇 Ex vivo (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 学ぶ細胞外グルコース枯渇測定法による細胞・組織のグルコース取り込み動態解析。3T3-L1マウス線維芽細胞を用いたハイスループットアッセイで、糖尿病やがんなどの代謝性疾患の治療薬開発に貢献します。

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このプロジェクトは、Ralph and Marian Falk Medical Research Catalyst AwardとKathleen Kelly Awardの支援を受けました。その他の支援には、国立研究資源センターUL1RR025755およびNIH医学研究ロードマップであるNCI P30CA16058(OSUCCC)が含まれていました。コンテンツは著者の責任であり、国立研究資源センターまたはNIHの公式見解を表すものではありません。

動物実験は、オハイオ州立大学の施設動物ケアおよび使用委員会(OSU、プロトコル2007A0262-R4)によって承認された。
メモ:すべての手順は、送風機がオンでライトが消灯したクラスIIバイオセーフティキャビネットで行う必要があります。
1. 資料作成
メモ: すべての材料は、 材料の表にリストされています。
<ol><li>培地1、遠心分離培地2、およびクラスIIバイオセーフティキャビネット内で表1に従って蛍光2−デオキシ−2−[(7−ニトロ−2,1,3−ベンゾオキサジアゾール−4−イル)アミノ]−D−グルコース(2−NBDGまたは FD グルコース)の貯蔵および作業溶液を調製する。フードの下のすべてのライトをオフにして、実験を通してFD-グルコースを光から保護します。</li>
	<li>すぐに使用できる細胞培養試薬を使用する:トリプシン-EDTA、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、およびグルコースフリーおよびフェノールレッドを含まないダルベッコ改変イーグル培地(以下、グルコースフリーDMEM)。</li>
	<li>20 mL のラジオイムノ沈降アッセイ (RIPA) 溶解バッファーを使用します。 注:以下のセクションでは、インスリン刺激の有無にかかわらず、3T3-L1線維芽細胞において、異なるFD-グルコース用量の細胞外枯渇および細胞内取り込みを比較します(図2)。</li>
</ol>2. 3T3-L1細胞の培養と維持
<ol><li>20 mLの培地1で希釈した1 x 106細胞を2つの96 ウェルプレートにプレーティングして3T3−L1マウス線維芽細胞を培養する。1ウェルあたり100 μLの細胞懸濁液をプレートに、混合することによってこの懸濁液の均質性を維持するようにする。約70%〜80%のコンフルエントになるまで培地を交換せずに、37°Cのインキュベーター(5%CO2 および湿度95%)中で48時間細胞を増殖させる。</li>
	<li>細胞をコンフルエントに保ち、同じ培地で48時間培養して絶食させる。所望の空腹時異化状態に応じて、インキュベーション時間を24〜72時間から変化させる。</li>
</ol>3. 3T3-L1細胞の飢餓
<ol><li>96ウェルプレート内の細胞からの培地をデカントする。滅菌ペーパータオルを使用して残りの液体を吸収します。</li>
	<li>96ウェルプレートを1ウェルあたり100μLのPBSですすぎ、残りの液体を滅菌ペーパータオルで吸収します。</li>
	<li>1ウェルあたり100μLのグルコースフリーDMEMを加え、40分間インキュベートする。細胞の種類、刺激、および所望の空腹時レベルに応じてインキュベーションの時間を調整します。 注:インキュベーションの時間は、季節によっては最適化が必要な場合があります。</li>
</ol>4. 異なる濃度のFD-グルコース溶液の調製
注: 図2 の実験は、インスリンによる刺激の有無にかかわらず、細胞外および細胞間培地を調べます。
<ol><li>各刺激条件に対して8回の反復(96ウェルプレートで1列)を使用します。そこで、各刺激条件( 下記表2 に規定)ごとに1mLを用意する。</li>
	<li>インスリンを含まない8つの刺激条件を使用します:1つの96ウェルプレートで、2.5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL、0.05 μg/mL、および0 μg/mL(FD-グルコースを含まない対照)のFDグルコース。</li>
	<li>インスリン(10 μg/mL、最終濃度)で8つの刺激条件を使用します:FD-グルコース 2.5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL、0.05 μg/mL、および0 μg/mL(FD-グルコースを含まない対照)を別の96ウェルプレートで使用してください。</li>
	<li>刺激条件を調製するには、1 μL の 5 mg/mL FD-グルコース作動溶液 (表 1) を 999 μL のグルコース非含有 DMEM に希釈し、1 mL の作業原液 (1:1000 希釈または 5 μg/mL) を得ます。<ol><li>この作業ストック溶液を用いて、FD-グルコースの希釈液を1:2000、1:5000、1:10,000、1:25,000、1:50,000、および1:100,000希釈して、照明のないバイオセーフティキャビネットでの実験の直前に、2.5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL、および0.05 μg/mL(表2)の希釈液を2 mLチューブに調製します。</li>
	</ol></li>
	<li>ステップ4.4を繰り返し、上記の各条件に1 μLのインスリン(10 mg/mL、最終濃度)を追加します。 注:これらのサンプル中のインスリンの最終濃度は、10 μg/mL = 1.7 nmol/mLです。均質化を達成するために、他の溶液を加える前にチューブにインスリンを加える。</li>
</ol>5. 飢餓状態の3T3-L1細胞の治療
<ol><li>40分間のインキュベーション後、各ウェルからグルコースフリーDMEMを96ウェルプレートにデカントし、残りの流体を滅菌ペーパータオルで吸収する。</li>
	<li>上記のさまざまな処理条件からそれぞれ 100 μL (ウェルあたり) を 1 カラムに沿ったウェルに、同じ処理条件から 100 μL (ウェルあたり) を行に沿ってウェルに 100 μL (1 ウェルあたり) ずつ追加します (8 回の反復) 両方の 96 ウェルプレートで。インスリンの有無にかかわらず条件を利用したプレートにラベルを付けます。グルコースフリーDMEMのみをコントロールウェルに加える(n=8)。</li>
	<li>プレートを暗所で細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO2、および湿度95%)で40分間インキュベートする。</li>
</ol>6. 刺激型3T3-L1細胞の細胞外および細胞間測定
<ol><li>細胞を40分間刺激した後、刺激培地を両方のプレートから同じ実験レイアウトを維持した新しい96ウェルプレートに移す。</li>
	<li>元の刺激された96ウェルプレートからの残りの溶液を滅菌ペーパータオル上の細胞でデカントする。</li>
	<li>任意選択で、PBSで細胞を洗浄する。PBSを取り出し、滅菌ペーパータオルに残っている溶液をデカントします。</li>
	<li>各ウェルに100 μLのRIPA溶解バッファーを追加します。任意選択で、タンパク質を保護するためにRIPA緩衝液にプロテアーゼ阻害剤を加える。RIPAを含むプレートをシェーカーに30分間入れます。</li>
	<li>マイクロプレートリーダー(材料表)を用いて、まず細胞外FDグルコースを含む培地中で、それぞれ485nmおよび535nmの励起(Ex)および発光(Em)波長での蛍光を測定し、次いで、プレートを30分間インキュベーションの終了時にRIPA溶解細胞と共に測定する(ステップ6.4参照)。</li>
</ol>7. 細胞内グルコース取り込みのタンパク質ベースの正常化
注:細胞内FD-グルコース取り込みは細胞数に依存する。細胞溶解物中のタンパク質レベルは、細胞内FD-グルコースレベルを各ウェルの細胞数に正規化することを可能にする細胞数に比例する。
<ol><li>製造業者の指示に従ってBCAタンパク質アッセイを行う( 材料表を参照)。RIPA溶解細胞を含む各ウェル中のタンパク質濃度を定量する。</li>
	<li>10 μL の RIPA ホモジネートを使用し、タンパク質濃度を 3 連で測定して、96 ウェルプレートでの測定精度を高めます。</li>
	<li>分析したタンパク質標準物質(0、10、20、30、40、50、および60 μg/mLタンパク質)と各96ウェルプレート上のサンプルに基づいてタンパク質を定量します。</li>
	<li>562nmの吸光度を測定し、タンパク質標準品について得られた線形回帰式に基づいて各サンプル中のタンパク質濃度を定量する。</li>
	<li>各ウェルの蛍光値/タンパク質濃度を使用して、細胞内FD-グルコースのレベルを正常化する。細胞外FD-グルコース枯渇は正常化を必要としない。</li>
	<li>必要に応じて、追加の正規化(100%)のために対照サンプルの平均ベースライン値を使用します。</li>
</ol>8. 臓器における細胞外FDグルコース枯渇の Ex vivo 測定
<ol><li>以下のように、臓器郭清の前に糖代謝を刺激する化合物でマウスを前処理する。</li>
	<li>9週齢の Lepob 雄マウス(n=11)を使用する。実験の前に、すべてのマウスに通常のチャウ食を与えてください。</li>
	<li>マウスを腹腔内(i.p.)注射のために3つのグループにランダムに割り当てる。<ol><li>対照 Lepob 群のマウスに0.1mLの滅菌PBS(n = 4)を注射する。</li>
		<li>インスリンLep ob群のマウスに、体重1グラムあたり12IUのヒトインスリン(BW)を含む0.1mLの滅菌PBSを注射する(n = 3)。</li>
		<li>AAC2 Lepob 群のマウスに、体重1グラム当たり0.1nmolのAAC2(BW)を含む0.1mLの滅菌PBSを注射する(n = 4)。</li>
	</ol></li>
	<li>15分後、対象マウスを5%イソフルランの吸入にかけ、麻酔した動物26から心臓穿刺により血液を除血した。</li>
	<li>各動物の内臓上体白脂肪組織(200mg)、肝臓(200mg)、および全脳を解剖する。組織処理にはクラスIIバイオセーフティフードを使用してください。</li>
	<li>FD-グルコース(0.29 mM)作業溶液をグルコースフリーDMEM中で、光のないクラスIIバイオセーフティキャビネットで調製します。</li>
	<li>マイクロプレートリーダーを使用して、励起波長と発光波長がそれぞれ485 nmおよび535 nmのFD-グルコース作動溶液(0.29 mM)の蛍光を測定します。</li>
	<li>採取した組織/臓器をPBSを含む6ウェルプレートで1分間インキュベートします。各組織または器官を別々の井戸で処理します。</li>
	<li>1分後、各ティッシュを滅菌ペーパータオルの上に置き、PBSを吸収します。組織/臓器を4,000 μLのグルコースフリーDMEMを含む別の6ウェルプレートに移し、2分間インキュベートします。</li>
	<li>2分後、組織を除去し、0.29 mM FD-グルコース作業溶液(1 mL/ウェル)を含む6ウェルプレートのウェルに移します。組織を含む6ウェルプレートをFD-グルコース作業溶液中で37°C(5%CO2 および湿度95%)でインキュベートする。</li>
	<li>0、10、20、30、40、60、90、および120分のインキュベーション後に各ウェルから100μLのFDグルコース作動溶液を採取し、細胞外FDグルコース枯渇の動態を分析した。収集前後に振る。</li>
	<li>100 μLのFD-グルコース作動溶液を96ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダーを使用して、励起波長と発光波長がそれぞれ485nmおよび535nmの蛍光を測定しました。</li>
	<li>各動物の各臓器について蛍光を0分値(100%)に正規化します(図3)。</li>
</ol>

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</ol>

著者には開示すべき問題はなく、利益相反もありません。

細胞外FD-グルコース枯渇と細胞培養における正規化された細胞内グルコース取り込みとの直接比較は高い相関関係を示し、細胞外グルコース枯渇がグルコース取り込み評価のための代理測定である可能性があることを示唆した。細胞外FD-グルコースの測定には、広範囲のFDグルコース濃度を使用することができ、また、0.5-2.5μgのFD-グルコース/mLが最適な範囲を提供するようである。細胞外FD-グルコースは、細胞内FD-グルコース取り込みに必要な細胞数またはタンパク質濃度への正規化を必要としない。細胞外FD-グルコース測定の予想される限界は、活性酸素種誘導剤および蛍光を消光することができる外植体内の血液の痕跡の調査である。光などの蛍光に影響を与える他の環境要因も考慮する必要があります。複数の組織外植体を使用している間に必要な取り扱い時間が長くなると、組織の生存率とグルコース代謝が損なわれる可能性があります。これは追加の制限になる可能性があります。切除された組織は、組織内のグルコースの透過性を可能にするために、小さなサイズ範囲(50〜300mg)にある必要がある。複数のオペレータによる組織の同時処理により、処理時間を短縮できます。我々は、組織外植体内の...

グルコース取り込みを測定するための需要は、グルコース代謝に依存する多数の疾患の流行の増加に対処するための重要な必要性とともに上昇する。変性代謝疾患の根底にあるメカニズムは、神経学的および認知障害1、炎症性2および感染症3、癌4、5、ならびに加齢6について、エネルギーおよびその貯蔵、同化プロセス、タンパク質、および遺伝子修飾、シグナル伝達、遺伝子の調節、ならびに核酸合成および複製のためのグルコース代謝に依存する7,8,9.真性糖尿病(DM)は、グルコース取り込み調節の機能不全に直接関係している。DMは、1型、-2型、および-3型真性糖尿病、妊娠糖尿病、若年者の成熟発症糖尿病、および環境的および/または遺伝的要因によって誘発される他のタイプのこの疾患などの慢性疾患のスペクトルである。2016年、糖尿病に関する最初のWHOグローバルレポートは、最も広範なDMとともに生きる成人の数が1980年以来ほぼ4倍に増加し、成人10人の4億2,200万人に増加し、このDM患者の数は過去数十年間指数関数的に増加していることを実証しました。2019年だけでも、推定150万人の死亡がDM10によって直接引き起こされました。この劇的な上昇は、タイプ2 DMの増加と、太りすぎや肥満を含むそれを駆動する状態によるものです10。COVID-19のパンデミックは、一般集団と比較してDM患者の死亡率が2倍に増加することを明らかにし、免疫防御におけるグルコース代謝の深遠でありながらあまり理解されていない役割を示唆しています3。DM、肥満、およびその他の疾患の予防、早期診断、および治療には、異なる組織によるグルコース取り込みの測定の最適化、およびグルコース取り込みに影響を及ぼす環境11、栄養12、内分泌13、遺伝的14、およびエピジェネティック15因子の同定が必要である。
研究において、グルコースの細胞内および/または組織内取り込みは、一般に、インビトロ16、17、18およびインビボ19で蛍光標識されたグルコース(FD-グルコース)によって測定される。FD-グルコースは、放射性標識グルコース20、分析質量分析21、メタボロミクス22、核磁気共鳴法23、陽電子放射断層撮影/コンピュータ断層撮影法(PET/CT)5,24を用いたより正確な方法と比較して好ましい方法となった。FD-グルコース取り込みとは異なり、より多くの生物学的材料を必要とする分析方法は、多段階のサンプル調製、高価な機器、および複雑なデータ分析を含む可能性がある。細胞培養におけるFD-グルコース取り込みの効果的かつ安価な測定は、概念実証実験で利用されており、他の方法による検証が必要な場合がある。
グルコース取り込み研究のためのFD-グルコース適用の基礎は、内因性グルコースと比較してFD-グルコースの代謝の低下である25。それにもかかわらず、内因性グルコースおよびFDグルコースの両方が、同化、異化、およびシグナル伝達プロセスで使用するために、すべての細胞コンパートメント間で動的に分布する。FD-グルコースの区画化および時間依存性処理25 は、蛍光測定を妨害し、ハイスループットスクリーニング実験、速度論的分析、3D細胞培養、共培養、および組織外植実験におけるこのアッセイの使用のための主要な制限因子を表す。ここでは、FD-グルコースの細胞外枯渇とその細胞内取り込みとの間に高い相関関係を示すデータを提供し、細胞内グルコース取り込みの代理測定としてのFD-グルコースの細胞外枯渇を示唆する。グルコースの細胞外枯渇の測定を、インスリンおよび実験薬物18 で処置したマウスにおけるグルコース取り込みの組織特異的差異を検証するために適用し、この方法の原理証明を提供する。
現在のプロトコールは、3T3-L1細胞におけるFDグルコース取り込みの細胞内および細胞外(図1)測定値を記載している。プロトコルセクション1〜7は、48時間の細胞の培養および増殖を説明する。細胞飢餓、刺激、およびベースライン細胞外測定;細胞外FD-グルコースの刺激後測定およびFD-グルコースおよびタンパク質の細胞内測定。プロトコールセクション8は、他の箇所に記載されるインスリンおよびアミノ酸化合物2(AAC2)の存在下および非存在下でob/obマウスから解剖された組織におけるFDグルコースの細胞外取り込みのエクスビボ測定を記載している18。

<table><tbody><tr><td>3T3-L1マウス線維芽細胞ATCC</td><td></td><td>CL-173</td><td>細胞株</td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>Falcon</td><td>353227</td><td>プラスチック製品</td></tr><tr><td>B6。V-Lepob/J 雄マウス</td><td>Jackson Laboratory</td><td>在庫番号 000632</td><td>マウス</td></tr><tr><td>BioTek Synergy H1 モジュール式マルチモードマイクロプレートリーダー (Fisher Scientific, 米国)</td><td>Fisher Scientific, 米国</td><td>&nbsp;B-SHT</td><td>デバイス</td></tr><tr><td>ウシ血清</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>161790-060</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>子牛血清</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>26010-066</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>細胞インキュベーター</td><td>Forma</td><td>Series II ウォータージャケット</td><td>デバイス</td></tr><tr><td>ダイエット (マウス/ラットダイエット、照射)</td> <td>Envigo</td><td>Teklad LM-485</td><td>ダイエット</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td> <td>シグマライフサイエンス</td><td>D2650-100mL</td><td>試薬</td></tr><tr><td>ダルベッコ モディファイド イーグル ミディア</td>ム <td>Gibco/ThermoFisher</td><td>&nbsp;11965-092</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Σ Aldrich</td><td>E7023-500mL</td><td>試薬</td></tr><tr><td>蛍光 2-デオキシ-2-[(7-ニトロ-2,1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル) アミノ]-D-グルコース)</td><td>シグマ</td><td>72987-1MG</td><td>アッセイ</td></tr><tr><td>グルコースフリーおよびフェノールレッドフリー DMEM</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>A14430-01</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>ヒトインスリン 10 mg/mL</td><td>MilliporeSigma, Cat N 91077C</td><td>Cat N91077C</td><td>試薬</td></tr><tr><td>イソフルラン、5%</td><td>ヘンリー・シャイン</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td>麻酔薬</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S)</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>15140-122</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>リン酸緩衝液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DA537-500 mL</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>Pierce ビシンコニン酸 (BCA) タンパク質アッセイ</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat N23225</td><td>アッセイ</td></tr><tr><td>ラジオ免疫沈降アッセイ 溶解バッファー</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-24948</td><td>アッセイ</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.05%)</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>&nbsp;25300-054</td><td>細胞培養</td></tr></tbody></table>

細胞および組織におけるグルコース取り込みの間接的尺度としての細胞外グルコース枯渇 ex vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

糖尿病の世界的な流行が続いているため、グルコースの取り込みに影響を与える環境的、栄養的、内分泌的、遺伝的、およびエピジェネティックな要因の同定に対する需要が高まっています。細胞内蛍光の測定は、インビトロで細胞内の蛍光標識グルコース(FD-グルコース)の取り込みをテストするため、または インビボでグルコースを消費する組織をイメージングするために広く使用されている 方法です。このアッセイは、選択された時点におけるグルコース取り込みを評価する。細胞内分析は、FD-グルコースの代謝が内因性グルコースの代謝よりも遅いと仮定し、これは異化および同化反応およびシグナル伝達に関与する。しかし、動的グルコース代謝はまた、取り込み機構を変化させ、これは異なる因子に応答してグルコース取り込みの速度論的測定を必要とするであろう。本稿では、細胞外FD-グルコース枯渇を測定する方法について説明し、 エキソビボの細胞および組織における細胞内FD-グルコース取り込みとの相関を検証します。細胞外グルコース枯渇は、ハイスループットの動態学的および用量依存的研究、ならびに血糖活性およびそれらの組織特異的効果を有する化合物の同定に潜在的に適用され得る。

細胞内摂取および細胞外グルコース枯渇は、インスリン刺激の有無にかかわらず、異なる濃度のFDグルコース(図2)に応答して、3T3−L1前駆脂肪細胞において測定された。 図2Aは 、FD−グルコースの細胞内取り込みの用量依存的増加を示し、これはインスリンの存在下で有意に増加した。同じ細胞における細胞外FD-グルコースの付随する減少を 図2Bに示し、ここでインスリン刺激は、インスリン刺激のないサンプルと比較して細胞外FD-グルコースレベルの有意な減少をもたらした。FD-グルコースの細胞内摂取は、インスリンの有無にかかわらずサンプルにおける用量依存的にFD-グルコースの細胞外枯渇と相関していた(図2C)。したがって、FD-グルコースの細胞外枯渇は、細胞内FD-グルコース取り込みと同等の精度(R2 =0.99、P&lt;0.001)でグルコース取り込みの変化を測定することができる。...

蛍光標識されたグルコースの細胞外枯渇は、グルコース取り込みと相関し、摘出した臓器および細胞培養物におけるグルコース取り込みのハイスループットスクリーニングに使用することができる。

細胞および組織におけるグルコース取り込みの間接的尺度としての細胞外グルコース枯渇 Ex vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

ブドウ糖の取り込みは、健康と病気を理解するための鍵です。グルコースは、人体の代謝および構造的要求において極めて重要な役割を果たし、調節において重要な役割を果たす。グルコースの細胞外測定により、栄養素や薬物に応答した異なる遺伝的背景の細胞、組織、および器官におけるグルコース取り込みの動態に関するハイスループットアッセイの開発が可能になります。このアッセイは、糖尿病、癌、中枢神経系の変性疾患、肥満、およびグルコースと代謝のすべての疾患に対する治療法と栄養の発見のための貴重なツールとなるでしょう。アッセイでは、さまざまな組織や細胞培養の代謝特性に基づいて、飢餓と刺激の時間を調整する必要があります。培養3T3-L1マウス線維芽細胞を10〜6細胞にプレーティングし、20ミリリットルの培地1を296ウェルプレートで希釈した。1ウェル当たり100マイクロリットルの細胞懸濁液をプレートし、混合することによってこの懸濁液の均質性を維持することを保証する。培地を交換せずに摂氏37度のインキュベーターで、約70〜80%のコンフルエントになるまで48時間細胞を増殖させます。細胞を同じ培地で48時間培養することにより、細胞をコンフルエントで絶食状態に保ちます。所望の空腹時異化状態に応じて、インキュベーション時間を24〜72時間に変化させる。96ウェルプレート内の細胞からの培地をデカントします。滅菌ペーパータオルを使用して残りの液体を吸収します。96ウェルプレートをウェルあたり100マイクロリットルのPBSですすぎ、残りの液体を滅菌ペーパータオルで吸収します。ウェルあたり100マイクロリットルのグルコースフリーDMEMを加え、40分間インキュベートします。細胞タイプの刺激、および希望する絶食レベルに応じてインキュベーション時間を調整します。シミュレーション条件ごとに8回の反復を使用します。そのため、シミュレーション条件ごとに1ミリリットルを用意してください。インスリンなしで7つのシミュレーション条件を使用します。196ウェルプレートにおける1ミリリットル当たり2.5マイクログラム、1ミリリットル当たり1マイクログラム、ミリリットル当たり0.5マイクログラム、1ミリリットル当たり0.2マイクログラム、1ミリリットル当たり0.1マイクログラム、1ミリリットル当たり0.05マイクログラム、および1ミリリットル当たり0ミリグラムのFDグルコース。インスリンで7つの刺激条件を使用します。別の96ウェルプレートにおける1ミリリットル当たり2.5マイクログラム、1ミリリットル当たり1マイクログラム、ミリリットル当たり0.5マイクログラム、1ミリリットル当たり0.2マイクログラム、1ミリリットル当たり0.1マイクログラム、1ミリリットル当たり0.05マイクログラム、および1ミリリットル当たり0マイクロ

extracellular-glucose-depletion-as-an-indirect-measure-glucose-uptake

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このビデオは、細胞内のグルコース取り込みを間接的に測定するin...

In vitro Glucose Depletion Assay:細胞外グルコース枯渇測定による細胞グルコース取り込みを定量化する蛍光ベースの方法

このビデオでは、採取したマウス臓器の細胞外グルコースアナログ枯渇を測定するex...

細胞外蛍光グルコースアナログ枯渇の測定:マウス臓器におけるグルコース取り込みをex vivoで評価するための代理測定技術

ここでは、in vitroでのグリコーゲンの滴定のために、正確で再現性のある便利な生化学的方法を記載する。この手法は、アブカムグリコーゲンアッセイキットを使用し、蛍光により滴定グルコースとグルコースへのグリコーゲンの連続加水分解に基づく。...

グリコーゲンの生化学的滴定<em&gt;インビトロ</em

単球は、活性化時に解糖代謝に依存する人間の自然免疫系の不可欠な構成要素です。新鮮な全血中の全単球および単球亜集団によるグルコーストランスポーターの発現とグルコース取り込みを測定するためのフローサイトメトリープロトコルについて説明します。...

シンプルなフローサイトメトリー法は、全血における単球亜集団のためのグルコース取り込みおよびグルコーストランスポーターの発現を測定するために

この研究は、18F-FDGおよび陽電子放出断層撮影/コンピュータ断層撮影(PET/CT)イメージングをキネティックモデリングと共に使用して、18F-FDGの組織へのin...

使用するグルコース代謝動態を決定します<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDGマイクロPET / CT

この方法では、ヒト初代筋細胞をin vitroで培養して分化した筋管を得、グルコース取り込み速度を測定する。我々は、放射性標識[ 3 H] 2  - デオキシ-D-グルコースを用いて、基礎およびインスリン刺激状態における速度を定量化するための詳細なプロトコルを提供する。...

インスリン刺激に対するグルコース取り込み測定と応答<em&gt;インビトロ</em&gt;培養ヒト初代筋管

この手法では、酸素消費量と細胞外酸性化率 explanted マウス網膜組織細胞フラックス...

細胞外のフラックスを用いた Explanted 網膜組織のエネルギー代謝の測定

筋肉グルコース取り込みの無傷の調節は、全身グルコース恒常性を維持するために重要である。このプロトコルは、全身のグルコース代謝に対する様々な生理学的介入の影響を描写する際に、単離およびインキュベートされた成熟骨格筋におけるインスリンおよび収縮刺激グルコース取り込みの評価を提示する。...

マウスから単離およびインキュベートされた成熟骨格筋におけるインスリンおよび収縮刺激グルコース取り込みの測定

グルコース取り込みは、FRETベースの遺伝的にコードされたグルコースセンサーによって示されるように、TAR DNA結合タンパク質(TDP-43)タンパク質障害の影響を受ける ショウジョウバエ...

TDP-43蛋白症の ショウジョウバエ モデルにおけるグルコース取り込みの測定

脂肪細胞におけるトリグリセリド脂肪分解は、遊離脂肪酸およびグリセロールの遊離をもたらす重要な代謝プロセスである。ここでは、マウスの脂肪細胞および ex vivo...

in vitroで分化したマウス脂肪組織および初代前駆脂肪細胞における脂肪分解の速度の測定

網膜には、内皮細胞、ニューロン、グリア細胞など、複数の細胞タイプがグルコーストランスポーター(GUT)を発現し、グルコースの細胞への取り込みを可能にします。 ex vivo...

無傷のマウス神経網膜におけるグルコースアナログ、6-(N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ)-6-デオキシグルコースの取り込みの測定

学ぶ細胞外グルコース枯渇測定法による細胞・組織のグルコース取り込み動態解析。3T3-L1マウス線維芽細胞を用いたハイスループットアッセイで、糖尿病やがんなどの代謝性疾患の治療薬開発に貢献します。

細胞および組織におけるグルコース取り込みの間接的尺度としての細胞外グルコース枯渇 Ex vivo

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