ショウジョウバエの幼虫の匂い駆動型の動作の高分解能測定

こんにちは、私の名前はマット・ルイです。私はロックフェラー大学のレスリー・サル研究室の博士研究員です。そして今日は、幼虫の走化性を研究するために私たちが行ってきた実験についてお話ししたいと思います。

私たちが興味を持っている問題は、それはかなり単純です。これは、実際にはこの設定でここに表示されます。私はちょうどこのアグロの表面にジョセフ幼虫のグループを移しました。

この環境はかなり敵対的で、彼らは飢え死に近づいています。どういうわけか、これらの動物は最も近い食料源への道を見つける必要があり、ここに幼虫を引き付けるバナナの匂いがします。この環境は走化性挙動を研究するのに理想的ではないため、最初の改善はバナナを化学物質に置き換えることです。

この化学物質は酢酸イソであり、バナナで優勢なフレーバーの1つです。これが私たちの人工的なフレーバーであり、これを使用することで、嗅覚刺激をよりよく制御することができます。次の改善点は、閉じた環境を使用し、他の分布の変動をそのような方法で防ぐことです。

これが、私たちが研究室でかなり長い間使用してきたアッセイです。底にアガロの表面が入ったペトリ皿です。アガロは、幼虫から化学療法への攻撃に理想的です。なぜなら、それは彼らに潤いを与えるからです。

プレートの両側には、テフロンで作られた他のキャップがあり、これから行うことは、一方の側に酢酸を導入またはイザムし、もう一方の側に順序を出すことです。これが完了したら、ペトロ皿を閉じ、テオドールが拡散するのを少し待ってから、皿を開けるという考え方です。ここに動物を登場させ、一定時間動物を動かします。

このアッセイは、皿の片側にテオドールを導入することにより、かなり迅速に確立され、試験期間中安定したままの勾配が得られるという仮定に依存しています。さて、主な問題は、プレートに勾配が存在することを誰も実証していないことです。テオドールを添加した後、非常に迅速に、プレート内のテオドールが均一に分布しているため、勾配が非常に浅くなるか、勾配が確立されるまでに数分かかる可能性があります。

もちろん、これは主に使用されているテオドールの蒸気圧に依存します。2つ目の問題は、実験中に何が定量化されるかに関連しています。動物がここから始まり、Xと3分後にこのエンドプレート、赤いXが見つかったと想像してください。

あなたができることの1つは、動物の最終的な位置を一定期間、3分または5分後にのみ記録することです。そうすると、取得する唯一の情報は開始位置であり、時間の経過に伴う動物の行動について適切な解像度を持つことが重要であると考えています。例えば、動物は、このように開始位置から終了位置までほとんど移動しなかったかもしれませんし、テオドールの周辺地域にかなりの時間訪れて、試験が終了する前に戻したかもしれません。

これら2つの状況から導き出される結論は大きく異なります。あるケースでは、動物は刺激に反応しなかったかもしれませんが、他のケースでは確かに反応しました。私たちが達成しようとしている2つの改善点は、まず、アリーナ内の他のグラデーションの形状と安定性を制御することです。

次に、動物の行動をリアルタイムで追跡し、このすべての情報を保持します。次のシーケンスでは、Sylviaが注文の希釈をどのように準備するかを紹介します。私の名前はS tiです。

私はVAs研究室で研究助手として、材料luiに取り組んでいます。今日は、動物を追跡するために使用するチャンバーシステムの材料を準備する方法をご紹介します。私たちのチャンバーシステムの主な問題は、空気中に分散した臭気を使用していることです。

つまり、例えば、私たちが使用しているアグロスプレートが平らでない場合、実験の合間に変動や集中が生じ、システムにノイズが混入する可能性があります。そこで、システムのノイズを減らすための小さなヒントを紹介します。したがって、臭気希釈を準備するための材料はガラス瓶であり、興味のある臭気のアリコートで光反応性臭気を使用している場合は、できれば暗くしたガラスです。

この分注を準備するためのガラスピペットと適切な機械式ピペット補助具。次に、パラフィンオイルピペットチップ、標準的なピペットマン、希釈用の小さなバイアル。繰り返しになりますが、これらはガラス製で、できれば暗くしてから、正確な測定を行い、実験間のノイズを減らすために計量スケールを使用する必要があります。

臭気は非常に揮発性が高く、中には有毒なものもあるため、フード内で行われます。臭気の希釈を修復するための最初のステップは、希釈する臭いを分注することです。正確な希釈液を調製し、実験間のばらつきを最小限に抑えるには、すべての秤量が必要です。

だから、ラベリングから始めて、酪酸エチルの1モル濃度を作るつもりです。まず、パラフィンオイルを準備します。パラフィンオイルは非常に粘性が高いため、ピペットの先端をできるだけパラフィンオイルに浸さないようにすることが重要です。これは、泡を発生させずにパラフィンオイルを吸い上げるのに十分な

その後、ボトルの側面にある余分なパレンオイルを拭き取ると良いでしょう。繰り返しになりますが、パレンオイルは粘性があるため、バイアルにゆっくりと出すことが非常に重要です。パラオイルをボトルにピペットで入れたら、チップの底にさらに溜まるため、すぐにチップを捨てないでください。

それはあなたがすでにあなたが追加しようとしているパレン油の体積と重量を測定している場所で希釈を開始する前に、計算のシートを準備することをお勧めします、そしてその後、重量であなたの臭いについても同じことをします。そうすれば、あなたが持っているスケール、必要なすべてのパラフィンオイル、そしてすべての臭いも確認できます。必要に応じて、より多くのパレンオイルを注ぎ、適切な重量になるまで再測定します。

正しいパレンオイルの重量が得られたら、同じ原理を使用して臭気物質を追加するだけです。大丈夫です。ここでは、追跡のために幼虫を準備する方法を示します。

通常、生後6日齢の幼虫を使用します。これは、彼らが私たちのソフトウェアによって簡単に拾われるのに十分な大きさであり、また、幼虫が追跡に使用するには古すぎるかどうかを判断するためにまだ非常に活発であるため、壁を登る幼虫がいるかどうかを確認する必要があります。壁を登る幼虫がいる場合、それらは年を取りすぎており、特に活動的ではありません。

幼虫を準備する最初のステップは、幼虫を15%ショ糖に浸すことです。15%スクロースを使用する理由は、この溶液では幼虫がボイドになり、代わりに食物が部分的に溶解するか、底に落ちるためです。あなたは十分なスクロースを注ぎますので、それはあなたのボトルまたはバイアルの上部から少し少ない

次に、へらを取ります。幼虫が浮かんでいるのがすでに見え、食べ物をそっと掘り下げて食べ物を掘っている動物を取り除き、少しぐるぐる回して食べ物から動物を分離してから、数分間座ります。餌と幼虫が十分に分離したら、事前にラベル付けされたペトリ皿を取り、ブザー部分に注ぎます。

ペトリ皿の上部に水を入れ、追跡した幼虫の容器として使用すると、追跡した幼虫と追跡していない幼虫を区別できます。幼虫をペトリ皿に注いだので、幼虫がショ糖に適応して飢餓状態に達するまで30分待つ必要があります。これは、幼虫が適応している30分間、追跡設定でより適切に行動することを意味します。

ショ糖は、プレートをトラッキングする準備をする良いタイミングです。つまり、これらは96ウェルプレートの上部です。あなたはそれらを別々に購入することができます、そしてこれはすでに加熱されている3%aros溶液です。

3%を使用するのは、幼虫が掘るのを防ぐだけでなく、幼虫がその上を歩いたり、各プレートの上部で加湿されたままにしたりできるほど密度が高いためです。あなたは25ミルのアグロをピペットで動かしたいと思います。ゲル内に大きな気泡が形成されないようにすることが重要です。

また、プレートを平らな面に置くことも重要で、そうしないと斜面にあるゲルが付着し、幼虫の行動に影響を与える可能性があります。アロスが固まったら、上を積み重ねてソランラップで包み、乾燥を防ぎます。これにより、数日間追跡に適した状態に保たれるはずです。

このシーケンスでは、前に説明したガソリンディッシュアッセイとは少し異なる行動アッセイを紹介します。必要なのは、96ウェルプレートのリード線と、アグロ層を含むリード線です。アッセイは、3つの蓋が積み重なって構成されています。

最初のリップには何も含まれておらず、空であり、システムが存在する表面からシステムを隔離するためにのみ使用されます。2 番目のレイヤーには、ディエゴ アグロ サーフェスが含まれています。ここでは動物が表面に配置され、次にお見せするように、プレートにテオドールを紹介します。

テオドールをロードするたびに、新しくて新しい蓋を使用することが重要です。これは、ある実験から別の実験への汚染を防ぐためです。また、他の希釈剤も必要になります。

通常、テオドールの装填に染料は使用しませんが、ここではイラストのために使用します。これは高濃度のテオドールです。これは非常に希薄化されていますが、私の目標は線に沿ってグラデーションを作成することです。

この線を言うと、左から右への集中力が増すことを望みます。これを達成するために、凝縮リングに配置されたいくつかの順序の液滴を濃度を上げて使用します。私は最も高い濃度から始めます、そしてそれは端に置かれます。

リング内に分散させることが重要です。次に、最初の濃度と比較して2倍に希釈された次の濃度を進め、このリングに配置します。だからそこにはありません、私は6つの液滴を持っています。

最初のものには、たとえば 1 の濃度が含まれています。2番目の濃度は0.5で、最初の濃度の2倍です。3つ目は濃度で、0.25などです。

したがって、線に沿って等比級数があります。次のステップは、この蓋をAAL表面に反転させることで、表面張力によって、すべての液滴が蓋の上部から吊り下げられたままになります。赤外分光法に基づく技術を考案し、プレート内のすべての濃度を測定します。

この手法を適用することで、デオドラントラインに沿って幾何学的なシリーズがある場合、ここに示すように指数関数的に増加する長さとプレートの幅に沿ってテオドールが集中することを示すことができました。臭気ラインのすぐ下でピークに達したプロファイルがあります。グラデーションの実際のジオメトリは次のようになります。

空気中のテオドールの濃度を考えると、良いことは、その形状の勾配が少なくとも15分間安定していることを示すことができたことです。上蓋の導入後、勾配が確立されるまで30秒待ちます。その後、アリーナで動物を紹介します。

動物は位置3と4の間のもう一方の端線の下に導入され、小さなピンを使用して幼虫をショ糖溶液からアグロ表面に移します。移し替えは、爪の頭の周りに幼虫を釣り上げることによって行われます。私たちはすぐに蓋を開けます、幼虫はアガロの表面に堆積します。

次に、蓋を閉めます。蓋を開けたままにする時間を最小限に抑えることが重要です。次に、動物の動きを3〜5分間記録します。

実際の録音が行われます。このトラッキング設定では、カメラがコンピューターに接続されています。私たちが使用している画像追跡ソフトウェアは、NordisのAton visionで、動物の動きに関する情報を収集し、デジタルファイルとして保存します。

さて、いよいよ行動実験を始めましょう。アロ層付きの蓋があります。希釈液があります。

ディエゴは最初のフタに引っかかっています。テオドールをロードする前に、各バイアルをボルテックスすることが重要です。希釈は、左側に最小のもの、ここでは右側に最も高いものを使用します。

6つの液滴すべてが同時にプレートにロードされます。臭気の損失を避けるために、ここではマルチチャンネルのPipeter 6 dipを使用しており、各希釈サンプルから10マイクロリットルの臭気を採取し、同時に臭気をロードしています。ロードすると、蓋はアグロスの表面で反転します。

グラデーションは、前に示したように、過去30秒間にプレートに作成されました。では、ディエゴの地表に動物を登場させます。動物が紹介されたらすぐに録音を開始します。

動物はここにいて、その動きが追跡されています。ご覧のとおり、動物は匂い線をたどり、勾配の最高濃度ポイントに向かっています。濃度は左から右に指数関数的に増加することに注意してください。

ご覧の通り、運動の方向は常に修正されています。刺激に関しては、動物は勾配の最高濃度点に達しており、それをプレートから取り除きます。動物は別のプレートに捨てられ、同じ個体を直接2回追跡しないようにします。

新しい幼虫を導入し、新たな記録を開始した後、追跡のために従うルールは次のとおりです。動物がプレートの最高濃度の列(ここではこれに対応する)に達するとすぐに追跡を停止します。また、動物が壁にぶつかると、干渉を避けたいため、追跡が中断されます。

私たちが最初に取り組んだ質問は、かなり可能性があった。私たちが知りたかったのは、動物が一定の濃度でテオドールの匂いを嗅ぐことができるかどうかでした。このようなテストを行うために、私たちが通常行うことは、臭気の発生源を複数ではなく、単一のものにすることです。

これにより、テオドールエンド液滴の濃度を1自由度で変更することができます。例えば、ここでは高濃度の液滴があり、ここでは低濃度の液滴があります。私たちが通常行うことは、テオドール飛沫の真下にあるディエゴ表面に動物を導入し、動物がその存在を検出してその近くに滞在できるかどうかを確認することです。

これからは、私たちのアッセイをより高度に活用したいと思います。1つの順序の液滴があり、ここに重ねて課せられたいくつかの軌道を記録し、そのうちの3つがあると想像してください。この緑色のトラックを生成する個人が1人います。

このオレンジ色の軌跡は中心が小さく、このピンクの軌跡は、動物が明らかにソースの周りを円を描いていることを表しています。軌道の詳細については、始めるべき多くの情報があると考えています。そのため、軌跡を一連の憑依としてmatlabに取り込み、解析後にmatlabで解析を行います。

これは、おそらく時間の関数としてソースまでの距離です。以前に表示されていた 3 つの軌道には、ソースから非常に近い緑色の軌道があります。オレンジ色の軌道が表示され、ノイズが大幅に多く表示されます。

そして、この紫色の軌跡は、興味深いことに、動物が距離を置くために発生源を離れたことを示しており、これはおそらく最適な濃度に対応していました。ここでは、10の軌跡のイラスト、匂いを嗅ぐことができない動物を見ることができます。これらは突然変異体または3つのB変異体であり、これらは非エラーです。

そして、ご覧の通り、これらすべての軌跡は、動物が臭いの原因を検出できず、そのまま放置したことを示しています。さて、星のコントラストとして、ここではホワイトタップ動物の10回の連続した軌跡を記録しました。これらの動物はもちろん匂いを嗅ぐことができ、ご覧の通り、すべての動物は消臭源のすぐ下に蓄積します。

今提示された20の軌跡は、実際には動物の身元を知らずに取得されました。これは、私たちのアッセイの効率と信頼性を実証しています。一部のミュータントが指数関数的勾配を使用してここで匂いを嗅ぐことができるかどうかを判断する際には、いくつかのトラックを生成し、動物がもう一方の端の刺激にどれだけうまく追従できるかを把握したいと考えています。

そこで、別々に記録された15の軌道をお見せしますが、ご覧の通り、動物たちはもう一方の端線の下で刺激を追うのに素晴らしい仕事をしています。次に、簡単なコントロールで進めたいと思います。指数関数的な勾配の動物が線をたどったのは、その濃度とは無関係に何らかの刺激があったため、動物だけがまっすぐ進んだのかもしれません。

ですから、彼らが実際に濃度を計算したり、その濃度に関連する何かを計算したり、それを利用して運動を指示したりしていることを示すために、私たちは今、屋上に近いこの幾何学を持っています。ここでは通常通り幼虫が紹介されますが、私たちが期待しているのは、彼らが線に沿って移動し、このポイント以降に濃度が低下していることを検出して戻ってくることです。そこで、5匹の動物でテストを行いました。

軌跡を収集し、今度はこのスライドに重ねて表現しています。そして、ご覧のとおり、動物はここから出発し、線に沿って移動し、次に最も集中している地域を探索し、主にそこに滞在します。これは、彼らがシングルソースアッセイを使用して他の濃度をリアルタイムで計算できることを強く示唆しています。

私たちは主に1つの大きな質問をすることができました。動物の匂いは、マルチソースデバイスを使用して特定の濃度の匂いを検出できますか?私たちは、勾配の形状を変更し、動物がこの情報を利用できるかどうかを判断する際に、より柔軟性があります。

この考え方を、簡単な実験で説明したいと思います。これまでに設定したグラデーションでは、レンズに沿って指数関数的な形状になっていました。さて、問題は、レンズに沿って濃度が直線的に増加するようにすることで、アルにさらに挑戦した場合、彼らはまだもう一方のエンドラインの下に道を見つけることができるかということです。

このグラフは、2種類のグラデーションを表しています。指数関数的なものを紫色で、線形勾配を緑色でテストしました。これが線形勾配であり、パレンオイルを希釈する酢酸イサムのさまざまな濃度を書きます。

これは算術シリーズです。線形勾配が確立され、ご覧のとおり、勾配は指数関数的な勾配に比べてかなり浅く、四肢の濃度も0.5ですが、0.03まで上昇します。問題は、ナビがこのような浅い勾配に直面したときに化学療法を受けることができるかということです。

ここでは、指数関数的勾配と線形勾配の 6 つの液滴に使用されたアセテートの実際の濃度を示します。ご覧のとおり、線形勾配ではどちらの場合も最高濃度が同じですが、ここでの最低濃度はかなり高くなっています。線形勾配で実験を行い、ここでは野生型の動物の15の軌跡が表されており、これらの動物が線形勾配を検出し、デオドラントラインに沿ってこの信号をたどることができたことはかなり明らかであると考えています。

ですから、私たちの主張は明確だと思います。ここでの締めくくりに、このトラッキング設定の今後の方向性について簡単にお話ししたいと思います。この追跡設定では、幼虫の複雑な行動をより長く、より長い時間にわたって見るなど、多くの興味深いことを行うことができますが、いくつかの制限があります。

たとえば、プレートのサイズに制限があるため、追跡できる時間や見ることができる複雑な動作が制限されます。ですから、プレートが大きいか、プレートの境界にまったく制限されないシステムを開発できればいいですね。もう一つの問題は、現在私たちが持っているソフトウェアでは、同時に複数の動物を追跡することが難しいため、個体群の行動をリアルタイムで観察することができないことです。

このセットアップではテストできない行動のもう一つの興味深い側面は、宇宙での幼虫の実際の3次元の動きです。動物を追跡すると、たとえば、匂いの飛沫に到達すると、頭を持ち上げたり、濃度の変化を検出しようとして頭を振り回したりすることがわかります。おそらく、これは現在の私たちの特定のセットアップでは不可能なので、これを可能にする何かを開発するのは素晴らしいことです。