Name: ポジティブセンスRNAウイルス変異体を改変するためのリバースジェネティクス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 49 s
Description: 学ぶポジティブセンスRNAウイルスのリバースジェネティクス改変法。エラープローンPCRを用いてC型肝炎ウイルスゲノムに遺伝的多様性を導入し、表現型選択を可能にするクローニング不要の迅速ライブラリ構築プロトコルです。

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この研究の資金援助(助成金番号BT/PR10906/MED/29/860/2014)は、インド政府バイオテクノロジー局によって提供されました。

<ol><li>Desselberger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetics+of+rotavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reverse genetics of rotavirus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2106-2108 (2017).</li>
<li>Singh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mutagenesis+of+hepatitis+C+virus+reveals+ability+of+genome+to+overcome+detrimental+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mutagenesis of hepatitis C virus reveals ability of genome to overcome detrimental mutations.</a> Journal of Virology. 94 (3), 01327(2020).</li>
<li>Agarwal, S., Baccam, P., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+synthesis+and+phenotypic+analysis+of+mutant+clouds+for+hepatitis+E+virus+genotype+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Novel synthesis and phenotypic analysis of mutant clouds for hepatitis E virus genotype 1.</a> Journal of Virology. 92 (4), 01932(2018).</li>
<li>Edmonds, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+bacterium-free+method+for+generation+of+flavivirus+infectious+DNA+by+circular+polymerase+extension+reaction+allows+accurate+recapitulation+of+viral+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A novel bacterium-free method for generation of flavivirus infectious DNA by circular polymerase extension reaction allows accurate recapitulation of viral heterogeneity.</a> Journal of Virology. 87 (4), 2367-2372 (2013).</li>
<li>Arumugaswami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+functional+profiling+of+hepatitis+C+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome.</a> PLoS Pathogens. 4 (10), 1000182(2008).</li>
<li>Heaton, N. S., Sachs, D., Chen, C. -J., Hai, R., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mutagenesis+of+influenza+virus+reveals+unique+plasticity+of+the+hemagglutinin+and+NS1+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mutagenesis of influenza virus reveals unique plasticity of the hemagglutinin and NS1 proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20248-20253 (2013).</li>
<li>Eyre, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mutagenesis+of+dengue+virus+reveals+plasticity+of+the+NS1+protein+and+enables+generation+of+infectious+tagged+reporter+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mutagenesis of dengue virus reveals plasticity of the NS1 protein and enables generation of infectious tagged reporter viruses.</a> Journal of Virology. 91 (23), 01455(2017).</li>
<li>Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution%3A+Past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22AIChE+Journal.+American+Institute+of+Chemical+Engineers%22%5BJournal%5D)">Directed evolution: Past, present, and future.</a> AIChE Journal. American Institute of Chemical Engineers. 59 (5), 1432-1440 (2013).</li>
<li>Sen, S., Venkata Dasu, V., Mandal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+directed+evolution+for+improving+enzyme+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Developments in directed evolution for improving enzyme functions.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 143 (3), 212-223 (2007).</li>
<li>Yuan, L., Kurek, I., English, J., Keenan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory-directed+protein+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Laboratory-directed protein evolution.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 373-392 (2005).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DNA+by+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).</li>
<li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturation+and+electrophoresis+of+RNA+with+formaldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Denaturation and electrophoresis of RNA with formaldehyde.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 219-222 (2015).</li>
<li>Lindenbach, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+HCV+infectivity+produced+in+cell+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring HCV infectivity produced in cell culture and in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 510, 329-336 (2009).</li>
<li>Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+calculation+of+TCID50+for+quantitation+of+virus+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Virologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">On the calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity.</a> Virologica Sinica. 36 (1), 141-144 (2021).</li>
<li>Soni, S., Singh, D., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+fitness+of+hepatitis+C+virus+increases+resistance+to+direct-acting+antivirals%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Enhanced fitness of hepatitis C virus increases resistance to direct-acting antivirals.</a> The Journal of General Virology. 103 (2), (2022).</li>
<li>Khan, S., Soni, S., Veerapu, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCV+replicon+systems%3A+Workhorses+of+drug+discovery+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">HCV replicon systems: Workhorses of drug discovery and resistance.</a> Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 10, 325(2020).</li>
<li>Cadwell, R. C., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomization+of+genes+by+PCR+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Randomization of genes by PCR mutagenesis.</a> PCR Methods and Applications. 2 (1), 28-33 (1992).</li>
</ol>

著者は何も開示していません。

この研究では、HCV全ゲノムライブラリを合成するためにep-PCR18 とリバースジェネティクスを統合し、細胞培養システムで使用して、薬剤耐性表現型のスクリーニングのための複製可能なバリアントを生成できる、シンプルで迅速なFL-MRS手順を詳しく説明しました。低忠実度のTaq DNAポリメラーゼの使用は、完全長ウイルスゲノムのPCR増幅中に置換の取り込みを可能にするep-PCRの前提条件です。いくつかの低忠実度のTaq DNAポリメラーゼを試験したところ、Platinum Taq DNAポリメラーゼは~10 kbサイズのep-PCR産物を高収率で得られることがわかりました(データは示していません)。固定数の熱サイクルを使用し、インプットテンプレートの量を変化させて、全ゲノムライブラリの変異の割合を制御することをお勧めします。FL-MRSが完全長のウイルスRNAのテンプレートとして誤った全ゲノムを利用するので、プライマーセットの慎重な設計はRNAの統合の反作用が定義された長さのウイルスの転写物を作り出すことを保証するために重大である: (i)前方プライマーはep-PCRのプロダクトに結合する...

フォワード遺伝子スクリーニングは、目的のウイルス表現型から始まり、そのゲノム配列を決定し、元の株と比較することで、その表現型の原因となる変異を特定しようとします。対照的に、逆遺伝子スクリーニングでは、標的遺伝子にランダムな変異を導入し、その後、結果として生じる表現型を調べます1。リバースジェネティクスアプローチでは、in vitro突然変異誘発は、その後、関心のある表現型についてスクリーニングされるバリアントのプールを作成するために最も広く使用されている手法です。RNAウイルスのゲノムワイドなランダム突然変異誘発を実現するために、エラーを起こしやすいPCR(ep-PCR)2,3、環状ポリメラーゼ伸長4、ミュートランスポゾン挿入突然変異誘発5,6,7など、さまざまな遺伝的ツールが報告されています。後者の2つの方法では、配列の多様性が限られており、大きな挿入や欠失が発生しやすく、ウイルスにとって致死性が高く、感染性ウイルス変異体の回復を著しく制限します。
ep-PCRは、熱安定性、基質特異性、触媒活性の向上など、所望の特性を持つ表現型を選択するための変異酵素を生成するために、タンパク質工学で広く使用されている有名な強力な突然変異誘発技術です8,9,10。この手法は、簡単な機器を必要とし、面倒な操作を必要とせず、市販の試薬を使用し、迅速であるため、実行が簡単です。さらに、高品質のライブラリを生成します。
本研究では、ゲノムワイドなランダム置換突然変異誘発とリバースジェネティクスを誘導するep-PCRを組み込んで、C型肝炎ウイルス(HCV)の全ゲノムを作製する完全長変異RNA合成法(FL-MRS)を開発しました。単一のヌクレオチドの挿入または欠失でさえ、ポジティブセンスRNAウイルス([+]ssRNA)にとって非常に有害です。したがって、PCRベースの置換突然変異誘発は、生存率の良いフル(+)ssRNAウイルスゲノムの大規模で多様なライブラリを繰り返し生成するための好ましい方法です。
FL-MRSは、ウイルスcDNAクローンに結合するプライマーセットの細心の注意を払った設計により、ゲノム長が~10 kbのポジティブセンスRNAウイルスに適用できる簡単なアプローチです。pJFH1は、HCV遺伝子型2aをコードする感染性cDNAクローンであり、ウイルスライフサイクルのすべてのステップを再現することができます。FL-MRSアプローチを用いて、ランダムに変異原化された全ゲノムライブラリー(変異体ライブラリー[ML])を合成し、変異に関連する特性に関する予備知識がなかった複製能力のあるJFH1変異体を作製することを実証しました。抗ウイルス薬に曝露すると、一部のウイルス変異体は、望ましい表現型の変化により、薬剤圧力を迅速に克服しました。ここで説明するプロトコルを使用すると、多数のウイルス変異体を生成することができ、(+)ssRNAウイルスの進化を研究する機会が生まれます。

<table><tbody><tr><td>1 kbとDNAラダー&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10787018</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 遠心分離機チューブ</td><td>Tarsons</td><td>500010</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 遠心分離チューブ</td><td>Tarsons 546021</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm 細胞培養皿&nbsp;</td><td>ターソンズ</td><td>960010</td><td></td></tr><tr><td>50 ml遠心分離管</td><td>ターソンズ</td><td>546041</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>メルク</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>アガロース&nbsp;</td><td>HiMedia</td><td>MB080</td><td></td></tr><tr><td>アグロースゲル電気泳動ユニット</td><td>BioRad</td><td>1704406</td><td></td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット、ClassII</td><td>ESCO</td><td>AC2 4S</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>HiMedia</td><td>MB083</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424-R</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect リアルタイム PCR 解析システム</td><td>BioRad</td><td>1855201</td><td></td></tr><tr><td>クローニングプレート 90 mm&nbsp;</td><td>ターソン</td><td>460091</td><td></td></tr><tr><td>CO2インキュベーター&nbsp;</td><td>ニューブランズウィック</td><td>ギャラクシー170R</td><td></td></tr><tr><td>Colibriマイクロボリューム分光計</td><td>Titertek-Berthold</td><td>11050140</td><td></td></tr><tr><td>DAB&nbsp;基材&nbsp;キット&nbsp;</td><td>アブカム</td><td>ab94665</td><td></td></tr><tr><td>dATP 溶液</td><td>NEB</td><td>N0440S</td><td></td></tr><tr><td>デオキシヌクレオチド (dNTP) 溶液セット</td><td>NEB</td><td>N0446</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート (DEPC)&nbsp;</td><td>SRL化学</td><td>46791</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>HiMedia</td><td>MB058</td><td></td></tr><tr><td>DMEM高グルコース</td><td>ロンザ</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>EcoR1-HF</td><td>NEB</td><td>R3101</td><td></td></tr><tr><td>EDTA四ナトリウム塩二水和物</td><td>HiMedia</td><td>GRM4918</td><td></td></tr><tr><td>エチジウムブロマイド</td><td>アムレスコ</td><td>X328</td><td></td></tr>ウ<tr><td>シ胎児血清&nbsp;</td><td>ギブコ</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド&nbsp;</td><td>Fishser Scientific</td><td>12755</td><td></td></tr><tr><td>ゲルドキュメンテーションシステム</td><td>ALPHA IMAGER</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG (H+L) 二次抗体、HRP</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A16066</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素 30%</td><td>Merck</td><td>107209</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>Nickon</td><td>&nbsp;ECLIPSE Ts2</td><td></td></tr><tr><td>LBブロス&nbsp;</td><td>HiMedia</td><td>M1245</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000年&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>116680270</td><td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>メカニカルピペットセット</td><td>エッペンドルフ&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td>3120000909</tr><tr><td>メタノール</td><td>メルク</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチップ0.2-10&マイクロ;l&nbsp;</td><td>ターソンズ</td><td>521000</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチップ10-100&マイクロ;l&nbsp;</td><td>ターソンズ</td><td>521010</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチップ200-1000&マイクロ;l&nbsp;</td><td>ターソンズ</td><td>521020</td><td></td></tr><tr><td>MOPSバッファ&nbsp;</td><td>GeNei</td><td>3601805001730</td><td></td></tr><tr><td>Nonessential aminoacids (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemically Competent&nbsp;E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td>E.coli DH5&alpha;</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>1105-021</td><td>minimal essential medium</td></tr><tr><td>PCR tubes 0.2 ml</td><td>Tarsons</td><td>510051</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin/streptomycin&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T Easy Vector System</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td>T-vector DNA</td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline (PBS)</td><td>HiMedia</td><td>TI1099</td><td></td></tr><tr><td>Phusion&nbsp;High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Pibrentasvir</td><td>Cayman Chemical</td><td>27546</td><td></td></tr><tr><td>ピペットコントローラー&nbsp;</td><td>ギルソン&nbsp;</td><td></td><td></td>F110120</tr><tr><td>Platinum Taq DNAポリメラーゼ&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>10966034</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td>統計解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini キット&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td>ウイルス分離キット</td></tr><tr><td>QIAprep スピン ミニプレップキット</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 精製キット</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td>cokum 精製キット</td></tr><tr><td>RNeasy ミニキット&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td>RNAクリーンアップキット</td></tr><tr><td>セロロジカルピペット 25 ml</td><td>サーモフィッシャー</td><td>170357N</td><td></td></tr><tr><td>セロロジカルピペット 5 ml</td><td>サーモフィッシャー</td><td>170355N</td><td></td></tr><tr><td>セロロジカルピペット10 ml</td><td>サーモフィッシャー</td><td>170356N</td><td></td></tr><tr><td>一本鎖 RNA マーカー 0.2-10 kb</td><td>メルク</td><td>R7020</td><td></td></tr><tr><td>スキムミルク&nbsp;</td><td>HiMedia</td><td>M530</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム 0.1 M 溶液</td><td>Merck</td><td>8591</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18080044</td><td>逆転写酵素</td></tr><tr><td>T100 サーマルサイクラー</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>T175 細胞培養フラスコ&nbsp;</td><td>ターソンズ</td><td>159910</td><td></td></tr><tr><td>T25細胞培養フラスコ&nbsp;</td><td>Tarsons</td><td>950040</td><td></td></tr><tr><td>T7 RiboMax Express 大規模 RNA 生産システム&nbsp;</td><td>プロメガ</td><td>P1320</td><td>&nbsp;大規模RNA生産システム&nbsp;</td></tr><tr><td>T75細胞培養フラスコ&nbsp;</td><td>Tarsons</td><td>950050</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA ポリメラーゼ</td><td>Genetix Biotech (Puregene)</td><td>PGM040</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4392653</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan RNA-to-CT&nbsp;1ステップ&nbsp;キット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>4392653</td><td>市販のqRT-PCRキット&nbsp;</td></tr><tr><td>TOPO-XL--2 完全PCRクローニングキット</td><td>Thermo Fisher</td><td>K8050-10</td><td>long-PCR産物クローニング用キット&nbsp;</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>HiMedia</td><td>TC072</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA溶液</td><td>HiMedia</td><td>TCL007</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>HiMedia</td><td>MB067</td><td></td></tr><tr><td>真空濃縮器&nbsp;</td><td>エッペンドルフ、コンセントレータープラス</td><td>100248</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス&nbsp;</td><td>グラント</td><td>JBN-18</td><td></td></tr><tr><td>XBA1</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td></td></tr></tbody></table>

ポジティブセンスrnaウイルス変異体を改変するためのリバースジェネティクス

Reverse Genetics to Engineer Positive-Sense RNA Virus Variants

多様な完全長ウイルス変異体を繰り返し生成するための便利な方法の欠如は、RNAウイルスの指向性進化の研究を妨げてきました。フルRNAゲノムエラーを起こしやすいPCRとリバースジェネティクスを統合することで、ランダムなゲノムワイドな置換突然変異誘発を誘導することができます。私たちは、この手法を用いて多様なライブラリを合成し、目的の表現型を持つウイルス変異体を同定する方法を開発しました。完全長変異体RNA合成(FL-MRS)と呼ばれるこの方法は、次の利点を提供します:(i)非常に効率的なワンステップエラーを起こしやすいPCRを介して大規模なライブラリを作成する能力。(ii)DNAポリメラーゼの忠実度を操作することにより、さまざまなレベルの遺伝的多様性を有するライブラリのグループを作成する能力。(iii)変異体RNA合成の鋳型として直接役立つことができる完全長PCR産物の作成。(iv)所望の表現型のウイルス変異体をスクリーニングするための非選択インプットプールとして宿主細胞に送達できるRNAを作製する能力。我々は、逆遺伝学アプローチを用いて、FL-MRSがC型肝炎ウイルスであるJFH1分離株のライフサイクルのすべての段階でウイルス指向性進化を研究するための信頼できるツールであることを発見しました。この手法は、ポジティブセンスRNAウイルスの病因と抗ウイルス耐性における適応、複製、およびウイルス遺伝子の役割を理解するために、指向性進化を採用するための非常に貴重なツールであるように思われます。

多数の完全長HCV多様体を作製し、 図1に記載の手順に従って目的の薬剤耐性表現型をスクリーニングすることができる。全ゲノム変異体ライブラリーは、 図2に示すように、Clonnal-pJFH1を用いて量を減らして(100-10 ng)合成しました。ep-PCR産物(変異体ライブラリ)の平均収量は3.8-12.5 ng/μLの範囲でした。 図3 に、クローンpJFH1と代表的な変異体ライブラリ(50 ngのクローンpJFH1を用いて合成したML50)から合成したウイルス転写産物を示します。クローンpJFH1は XbaI 消化によって直鎖化され、ML50は in vitro 転写反応で直接使用されました。 図4に示すように、ep-PCR反応におけるインプットpJFH1の減少に伴い、変異体ライブラリー(変異ウイルスRNA)の変異の割合が増加しました。50 ng のテンプレー...

プロトコルは間違いが傾向があるPCRおよび逆の遺伝学を使用して完全長の突然変異体のRNAの統合の結合によって肝炎のウイルスのゲノムの制御可能な遺伝の多様性をもたらすための方法を記述する。この方法は、表現型選択のモデルを提供し、長さ10 kbのポジティブセンスRNAウイルスゲノムに使用できます。

ポジティブセンスRNAウイルス変異体を改変するためのリバースジェネティクス

The lack of a convenient method for the iterative generation of diverse full-length viral variants has impeded the study of directed evolution in RNA ...

ここに記述されているプロトコルは長さの10キロバイトまでの一本鎖肯定的なRNAのウイルスのゲノムの任意に突然変異させた完全長のRNAの図書館の生成、および望ましい実験条件の下で興味の表現型の選択を可能にする。この手法では、クローニングフリーのアプローチにより、さまざまなレベルの遺伝的多様性を持つ完全長ウイルスRNAライブラリを短時間で作成できます。この技術は、安価で広く入手可能な試薬をライブラリの合成に利用します。この手順を実演するのは、シブ・ナダール大学生命科学部ウイルス学セクションの博士課程の学生であるシャヒーン・カーン氏です。まず、本文原稿に記載されているように、pJFH1テンプレートを含まない反応成分とともに、フォワードプライマーとリバースプライマーを含む4セットの実験用のマスターミックスを調製して、ep-PCRを実施します。マスターミックスを4本のチューブに分注します。100ナノグラム、50ナノグラム、25ナノグラム、および10ナノグラムのテンプレートを個々のチューブに追加し、反応の総容量を50マイクロリットルに調整します。サイクリング条件を適用して、97 36塩基対フラグメントを増幅します。5マイクロリットルのPCR産物をロードし、0.8%TAEベースのアガロースゲル電気泳動を実行して、既知の量の1キロベースDNAラダーと比較することによって増幅されたep-PCR産物を推定します。カラム精製キットを使用して製品を精製します。260ナノメートルの吸光度を測定することにより、精製生成物の濃度を推定します。ep-PCR産物を真空濃縮して、1マイクロリットルあたり100ナノグラム以上の製品濃度を得る。in vitro RNA合成反応をセットアップし、摂氏37度でインキュベーションします。次に、カラム精製キットを使用して合成生成物を精製します。メーカーの推奨に従って、約1マイクログラムのウイルスRNA、5マイクロモルのリバースプライマー、および200ユニットの逆転写酵素を添加して、20マイクロリットルのcDNA合成反応をセットアップします。cDNAを用いて、本文原稿に記載の反応混合物を調製し、増幅サイクルを実行します。0.8%TAEベースのアガロースゲルで分析し、25個の71塩基対の製品サイズを確認してから、前述のようにカラム精製キットを使用して製品を精製します。40マイクロリットルの滅菌水に溶出する。3 プライム A オーバーハングを追加するには、0.5 マイクロモルの DATP と 1 ユニットの低フィデリティ Taq DNA ポリメラーゼを添加し、1X PCR バッファーと 1.5 mm の塩化マグネシウムとともに、PCR 産物全体を摂氏 70 度で 30 分間インキュベートします。次に、カラム精製キットを使用して混合物を精製します。ライゲーション反応をセットアップし、室温で3時間インキュベートします。次に、100マイクロリットルの大腸菌DH5-AlphaをライゲーションしたDNAに加え、細胞を摂氏42度で35秒間ヒートショックします。細胞懸濁液に1ミリリットルのLB培地を加え、37°Cで1時間穏やかに振とうしながらインキュベートします。13、800 RCFで遠心分離します。上清を廃棄し、200マイクロリットルの新鮮なLB培地に再懸濁します。100マイクロリットルの形質転換大腸菌DH5-Alpha細胞を、1ミリリットルあたり50マイクログラムのアンピシリンを含むLBプレートに播種し、摂氏37度で16時間インキュベートします。1ミリリットルあたり50マイクログラムのアンピシリンを含む5ミリリットルのLB培地に25〜30コロニーのミニプレップを設置し、摂氏37度で一晩増殖させます。翌日、市販のキットでプラスミドを抽出し、200ナノグラムの単離プラスミド、2ユニットのEcoR1、およびすべてのコロニーの1X制限バッファーを使用して、10マイクロリットルの容量の制限酵素消化を行います。消化混合物を摂氏37度で3時間インキュベートした後、0.8%TAEベースのアガロースゲルに製品をロードして、プラスミドDNAの挿入を確認します。推奨プライマーを使用して、25 個の陽性クローンのプラスミドのサンガーシーケンシングを実行します。トランスフェクションの1日前に、細胞を分割し、血球計算盤を使用して生細胞の数をカウントします。次に、ヒト肝細胞腫7.5細胞を35ミリメートルの皿に入れ、2ミリリットルの完全DMEMに播種し、5%二酸化炭素を含む加湿インキュベーターで細胞を摂氏37度で16時間インキュベートします。翌日、10マイクロリットルのトランスフェクション試薬を50マイクロリットルの最小必須培地で希釈して転写産物脂質複合体を調製し、5マイクログラムのウイルス転写物を50マイクロリットルの最小必須培地で別途希釈します。両方の混合物を室温で10分間インキュベートします。次に、それらを単一の滅菌微量遠心チューブで混合し、室温で30分間インキュベートします。細胞インキュベーション後、培地を取り出し、予熱した1X PBSで細胞を2回洗浄し、1.5ミリリットルの最小限の必須培地を加えます。複合体をゆっくりと加え、皿を静かに渦巻かせて均一に分配します。細胞を摂氏37度、5%二酸化炭素で10時間インキュベートします。次に、培地を取り除きます。トランスフェクションした細胞を1ミリリットルの予熱した1X PBSで2回洗浄し、2ミリリットルの完全DMEMを加えます。ウイルス RNA 分離キットを使用して、140 マイクロリットルの培養上清からウイルス RNA を単離します。市販のqRT-PCRキットを使用して、10マイクロリットルのqRT-PCR反応をセットアップします。フォワードプライマーとリバースプライマーを使用し、HCV RNAの定量にプローブします。反応サイクルを48°Cで20分、95°Cで10°C、95°Cで15秒、60°Cで1分間の45サイクルに設定します。反応を実行し、ネガティブコントロールを設定します。並行して、10 倍に段階希釈した既知のコピー数の HCV 転写物を使用して検量線を作成し、ウイルス RNA を定量します。三重に演奏する。ヒト肝細胞腫7.5細胞を96ウェルプレートに播種し、ウイルスを添加する約16時間前に5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で細胞をインキュベートします。バイオセーフティークラスIIキャビネットで、ウイルスを10倍段階希釈します。ウェルあたり100マイクロリットルの希釈ウイルスを加えて細胞に感染させ、5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートします。3日後、感染細胞を0.1ミリリットルのPBSで3回洗浄し、0.1ミリリットルの氷冷メタノールでマイナス20°Cで20分間細胞を固定および透過処理します。ウェルを1X PBSで3回洗浄し、次にPBSTで1X洗浄します。PBSTを除去した後、PBSTに0.2%スキムミルクを含む0.1ミリリットルの1%BSAで細胞を室温で30分間ブロックします。ブロッキング溶液を除去し、1X PBSで調製した0.1ミリリットルの3%過酸化水素で細胞を5分間処理します。再度、細胞を1X PBSで2回洗浄し、PBSTで1X洗浄します。ウェルあたり50マイクロリットルの抗NS5A 9E10モノクローナル抗体を添加し、室温で1時間インキュベートします。ウェルを1X PBSで3回、PBSTで1回洗浄します。ウェルあたり50マイクロリットルのHRP標識ヤギ抗マウス二次IgGを添加し、室温で30分間インキュベートした後、0.1ミリリットルの1X PBSでウェルを洗浄して非結合抗体を除去します。30マイクロリットルのDABを加え、室温で10分間穏やかに揺動しながらプレートをインキュベートします。DAB溶液を除去し、ウェルを1X PBSで2回、蒸留水で1回洗浄します。0.03%アジ化ナトリウムを含むPBSを100マイクロリットル添加します。10倍対物レンズを使用して、倒立光学顕微鏡で各ウェルを調べます。正の井戸の数を数えます。リードとミュンチの計算機を使用して、ウェルの 50% に感染するエンドポイント希釈を推定します。NS5A阻害剤であるピブレンタスビルを100%DMSOに1ミリモルの濃度に溶解し、さらに完全DMEMで10ナノモルの濃度に希釈します。次に、ナイーブHuh-7.5細胞にML50ウイルス用量を70%コンフルエンスで感染させて、細胞の50%を12時間感染させ、感染後24時間で感染した細胞を6ウェルプレートに移します。16時間の細胞分裂後、感染細胞に1X EC50 PIBを添加します。これは、すべての細胞が6回連続して継代で分裂した後、その後3回の薬物を使わない継代サイクルの後に行い、焦点形成アッセイを使用してウイルスの拡散を監視します。各継代でウイルス上清を採取し、マイナス80°Cで保存します。18日目に上清からウイルスRNAを抽出し、合成したcDNAを抽出します。5マイクロリットルの希釈cDNAを使用してNS5A遺伝子を増幅します。次に、NS5Aシーケンシングプライマーを使用して、6〜8個の陽性細菌プラスミドにおけるNS5A薬剤耐性変異を決定します。全ゲノム変異体ライブラリーは、クローンpJFH1を用いて、100ナノグラムから10ナノグラムに減少量で合成した。ep-PCR産物の平均収量は、マイクロリットルあたり3.8〜12.5ナノグラムの範囲であった。変異体ライブラリーにおける変異の割合は、ep-PCR反応におけるpJFH1のインプットの減少に伴って増加した。50ナノグラムの鋳型を用いて合成されたML50は、コピーされた10, 000塩基対あたり4つの置換を有したが、25ナノグラムの鋳型を用いて合成されたML25は、9つの置換を有していた。配列決定されたヌクレオチド数内の置換は、クローンpJFH1では見つかりませんでした。ML50ウイルス変異体は、クローン型JFH1ウイルスと比較してピブレンタスビルに対する感受性が低かった。8つのNS5Aクローンのうち、4つはD7V+F28Cの組み合わせを持ち、V8A+F28CとF36Lはそれぞれ1つのクローンで発生しました。これらの変異はNS5AのN末端領域にあり、臨床的に重要なNS5A耐性変異を有することが知られている。ep-PCRの各成分の最終濃度、特にテンプレート量は重要です。KBエクステンダーが不足すると、ep-PCR産物の収量が大幅に低下します。

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ポジティブセンスRNAウイルス変異体を改変するためのリバースジェネティクス

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