腸内細菌叢の調節による大腸炎に対する セレウス菌 投与の緩和効果の調査

このプロトコルにより、健康に対するプロバイオティクス補給の双方向調節効果と、安定した再現性のある結果を評価することができます。無菌マウスをプロバイオティクスの受容体として使用する際の実験室の制限を回避するために、擬似無菌マウスを使用して代替の DSS 誘発性大腸炎モデルが確立されました。この技術におけるプロバイオティクスの有益な効果を探るには、慢性炎症関連疾患の症状を軽減するための新しい治療戦略を開発するための有望なアプローチです。

まず、アンピシリン、硫酸ネオマイシン、メトロニダゾール、バンコマイシンを飲料水に溶かして抗生物質のカクテルを調製します。完全に溶解した後、溶液を摂氏4度で保存します。抗生物質カクテル溶液を水筒に入れます。

抗生物質溶液を光から保護するために、必ず茶色のボトルを使用するか、ボトルをアルミホイルで包んでください。ボトルをマウスケージの上に置きます。2.5%デキストラン硫酸ナトリウム溶液を作るには、2.5グラムのDSSを100ミリリットルの蒸留水に溶解します。

大腸炎モデルマウス群の飲料水を2.5%DSS溶液に置き換えます。大腸炎の緩和に対するセレウス菌のプラスの効果を評価するために、マウスを対照群、DSS誘発性大腸炎モデル、およびDSS誘発マウスのプロバイオティクスセレウスBサプリメントの3つのグループにランダムに割り当てます。DSS誘発性大腸炎に対するBセレウスのプロバイオティクス効果の調節における腸内細菌叢の役割を調査するために、マウスをABX/コントロール、ABX/DSS、およびABX/BセレウスとDSSの3つのグループにランダムに割り当てます。

抗生物質カクテル投与後のベースライン体重としてマウスの体重を記録します。直ちに雄のC 57 BL 6匹のマウスを飲料水中の2.5%DSS溶液で7日間処理します。900マイクロリットルの滅菌生理食塩水で満たされた8本の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管を準備します。

100マイクロリットルの対数成長Bセレウスをピペットで入れ、900マイクロリットルの滅菌生理食塩水に溶解します。チューブを使用して蠟状Bを連続的に希釈します。各希釈液40マイクロリットルを、希釈比で標識されたそれぞれのLB寒天プレートにプレートします。

希釈率ごとに3回繰り返します。プレートを摂氏37度の恒温インキュベーターで16時間培養します。カウントのために約20〜70コロニーのプレートを選択します。

Bセレウスの定量後、10倍を含む1ミリリットルのBセレウス培地を9番目のCFUに回収し、8, 000 Gで10分間遠心分離します。次に、細菌細胞を8, 000 Gで10分間遠心分解して滅菌水で2回洗浄し、上清を除去します。濃縮された蠟状芽孢菌を滅菌生理食塩水で希釈し、200マイクロリットルあたり10倍から8番目のCFUの最終濃度に希釈します。

希釈液を上下に繰り返しピペットで移動させ、分散したセレウスB懸濁液を取得します。強制経口針の外側を70%エタノールで拭き、適切な用量の適用を維持します。ネズミを拘束するには、尻尾をつかみ、尾の端をハンドラーの最後の2本の指で固定して、背中の緩んだ皮膚をしっかりとつかみます。

マウスを垂直位置に保ちます。次に、強制経口針を口から食道に慎重かつ優しく挿入します。蠟状芽B液を投与し、針をそっと引き抜き、マウスをケージに戻します。

マウスの体重を毎日測定し、滅菌された遠心分離管ですぐに糞便サンプルを収集します。便潜血検査紙で便潜血を測定します。アプリケータースティックに10ミリグラムの便サンプルを収集します。

検体をテストカードに置き、カードに薄い塗抹標本を塗ります。バックフラップを開き、塗抹標本の上に現像液を塗布します。マウスを手術台に仰臥位に固定し、腹腔を開きます。

結腸全体を外科的に分離し、定規で長さを測定します。次に、予冷したPBSで満たされた5ミリリットルの注射器で結腸を優しく洗浄します。結腸部分のワックスを除去し、水分を補給します。

次に、結腸切片をヘマトキシリンとエオシンで染色します。2人の独立した実験者に光学顕微鏡下でサンプルの組織学的スコアを評価させ、ヘマトキシリンとエオシン染色により、大腸炎モデルマウスの結腸組織が陰窩の喪失、杯細胞の損傷、炎症細胞浸潤、および上皮の喪失を示すことが明らかになりました。Bセレウス治療はDSS誘発性組織病理学的損傷を改善した。

大腸炎マウスの組織病理学的スコアは、対照群よりも有意に高かった。しかし、Bセレウス群の組織病理学的スコアは、大腸炎マウスよりも有意に低かった。マウスをランダムに3つのグループに分け、ABX/対照群のマウスと比較して、ABX/DSS群の方が体重減少、DAIスコア、および組織病理学スコアが高く、結腸の長さが短かった。

体重減少、結腸長、DAI スコア、および組織病理学スコアは、ABX/DSS 群と ABX/B cereus と DSS 群の間で統計的に差はありませんでした。現在の結果は、腸内細菌叢が大腸炎に対する B cereus のプラスの効果に重要な役割を果たしていることを間接的に示唆しています。最も重要なステップの 1 つは、強制経口法によるセレウス菌を使用して、マウスの大腸炎モデリングを構築することです。

セレウス菌の治療により、DSS 誘発性大腸炎が解消され、大腸炎の治療のためのプロバイオティクスの追跡研究の基礎が築かれました。