Name: 高解像度呼吸法による坐骨神経のミトコンドリア機能の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 学ぶ高解像度呼吸法による坐骨神経ミトコンドリア機能評価。酸素消費と活性酸素種を同時測定し、糖尿病や化学療法誘発神経症の病態解明と治療法開発に貢献する神経科学的手法です。

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この研究は、Instituto Serrapilheira、Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ)、Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)、Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil(CAPES)の資金提供を受けた。アントニオ・ガリーナ・フィーリョ博士、モニカ・モンテロ・ロメリ博士、クラウディオ・増田博士の研究室施設への支援、マーサ・ソレンソン博士の論文改善のための親切で貴重なコメントに感謝しています。

現在のプロトコルは、研究における動物の使用に関する倫理委員会、CCS/UFRJ(CEUA-101/19)、および実験動物のケアと使用に関する国立衛生研究所のガイドラインによって承認されています。坐骨神経は生後4ヶ月の雄性C57BL/6マウスから単離され、施設ガイドラインに従って子宮頸部脱臼によって安楽死する。プロトコルのステップは、ミトコンドリアの劣化を避けるために最適化されています。したがって、このプロトコールでは、マウス坐骨神経組織郭清および透過処理の前に、ポラログラフィック酸素センサの較正を実施した。
1. 試薬の調製
<ol><li>組織保存バッファー(TPバッファー)を調製する。<ol>
<li>10 mM の Ca-EGTA バッファーと 0.1 μM の遊離カルシウム、20 mM のイミダゾール、20 mM のタウリン、50 mM の K-MES、0.5 mM の DTT、6.56 mM の MgCl2、5.77 mM の ATP、15 mM のホスホクレアチン ( 材料表を参照)、pH 7.1。-20°Cで保管してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ミトコンドリア呼吸バッファー(MRバッファー)を用意する。<ol>
<li>0.5 mM のK2EGTA、3 mM の MgCl2、60 mM の MES、20 mM のタウリン、10 mM の KH2PO 4、20 mM の HEPES、110 mM の D-スクロース、1 mg/mL の BSA (脂肪酸フリー)(材料表を参照)、pH 7.4。-20°Cで保存してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>5mgのサポニン( 材料表を参照)を1mLのTP緩衝液に溶解してサポニン原液を調製し(ステップ1.1)、氷上に保管する。サポニンは新しく調製されています。</li>
	<li>粉末( 材料表を参照)をDMSOで再懸濁してAmplex Redを調製し、2mMのストック濃度を得て、光から保護されたバイアル中で-20°Cで保存する。 注:凍結および融解によるプローブの摩耗を避けるために、6ヶ月25以内の保管のために小さなアリコートを作成してください。</li>
</ol>2. 高解像度呼吸法(HRR)用のポラログラフィック酸素センサーの校正
<ol><li>器具とシリンジのHRRチャンバーを清掃します( 材料表を参照)。<ol>
<li>HRRチャンバーを開き、上部まで蒸留水で満たし、5分間3倍にかき混ぜる。エタノールで繰り返し、次に水でもう一度繰り返します。ストッパーとシリンジを水/エタノール/水でそれぞれ3倍ずつ洗浄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>HRRソフトウェアで次のキャリブレーション設定を適用します( 材料表を参照)。<ol>
<li>HRRソフトウェア制御では、実験温度(37°C)、酸素センサー(ゲイン、2、分極電圧、800mV)、アンペロメトリックセンサー(ゲイン、1000、分極電圧、100mV)のパラメータを追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>酸素センサーを校正します。<ol>
<li>2.1 mLのMRバッファーをピペット(ステップ1.2)各チャンバーに入れます。ストッパーで閉じ、気泡が形成されるまでチャンバーに空気を吸い込みます。質量あたりの酸素流束が安定するまで、校正モードで37°Cで1時間攪拌します。</li>
		<li>ソフトウェア内のポラログラフィック酸素センサの空気較正を、製造元のプロトコル24に従って実行する。 メモ: キャリブレーション手順は、実験の前に 1 回だけ実行されます。追加の実験は、同じ呼吸媒体および温度で、単にチャンバを洗浄した後に行うことができる(ステップ2.1)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 坐骨神経の解剖と透過
<ol><li>以下の手順に従って坐骨神経を取り外します。<ol>
<li>ケージから取り出した後、頸部脱臼によって動物を安楽死させ、ベンチで休むように穏やかに拘束する。</li>
		<li>安楽死させた動物では、背骨の近くから始めて、太ももを足に向かって進み、腰のはさみで切開します。神経に付着した皮膚や筋肉を取り除き、坐骨神経全体を切断して取り除きます。</li>
		<li>直ちに組織を秤量し、冷たいTBバッファー(4°C)で満たされたバイアルに入れます。氷上で手順 3.2 ~ 3.3 を実行します。 注:ウェットティッシュ重量は、次の手順で酸素消費量とROS生産フローを正規化するために使用されます。組織をすぐに計量できない場合は、冷たいTBバッファーで保存してください。この手順は新鮮な組織で行われ、ミトコンドリアの損傷を避けるために凍結してはなりません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>組織の準備のために、坐骨神経をそれを覆うのに十分なTPバッファーでペトリ皿に入れます。神経の一端を鉗子で持ち、もう一対の鉗子で神経束を水平に引き抜きます。 メモ:この手順は、組織の劣化を避けるために10分以内に行う必要があります。組織は、以前の白い不透明な組織とは反対側の透明な霧の層として視覚化できると、準備が整います(図1)。</li>
	<li>まず、組織透過処理のために1mLのTPバッファーを含む小さな皿にスプレイ組織を移します。透過処理を開始するには、1 mLのTP Bufferと10 μLのサポニンを含むディッシュに鉗子で組織を移します(原液から、ステップ1.3)。<ol>
<li>マイクロプレートシェーカーで30分間静かに振とうした後、鉗子で組織をMRバッファー(1mL)を含む新鮮な皿に移し、10分間静かに振盪する。鉗子で組織を較正されたHRRチャンバーに移す。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 酸素消費量とROS生産量測定
<ol><li>HRRチャンバーを2.1 mLのMRバッファーで満たし、Amplex Red(ステップ1.4)を終濃度5 μM、ペルオキシダーゼを2 U/mLに加え、透過処理した坐骨神経を追加します(ステップ3)。<ol>
<li>機器の蛍光センサーを接続し、ソフトウェアのコントロールセクションのライトをオフにして、 オキシグラフへの接続を押します。ソフトウェアの「編集プロトコル」に、ステップ3.1.3で測定した組織重量を挿入します。</li>
	</ol></li>
	<li>「レイアウト」に移動し、「単位サンプルあたりの特定のフラックス」オプションを選択し、プロットを選択して酸素消費量の読み出しと、必要に応じてH2O2生産に同時にアクセスします。約10分待ちます。 注:この時間は、基質(基礎)を追加せずに酸素消費の基礎流れを安定させるために必要です。さらに注入する前に、酸素の流れが安定していることを確認してください。</li>
	<li>H2O2の2つのパルスを、それぞれ1つずつ最終濃度260μMに注入し、チャンバ内で後で較正する。</li>
	<li>ミトコンドリア複合体II基質であるコハク酸塩20μL( 材料表参照)を注入し、ミトコンドリア電子伝達系を活性化する。 注:この時点で異なるミトコンドリア基質を添加して、異なる複合体によるミトコンドリア機能を評価することができる。ミトコンドリア複合体IおよびIIの基質を変化させた代表的な結果を、図2および図3に示す。この時点で、O2消費量とH2O2生成の増加が、同時に、図3に観察される。</li>
	<li>20 μLのアデノシン二リン酸(ADP)を加えて、アデノシン三リン酸(ATP)合成を活性化する。 注:ADPはATP合成を刺激し、膜電位を低下させます。O2消費量の増加およびH2O2の生成の減少が観察されると予想されている26,27。</li>
	<li>順番に、膜完全性の指標として5μLのシトクロムc( 材料表を参照)を加える。 注:組織がよく調製され、透過処理されている場合、シトクロムcは酸素消費量を15%以上増加させてはならない。この問題が発生した場合は、トラブルシューティングのセクションを参照して推奨事項を確認してください。</li>
	<li>O2消費量のさらなる減少が観察されなくなるまで、0.2μg/mLのオリゴマイシンのアリコート(材料表を参照)で滴定する。 注:オリゴマイシンは、ATP合成を阻害することによって作用し、O2の流れの減少および高い膜電位26,27によって好まれるH2O2形成の増強をもたらす。</li>
	<li>0.5 μmol/Lのシアン化カルボニル4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)( 材料表を参照)のアリコートで滴定し、ミトコンドリアアンカプラを、O2 消費量のさらなる増加を観察できないまで滴定する。実験を終了するには、2 μlのアンチマイシンAを終濃度5 μMに注入し、流れ安定化を待ちます。 注:FCCP注入後の膜電位散逸により、H2O2産生の減少が観察される。アンチマイシンAは複合体IIIを阻害し、それによって電子の流れを防止する。したがって、ミトコンドリア依存性O2消費が損なわれ、質量当たりの酸素流束を減少させ、電子漏れを刺激し、H2O2産生を増加させる26、27。</li>
	<li>コマンドバーに移動し、ソフトウェアで「多感覚」を検索し、 コントロールをクリックしてファイルを保存し、切断>します。 注:他の基質および阻害剤の添加は、研究中の質問に従って行うことができる。代表的な結果に例を記載する。H2O2較正は、実験を終えた後に、製造業者のプロトコル28に従って行われる。</li>
	<li>保存したファイルを開き、「質量あたりの酸素フラックス」トレースを選択して、実験的な酸素消費結果を取得します。 Shift + マウスの左ボタンを押して、注射間のウィンドウを手動で選択します。<ol>
<li>マークス>統計に移動して、基質/阻害剤/非結合プロトコルの各注入の結果を視覚化します。H2O2製造の場合、「アンプスロープ」トレースで同じ手順を実行します。 メモ: ウィンドウを選択するときは、酸素(またはH2O2)がより安定して一定であるウィンドウを選択することで、ボリュームインジェクションのアーチファクトを回避してください。選択されたウィンドウの例は、代表的な結果(図2および図3)の黒い中括弧で表されます。</li>
	</ol></li>
</ol>

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著者らには開示するものは何もありません。

神経障害に伴ういくつかの疾患または状態は、危険因子としてミトコンドリア機能障害を有する。末梢神経のミトコンドリア機能の評価は、これらの神経変性状態でミトコンドリアがどのように作用するかを解明するために不可欠です。ミトコンドリア機能の評価は、単離方法の難しさおよび材料の不足のために面倒である。従って、ミトコンドリアの単離を必要としない組織透過技術の開発が不可欠である。
透過組織におけるミトコンドリア機能を評価するには、細胞呼吸を妨げることなく細胞原形質膜を透過できる化学物質を選択することが重要です。坐骨神経などの末梢神経において、ミエリン組成は約70%が脂質であり、そのほとんどはコレステロール33,34である。コレステロール分子と相互作用するサポニンおよびジジトニンなどの透過剤の選択は、他の細胞区画に干渉することなくミトコンドリア機構への基質アクセスを可能にする細孔をもたらす35、<sup clas...

ミトコンドリアは、細胞の生存率を維持するために不可欠であり、エネルギー代謝(グルコース、アミノ酸、脂質、ヌクレオチド代謝経路)などの多数の細胞機能を実行します。活性酸素種(ROS)産生の主要な部位として、ミトコンドリアはアポトーシスなどのいくつかの細胞シグナル伝達プロセスの中心であり、鉄硫黄(Fe-S)クラスターの合成、ミトコンドリアタンパク質の輸入と成熟、およびそれらのゲノムとリボソームの維持に関与しています1,2,3。ミトコンドリア膜ダイナミクスネットワークは、融合および核分裂プロセスによって制御され、彼らはまた、品質管理およびマイトファジー4,5,6のための機械を有する。
ミトコンドリア機能障害は、癌、糖尿病、および肥満などのいくつかの病理学的状態の出現と関連している7。ミトコンドリア機能の障害は、アルツハイマー病8,9、パーキンソン病10,11、筋萎縮性側索硬化症12,13、およびハンチントン病14,15のように、中枢神経系に影響を及ぼす神経変性障害において検出される。.末梢神経系において、軸索におけるミトコンドリア機能の喪失は、ギラン・バレー症候群16、17などの免疫神経障害において観察され、軸索における高いミトコンドリアROS産生と関連して、これらの事象はシュワン細胞18におけるMAPキナーゼ活性化をもたらす。これは、ミトコンドリア生理学が部位特異的細胞だけでなく、組織全体にとって不可欠である可能性があることを示しています。HIV関連遠位感覚多発ニューロパチー(HIV-DSP)において、ミトコンドリアは、転写のトランスアクチベーター(HIV-TAT)タンパク質がHIVを効率的に複製することを可能にするメカニズムにおける役割、ならびにHIV感染の病因における他のいくつかの役割を有する19,20。
坐骨神経ミトコンドリア生理学の評価は、神経障害を調査するための必須の標的として浮上している7、21、22。糖尿病性神経障害において、プロテオミクスおよびメタボローム解析は、糖尿病におけるほとんどの分子変化が坐骨神経ミトコンドリア酸化的リン酸化的リン酸化および脂質代謝に影響を及ぼすことを示唆している7。これらの変化はまた、肥満誘発性糖尿病の初期の徴候であるように思われる21。化学療法誘発性疼痛性神経障害のマウスモデルにおいて、坐骨神経におけるミトコンドリア障害は、酸化的リン酸化22の減少、およびミトコンドリア複合体活性、膜電位、およびATP含量の減少として検出される23。しかし、いくつかのグループが神経障害におけるミトコンドリア機能障害を挙げているが、これらの研究は、ミトコンドリア膜の保存のないミトコンドリア複合体における活性の測定に限定されており、ミトコンドリア完全性の評価またはミトコンドリアATP産生のパラメータとしてのATP含量の測定を欠いている。一般に、ミトコンドリアの酸素消費量とROS産生を適切に評価するには、パーコール/スクロース勾配での微分遠心分離によるミトコンドリアの単離が必要です。ミトコンドリアの単離はまた、大量の組織が必要であり、ミトコンドリアの喪失および破壊のために、坐骨神経組織の制限因子となり得る。
本研究は、ミトコンドリアの酸素消費と坐骨神経におけるROS産生としてミトコンドリア生理学を測定し、ミトコンドリア膜を保存し、ミトコンドリアを単離する必要なしに測定するプロトコルを提供することを目的とする。このプロトコルは、高分解能呼吸法(HRR)による透過処理筋線維24 における酸素消費測定値から適合される。この手順の利点は、坐骨神経などの少量の組織におけるミトコンドリアを評価し、その 場でミトコンドリアパラメータを評価し、それによってミトコンドリア環境、構造、および生体エネルギープロファイルを保存し、生理学的に信頼できる結果を得る可能性である。ミトコンドリアの呼吸状態は、ミトコンドリアの生体エネルギー学およびミトコンドリア膜完全性のためのシトクロムc係数を適切に評価するために、坐骨神経透過後の基質および阻害剤を用いて決定され、ミトコンドリア電子輸送系(ETS)の評価および必須パラメータの計算のステップのガイドを提供する。この研究は、末梢神経障害など、坐骨神経代謝が関与する病態生理学的メカニズムの質問に答えるためのツールを提供することができる。

<table><tbody><tr><td>アデノシン 5' 三リン酸二ナトリウム塩水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン 5&prime;-二リン酸ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red 試薬</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A12222</td><td>Amplex Red は、製品データシート</td></tr><tr><td>Antimycin A (Streptomyces sp.)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>熱ショック画分、プロテアーゼフリー、脂肪酸フリー、基本的にグロブリンフリー、pH 7、&ge;98%</td></tr><tr><td>炭酸カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6763</td><td></td></tr><tr><td>シアン化カルボニル 4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>シトクロム c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td>(馬の心臓から、小さなヘムタンパク質)</td></tr><tr><td>DataLab version 5.1.1.91</td><td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td><td></td><td>Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger</td></tr><tr><td>デジタル軌道マイクロプレートシェーカー 120V</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>88882005</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>EGTA ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8145</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトンシリンジ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HAM80075</td><td>10 uL、25 uL および 50 uL</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Σ-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>水素過酸化物溶液 30% W/W</td><td>メルク</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>L-(マイナス)●リンゴ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7397</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>MES ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3885</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖鉗子、湾曲</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖鉗子、ストレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4017</td><td></td></tr><tr><td>O2K - フィルターセット アンプレックスレッド</td><td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td><td>44321-01</td><td>Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria.ミトコンドル生理ネットワーク 17.17.</td></tr><tr><td>O2K - 蛍光LED2 - モジュールコンポーネント Fluorscence-Sensor Green</td><td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td><td>44210-01</td><td></td></tr><tr><td>オリゴマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td>(Streptomyces diastatochromogenes; オリゴマイシンA、B、Cの混合物</td></tr><tr><td>OROBOROS Oxygraph-2k</td><td>OROBOROS INSTRUMENTS, オーストリア</td><td>http://www.oroboros.at</td><td></td></tr><tr><td>パルミトイルカルニチン (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)</td>シ<td>グマ・アルドリッチ</td><td>P4509</td><td></td></tr><tr><td>西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P8375</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ、ポリスチレン</td><td>MERCK</td><td>P5606</td><td></td></tr><tr><td>ホスホクレアチン二ナトリウム塩水和物</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム 一塩基性</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>PHR1330</td><td></td></tr><tr><td>水酸化</td><td>カリウムシグマ・アルドリッチ</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>ロテノン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>サポニン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>SAE0073</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>コハク酸ナトリウム 二塩基性六水和物</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>タウリン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>T0625</td><td></td></tr></tbody></table>

高解像度呼吸法による坐骨神経のミトコンドリア機能の評価

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

末梢神経のミトコンドリア機能障害は、末梢神経障害に関連するいくつかの疾患を伴い、自己免疫疾患、糖尿病、感染症、遺伝性疾患、および腫瘍を含む複数の原因によって引き起こされる可能性がある。マウス末梢神経におけるミトコンドリア機能の評価は、サンプルサイズが小さいこと、組織内に存在するミトコンドリアの数が限られていること、およびミエリン鞘が存在するため、困難な場合があります。この研究で説明した技術は、ミトコンドリアを組織から単離する代わりに、筋線維に使用されるものから適応した独自の透過処理プロトコルを使用して、坐骨神経ミトコンドリア機能を評価することによって、これらの課題を最小限に抑えます。Amplex Red/Peroxidaseで蛍光反応種産生を測定し、サポニン透過神経における異なるミトコンドリア基質および阻害剤を比較することにより、ミトコンドリア呼吸状態、活性酸素種(ROS)、およびミトコンドリア複合体の活性を同時に検出することができました。したがって、ここで提示する方法は、他の技術によるミトコンドリア機能の評価と比較して利点を提供する。

透過処理された坐骨神経によるミトコンドリア酸素消費量を図2に表す。赤色のトレースは、単位質量あたりのO2フラックスをpmol/s.mgで表します。内因性基質(日常的な呼吸)で基礎酸素消費を記録した後、コハク酸塩(SUCC)を注入して複合体II(コハク酸デヒドロゲナーゼ)駆動呼吸を記録し、酸素消費率の増加をもたらす。順番に、飽和濃度のADPが添加され、ATP合成酵素を活性化し、酸化的リン酸化を駆動する。これは、ミトコンドリア呼吸のリン酸化状態をもたらす。リン酸化状態呼吸とは、ATP合成酵素がATP26を生成するためのプロトン原動力としてプロトン勾配によって形成される膜電位を用いて、ADP+Pi(無機リン酸)からATPを生成できることを意味する。ATP合成酵素活性によって促進される膜電位の低下に伴い、酸素消費が促進され、酸素流の増加が観察される。外因性シトクロムc(CYTC)の添加は、呼吸の最小限の刺激のみを促進し、この調製物のミトコンドリア外膜完全性を認定した。組織の透過化は、膜の完全性およびシトクロムcの喪失...

蛍光センサーと組み合わせた高解像度の呼吸法は、ミトコンドリアの酸素消費量と活性酸素種(ROS)の生成を決定します。本プロトコールは、透過処理された坐骨神経におけるミトコンドリア呼吸数およびROS産生を評価する技術を記載する。

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

このプロトコルは、限られた数のミトコンドリアを含む小さな組織における困難な手順である単離されたミトコンドリアのパーセレーションによる神経内部のミトコンドリア機能の評価を可能にする。この技術は、保存されたミトコンドリアのin situにおいて、酸素消費やROS産生などのミトコンドリア機能を同時に解析する可能性を提供する。複数の基質、インヒビター、およびアンカプラ設計プロトコルを使用。いくつかの疾患は、ミトコンドリア機能、特に2型糖尿病または化学療法によって誘発される神経障害を共有する。これらの疾患では、ミトコンドリア酸化的リン酸化の障害が疾患の発症を決定する唯一の徴候である。この方法は、ミトコンドリア疾患メカニズムの調査、ミトコンドリアブースターまたは改善された神経因性疼痛などの治療法の探索により、神経生物学、生化学、および薬理学への洞察を提供する。まず、2.1ミリリットルのMRバッファーを各チャンバーにピペッティングして酸素センサーを校正します。ストッパーで閉じ、気泡が形成されるまでチャンバーに空気を吸い込みます。質量あたりの酸素流束が安定するまで、校正モードで37°Cで1時間攪拌します。HRRソフトウェアを使用して、製造元の指示に従って、ポラログラフィック酸素センサーの空気校正を実行します。組織調製のために、坐骨神経をそれを覆うのに十分なTP緩衝液を含むペトリ皿に入れる。鉗子で神経の一方の端を保持し、別のペアの鉗子で神経束を水平に引き抜きます。まず、表示された組織を、組織透過処理用の1ミリリットルのTPバッファーを含む小さな皿に移します。透過処理を開始するには、鉗子で組織を、1ミリリットルあたり50マイクログラムのサポニンを含む1ミリリットルのTPバッファーを含む別のディッシュに移します。プレートをマイクロプレートシェーカーに入れ、30分間穏やかにかき混ぜる。次いで、鉗子で組織を1ミリリットルのMR緩衝液を含む新鮮な皿に移し、10分間穏やかに撹拌させる。鉗子で組織を較正されたHRRチャンバーに移す。HRRチャンバを2.1ミリリットルのMRバッファーで満たします。Amplex Redおよびペルオキシダーゼを、それぞれ5マイクロモル、および1ミリリットルあたり2単位の最終濃度に加える。次に、透過性坐骨神経を追加します。機器の蛍光センサーを取り付けます。次に、ソフトウェアのコントロールセクションのライトをオフにし、ソフトウェアのオキシグラフに接続「プロトコルの編集に進む」をクリックし、組織重量を挿入します。レイアウトに移動し、単位サンプルあたりの特定のフラックスを選択します"オプション。次に、酸素消費量の読み出し、および必要に応じて過酸化水素の生産に同時にアクセスするプロットを選択します。約 10 分間待ちます。チャンバーの校正のために、過酸化水素の2つのパルスを、それぞれが260マイクロモルの最終濃度に注入する。ミトコンドリア複合体II基質であるコハク酸塩20マイクロリットルを注入し、ミトコンドリア電子伝達系を活性化する。ATP合成を活性化するために20マイクロリットルのADPを加える。順番に、膜完全性の指標として5マイクロリットルのシトクロムcを加える。酸素消費量のさらなる減少が観察されなくなるまで、オリゴマイシン1ミリリットルあたり0.2マイクログラムのアリコートで滴定する。酸素消費量のさらなる増加が観察されなくなるまで、ミトコンドリアアンカプラーであるFCCP当たり0.5マイクロモルのアリコートで滴定する。実験を終了するには、2マイクロリットルの抗マイシンAを注入し、5ミリモルの最終濃度を行い、流れが安定するのを待つ。コマンド バーに移動します。ソフトウェアで多感覚"を検索します。コントロールをクリックしてから、ファイルを保存を押して切断します。保存したファイルを開き、質量トレイあたりの酸素フラックスを選択して、実験酸素消費量の結果を取得します。注射とインジェクションの間のウィンドウを手動で選択するには、Shift キーとマウスの左ボタンを押します。マークに移動し、統計を選択して、基質、阻害剤、およびアンカプラプロトコルの各注入の結果を視覚化します。過酸化水素製造の場合、アンプスロープトレースで同様の手順を実行します。ATPシターゼ活性によって促進される膜電位の低下は、酸素消費を加速した。外因性シトクロムCの添加は、呼吸の最小限の刺激のみを促進し、この調製物のミトコンドリア外膜完全性を証明した。絶対酸素流が記録され、呼吸において6.3%の増加のみが観察され、組織調製物の良好な品質を示した。酸素消費量とROS生成を、電子輸送系に燃料を供給する異なる基質の存在下で同時に測定した。ミトコンドリア複合体に対するピルビン酸とリンゴ酸の添加は呼吸を増加させた。そして複合体IIに対するコハク酸塩のさらなる添加はまた、酸素消費を増加させる。したがって、他の基板を試験することができた。ROSの生成も増加し、電子輸送系からの酸素の漏れを示している。飽和濃度にアデノシン二リン酸を添加すると、酸素消費量が増加し、ATP形成が促進され、ROS産生が減少した。対照的に、オリゴ滴定は酸素消費量を減少させ、ROS産生を増加させた。これは、透過した坐骨神経がミトコンドリア生理学における標準的な関係を再現できることを示唆した。FCCPおよびレチノンの添加は、予想される酸素流束変化と整合し、ミトコンドリア生理学および生体エネルギープロファイルが透過した坐骨神経において保存されたことを確認する。最も重要なステップは、組織切片を穏やかに調製し、すべてのチャンバー開口部が適切に洗浄されていることを確認することです。ミトコンドリア機能の変化は、機能不全またはミトコンドリア数の低下に起因する可能性がある。従って引用された合成酵素活性およびミトコンドリアDNA含量確認はPCRによる推奨される。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

広筋のヘイケボタルの生検、精製されたミトコンドリアの準備、および呼吸計測プロファイリングのための方法が記載されている。小さな筋肉量の使用は、臨床研究用途のためにこの技術に適しています。...

経皮針生検によって得られた骨格筋組織から単離されたミトコンドリアの調製と呼吸計測評価

提示された方法は、マウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用したマイクロプレートベースの呼吸測定アッセイのコレクションの性能について、段階的な指示を提供します。これらのアッセイは、一般的に使用される動物モデルにおけるミトコンドリア酸素消費量の機構的変化/適応を測定することができます。...

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

高解像度の呼吸計測は、ミトコンドリアの酸素消費量を決定するために使用されます。これは、ミトコンドリア呼吸鎖複合体」（I-IV）呼吸数、最大のミトコンドリアの電子伝達系の能力、およびミトコンドリア外膜の完全性を決定するための簡単な技術です。...

透過処理と無傷の細胞でミトコンドリア機能を評価するために高解像度呼吸計測

高分解能呼吸計を用いた酸化的リン酸化の評価は、ミトコンドリアおよび細胞エネルギー代謝の機能解析の不可欠な部分となっている。ここでは、チャンバーおよびマイクロプレートベースの高分解能呼吸計を使用して細胞エネルギー代謝を分析するためのプロトコルを提示し、各デバイスの主な利点について説明します。...

チャンバーおよびプレートベースの呼吸計を使用して細胞および組織の生体エネルギーを評価するための高解像度呼吸法

ここでは、マウス骨格筋からのミトコンドリア単離の詳細な方法と、その後のマイクロプレートベースの呼吸数アッセイを用いた酸素消費速度(OCR)による呼吸の分析について説明する。このパイプラインは、ミトコンドリア代謝に対する複数の環境的または遺伝的介入の影響を研究するために適用することができる。...

呼吸法アッセイのためのマウス骨格筋からのミトコンドリアの単離

馬は並外れた有酸素運動能力を持っているため、馬の骨格筋は、馬の運動生理学と哺乳類のミトコンドリア生理学の両方の研究にとって重要な組織となっています。この記事では、馬の骨格筋におけるミトコンドリア機能の包括的な評価のための技術について説明します。...

ウマ骨格筋の高分解能蛍光呼吸測定

精子のミトコンドリア機能を高分解能肺活法で解析することで、密閉室系で自由に動く精子の酸素消費量を測定することができます。この技術は、精子のミトコンドリアの特徴と完全性に関する情報を提供するヒト精子の呼吸の測定に適用できます。...

ヒト精子のミトコンドリア機能を評価するための高分解能肺活法

ここでは、ヒトまたはマウスの筋肉から採取した新鮮な透過性骨格筋線維におけるミトコンドリアの酸化的リン酸化を測定するための包括的な方法について説明します。この方法により、ミトコンドリア呼吸のリアルタイム定量化と、既存のミトコンドリアネットワークと膜の完全性を維持しながら、燃料の好みと代謝の柔軟性の評価が可能になります。...

高解像度呼吸測定法によるヒトおよびマウス骨格筋線維のミトコンドリア呼吸の測定

免疫細胞の生理学的に関連する基質濃度の下でミトコンドリアの生体エネルギーを研究する方法は限られています。私たちは、高分解能蛍光肺活量測定法を使用して、ヒトT細胞、単球、および末梢単核細胞のエネルギー需要に対するミトコンドリア膜電位の応答の変化を評価する詳細なプロトコルを提供します。...

ヒト免疫細胞におけるミトコンドリア膜電位の動的変化を評価するための高分解能蛍光スパイロメトリー

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マウスの筋肉および末端シュワン細胞におけるミトコンドリア形態の 現場 定量方法

学ぶ高解像度呼吸法による坐骨神経ミトコンドリア機能評価。酸素消費と活性酸素種を同時測定し、糖尿病や化学療法誘発神経症の病態解明と治療法開発に貢献する神経科学的手法です。

高解像度呼吸法による坐骨神経のミトコンドリア機能の評価

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