ショウジョウバエの幼虫の匂い駆動型の動作の高分解能測定

こんにちは。私はマット・ルイです。ロックフェラー大学のレスリー・サル研究室で博士研究員を務めています。本日は、私たちが幼虫の化学走性を研究するために行ってきた実験についてお話しします。

私たちが関心を持っている問題は、非常に単純なものです。実際、こちらのセットアップで示されています。アガロスの表面に、ジョセフ幼虫のグループを移したところです。

この環境はかなり過酷であり、個体は飢餓状態に近くなっています。これらの動物は、何らかの方法で最も近い餌資源へと到達する必要があります。ここでは、幼虫を誘引する臭いを発するバナナが用意されています。この環境は走化性挙動を研究するには最適ではないため、最初の改善策として、バナナを化学物質に置き換えます。

この化学物質は酢酸イソアミルであり、バナナに多く含まれる香料の一つです。これは人工香料として使用しており、これにより嗅覚刺激をより精密に制御することが可能になります。次の改善点としては、密閉環境を使用し、その他の分布における変動を防止することです。

ここでは、当研究室で長年使用しているアッセイをご紹介します。これは底面にアガー（寒天）を敷いたペトリ皿です。アガーは幼虫を保湿させることができるため、走化性試験に最適です。

プレートの両側にはテフロン製のキャップがあり、一方の側にイソアセテートを導入し、もう一方の側には何も導入しません。この操作後、ペトリ皿を閉じ、テトラフルオロエチレンが拡散するまでしばらく待ち、その後、皿を開けます。ここに動物を導入し、一定時間、動物を移動させます。

このアッセイは、ディッシュの一端にtheodorを導入することで、勾配が速やかに形成され、テスト期間中安定して維持されるという仮定に基づいています。現在の主な問題は、プレート内に勾配が存在することが誰によっても実証されていない点です。theodorの添加後、極めて短時間でプレート内にtheodorが均一に分布し、勾配が非常に緩やかになっている可能性や、勾配が形成されるまでに数分を要する可能性があります。

これは当然ながら、主に使用されるテオドールの蒸気圧に依存します。2つ目の問題は、実験中に何を定量化するかに関連しています。動物がここ、Xから出発し、3分後にこの端板、赤いXに到達したと想定してください。ここで、2つのアプローチが考えられます。

一つの方法として、3分または5分などの一定時間が経過した後の動物の最終位置のみを記録することが考えられます。しかし、その場合、得られる情報は開始位置と終了位置のみとなります。私たちは、時間の経過に伴う動物の行動について、十分な解像度を持って把握することが重要であると考えています。例えば、ここにあるように、動物が開始位置から終了位置までほとんど移動しなかった可能性もあれば、試行が終了する前に、かなりの時間を費やして特定の領域の周辺を探索し、そこに戻ってきた可能性もあるためです。

これら2つの状況から得られる結論は大きく異なります。一方の場合、動物は刺激に反応しなかった可能性がありますが、もう一方の場合は確実に反応しています。達成しようとしている2つの改善点は、まず、アリーナ内のもう一つの勾配の形状と安定性を制御することです。

次に、動物の行動をリアルタイムで追跡し、すべての情報を記録します。次のシーケンスでは、Sylviaが段階希釈の準備方法について説明します。私はS tiです。

私はVAsラボのリサーチアシスタントで、material luiの下で研究を行っています。本日は、動物の追跡に使用するチャンバーシステムの材料の準備方法について説明します。当研究室のチャンバーシステムにおける主な課題は、空気中に分散させた臭気を使用している点にあります。

これは例えば、使用するアガロースプレートが平坦でない場合、実験間に変動や濃度の差が生じ、システムにノイズが導入される可能性があることを意味します。そこで、システム内のノイズを低減させるための簡単なコツをいくつかご紹介します。 odor dilution（臭気希釈液）を調製するための材料は、ガラス瓶（光反応性のある臭気を使用する場合は、できれば遮光ガラス製のもの）と、目的の臭気の分注液です。

この分注液を調製するためのガラスピペットと、適切なメカニカルピペットエイドを用意します。次に、パラフィンオイル処理済みのピペットチップ、標準的なマイクロピペット、および希釈用の小型バイアルを用意します。なお、バイアルはガラス製で、できれば遮光タイプのものを使用してください。最後に、正確な測定を行い、実験間のばらつきを抑えるための電子天秤を用意します。

臭気物質は揮発性が高く、中には毒性を持つものもあるため、操作はドラフトチャンバー内で行います。臭気希釈液を調製するための最初のステップは、希釈する臭気物質を分注することです。正確な希釈液を調製し、実験間のばらつきを最小限に抑えるためには、すべてを計量する必要があります。

まずラベル貼りをし、1 M濃度の酪酸エチルを作成します。最初に、パラフィンオイルを準備します。パラフィンオイルは非常に粘性が高いため、気泡が発生しない程度に、ピペットチップをパラフィンオイルに浸す深さを最小限にすることが重要です。

次に、ボトルの側面に付着した余分なパラフィンオイルを拭き取ります。繰り返しになりますが、パラフィンオイルは粘性が高いため、バイアルの中にゆっくりと滴下させることが非常に重要です。ボトルにパラフィンオイルをピペッティングした後、チップの先端にさらにオイルが溜まっているため、すぐにチップを捨てないでください。

希釈を開始する前に、あらかじめ添加するパラフィンオイルの量と重量を算出した計算シートを用意し、同様に香料についても重量を含めて算出しておくことが推奨されます。そうすることで、必要なパラフィンオイルと香料がすべて揃っているかを天秤で確認できます。必要に応じて、正しい重量になるまでパラフィンオイルを追加して再測定してください。

適切な親油の重量が量り取れたら、同様の原理で香料を添加するだけです。それでは、ここから幼虫のトラッキング準備の手順を説明します。

通常、孵化後6日目の幼虫を使用します。この時期の幼虫は、ソフトウェアで容易に検知できる十分な大きさであり、かつ非常に活発であるためです。幼虫がトラッキングに使用するには高齢すぎるかどうかを判断するには、容器の壁を登っている幼虫がいるかを確認してください。壁を登る個体がいる場合は、高齢であり、十分な活動性がないということになります。

幼虫を準備する最初のステップは、15% sucroseに浸すことです。15% sucroseを使用する理由は、幼虫がこの溶液中で浮遊し、一方で餌は部分的に溶解するか、あるいは底に沈殿するためです。ボトルまたはバイアルの上端から1インチ弱（約2.5cm）ほどの間隔が開くように、十分な量のsucroseを注いでください。

次に、スパチュラを用意します。すでに幼虫が浮き上がってきているのが見えますが、餌の中に潜り込んでいる個体を追い出すために、餌をそっとかき混ぜ、少し回転させて餌から切り離し、そのまま2分ほど静置します。餌と幼虫が十分に分離したら、あらかじめラベルを貼ったペトリ皿を用意し、深い部分に注ぎ入れます。

シャーレの蓋は保管しておいてください。後でここに水を満たし、追跡済みの幼虫を入れる容器として使用することで、追跡済みの個体と未追跡の個体を区別できるようにします。幼虫をシャーレに注いだ後、ショ糖に適応し、飢餓状態に達するまで30分間待機します。これにより、適応させる30分間の後、追跡セットアップにおいて幼虫がより適切な挙動を示すようになります。

ショ糖を溶解させている間に、トラッキング用のプレートを準備するのが効率的です。これらは96ウェルプレートの蓋です。別途購入することができ、こちらはあらかじめ加熱しておいた3%アガロース溶液です。

幼虫が潜るのを防ぐため、また、幼虫がその上を歩行でき、各プレートの表面が湿潤な状態に保たれる十分な密度となるため、3%を使用します。アガロースを25 mLピペッティングしてください。ゲルの中に大きな気泡が入らないようにすることが重要です。

また、プレートを平らな面に置くことが重要です。そうしないと、ゲルが傾斜した状態で固まってしまい、幼虫の行動に影響を及ぼす可能性があります。ゲルが固まった後、上蓋を重ねてサランラップで包み、乾燥を防ぎます。これにより、数日間にわたってトラッキングに適した良好な状態で維持することができます。

このセグメントでは、先ほど説明したペトリ皿アッセイとはわずかに異なる、行動アッセイについて提示します。必要なものは、96ウェルプレートの蓋と、アガロ層を含むプレートです。アッセイは、3枚の蓋を積み重ねて構成されます。

最初の層には何も含まれておらず、システムを設置面から隔離するためだけに用いられます。2番目の層にはDiego agro表面が含まれています。ここに動物を配置し、次に示す通り、プレートにtheodorを導入します。

theodorにサンプルをロードする際は、毎回新しく清潔な蓋を使用することが重要です。これは、実験間のコンタミネーションを防ぐためです。また、別の希釈液も必要になります。

通常、テトラゾリウム塩（theodor）のロードに色素は使用しませんが、ここでは説明のために使用します。これは高濃度のテトラゾリウム塩（theodor）です。こちらは非常に希釈されており、直線状にグラジエントを作成することを目的としています。

この行についてですが、左から右に向かって濃度が高くなるようにしたいと考えます。これを実現するために、濃度の異なる複数の液滴を、濃度を上げていく順に凝縮リング内に配置します。まず、最も高濃度の液滴から、端の方に配置していきます。

それをリング内に分散させることが重要です。次に、最初よりも2倍に希釈した次の濃度の溶液を準備し、このリングに滴下します。これで、6つの液滴が配置されました。

1つ目の濃度を例えば1とします。2つ目はその半分の0.5、3つ目は0.25というように、段階的に希釈していきます。

ここでは、直線上に幾何級数的な配置を形成しています。次のステップでは、この蓋をAAL表面で反転させます。これにより表面張力が働き、すべての液滴が蓋の上部に懸垂したまま保持されます。我々は、プレート内の全濃度を測定するために、赤外分光法に基づいた手法を考案しました。

この手法を適用することにより、ここに示すように、誘引物質のラインに沿って幾何級数的な配置を設けると、その長さに沿った誘引物質の濃度が指数関数的に増加し、プレートの幅方向には誘引物質のラインの直下でピークとなるプロファイルが得られることを示すことができました。こちらが、実際のグラジエントの形状です。

空気中のテオドールの濃度を考慮すると、その勾配の形状が少なくとも15分間は安定していることを示せた点は好ましい結果です。上蓋を閉じた後、勾配が形成されるまで30秒間待ちます。その後、動物をアリーナ内に導入します。

動物を3番目と4番目の位置の間にある反対側のラインに導入します。小さなピンを使用して、幼虫をショ糖溶液からアガー表面に移動させます。幼虫をピンの頭に引っかけることで移動させます。素早く蓋を開け、幼虫をアガーの表面に配置します。

次に、蓋を閉めます。蓋が開いている時間を最小限に抑えることが重要です。続いて、動物の行動を3分間または5分間記録します。

実際の記録を行います。このトラッキングセットアップでは、コンピュータに接続されたカメラを使用します。動物の運動に関する情報を収集し、デジタルファイルとして保存するために、Nordis社のAton visionイメージトラッキングソフトウェアを使用します。

それでは、行動実験を開始します。aro層を塗布した蓋と、希釈系列を用意しました。

ディエゴは最初の蓋で苦戦しています。theodorをロードする前に、各バイアルをボルテックスすることが重要です。希釈液を使用し、最も低い濃度を左に、最も高い濃度を右に配置します。

6つの液滴すべてを同時にプレートに分注します。揮発による臭いの損失を防ぐため、ここではマルチチャンネルピペットを使用します。各希釈試料から10 µLの臭気試料を採取し、同時に分注します。分注後、アガロースの表面に蓋を伏せます。

先ほどお見せした通り、プレート上に30秒かけて勾配が作成されました。それでは、ダイエゴ表面に動物を導入します。動物を導入した直後から、記録を開始します。

動物がここに現れ、その動きが追跡されています。見ての通り、動物は臭気物質のラインに従い、勾配の最高濃度地点に向かって進んでいます。濃度は左から右に向かって指数関数的に増加していることに注意してください。

見ての通り、移動方向は絶えず修正されています。刺激に対して、動物が勾配の最高濃度点に到達したため、プレートから取り出します。同じ個体を直接的に二度追跡しないように、動物は別のプレートに移動させます。

新しい幼虫を導入し、新たな記録を開始した後のトラッキングにおけるルールについて説明します。動物がプレートの最高濃度行（こちらとこちらに当たります）に到達した時点で、トラッキングを停止します。また、動物が壁に接触した場合は、干渉を避けるためトラッキングを中断します。

最初に検討した問いは、非常に単純なものでした。私たちが知りたかったのは、動物がある一定の濃度の臭気物質を感知できるかどうかということです。このようなテストを行うために、通常、私たちは複数の臭源ではなく、単一の臭源を用いるようにしています。

これにより、donor側の液滴内の濃度を変化させる自由度が1つ得られます。例えば、こちらに高濃度液滴があり、こちらに低濃度液滴があるという状況になります。通常は、donor液滴の直下のAgar表面に動物を導入し、動物がその存在を検知して付近に留まるかどうかを確認します。

ここからは、このアッセイをより高度に活用する方法について説明します。1つの液滴内に秩序がある状態を想定し、ここに重ねて表示されているように、いくつかの軌跡を記録したとします。ここでは3つの軌跡があり、そのうちの1つの個体がこの緑色のトラックを生成しています。

こちらに中心から外れたオレンジ色の軌跡があり、そして光源の周囲を回っていると思われる動物を示すピンク色の軌道があります。軌跡の詳細について、検討すべき多くの情報があると考えています。そのため、軌跡を一連の位置データとしてMATLABにインポートし、MATLABを用いて解析を行います。

ここにあるのは、おそらく時間の関数として表された光源までの距離です。先に表示した3つの軌跡のうち、緑色の軌跡は光源の非常に近くに留まっています。また、オレンジ色の軌跡は、著しくノイズが多いことを示しています。

そして、この紫色の軌跡がありますが、興味深いことに、動物がソースから離れて一定の距離に留まっていることが示されており、これはおそらく最適であった濃度に対応していたと考えられます。ここでは、嗅覚のない動物の10本の軌跡の例を示します。これらは、非嗅覚者のミュータント、または3Bミュータントです。

ご覧のように、これらの軌跡はすべて、動物が臭源を検知できず、そのまま立ち去ったことを示しています。対照的に、ここでは野生型動物の10回連続の軌跡を記録しました。これらの動物は当然ながら嗅覚を有しており、ご覧の通り、すべての個体が臭源の直下に集まっています。

提示された20本の軌跡は、実際には動物の個体識別を行わずに取得されたものです。これは、本アッセイの効率性と信頼性を示すものです。指数関数的な勾配を用いて、一部の変異体がここで匂いを検知できるかどうかを判断するために、複数のトラックを生成し、動物が刺激の反対端をどの程度適切に追跡できるかを確認します。

それでは、個別に記録された15本の軌跡をお見せします。ご覧の通り、動物たちは対極端のラインにある刺激に非常にうまく追従しています。ここで、簡単な対照実験を行います。指数関数的な勾配における動物たちがラインに沿って移動したのは、濃度に関係なく何らかの刺激があったためであり、単に動物が直進しただけである可能性が十分に考えられます。

したがって、幼虫が実際に濃度、あるいは濃度に関連する何かを計算し、それを運動の方向づけに利用していることを示すために、屋根のような形状のジオメトリを用意しました。通常通り、ここに幼虫を導入します。期待される結果は、幼虫がこの線に沿って移動し、ある地点を過ぎたところで濃度が低下していることを検知して、元の場所に戻ってくることです。この試験を5匹の個体で実施しました。

軌跡を収集し、それをこのスライド上に重ねて表示しています。ご覧の通り、動物はこの地点から出発して線に沿って移動し、その後、最高濃度に相当する領域を探索して主にそこに留まっています。このことは、単一光源アッセイを用いて、動物がリアルタイムで濃度勾配を算出できることを強く示唆しています。

私たちは主に、一つの大きな疑問について検証することができました。それは、「動物はマルチソースデバイスを用いることで、特定の濃度の臭気を検知できるか」ということです。これにより、濃度勾配の形状をより柔軟に変化させ、動物がこの情報を利用できるかどうかを判断することが可能になります。

簡単な実験を行い、この考えを説明したいと思います。これまで設定した勾配では、レンズに沿って指数関数的な形状となっていました。そこで、濃度がレンズに沿って線形に増加するようにしてさらに負荷をかけた場合、細胞は依然として反対側の端の線までたどり着くことができるのかという点が疑問となります。

このグラフは2種類のグラジエントを示しています。紫色の指数関数的グラジエントと、緑色の線形グラジエントをテストしました。こちらが線形グラジエントであり、親油で希釈した酢酸イソアミルの異なる濃度を記載します。

これは等差数列です。線形勾配が形成されますが、見ての通り、こちらの濃度勾配は緩やかです。一方で、指数関数的勾配では両端の濃度も 0.5 ですが、0.03 まで上昇します。問題は、このような緩やかな勾配に直面した際に、navi が化学走性を（chemo attacks）示すことができるかということです。

ここでは、指数勾配および線形勾配の6つの液滴に使用された酢酸の実際の濃度を示します。ご覧のように、線形勾配の場合、両ケースで最高濃度は同じですが、ここでの最低濃度はかなり高い数値になっています。線形勾配を用いて実験を行い、野生型動物の15本の軌跡をここに示しましたが、これらの動物が線形勾配を検知し、この信号に沿って移動できたことはかなり明白であると考えられます。

さて、要点は明確になったかと思います。ここで締めくくる前に、このトラッキングシステムの今後の方向性について簡潔にお話ししたいと思います。このトラッキングシステムを使用すれば、例えば幼虫の複雑な行動をより広い範囲で、より長期間にわたって観察するなど、多くの興味深い研究が可能になりますが、一方でいくつかの限界もあります。

例えば、プレートのサイズに制限があるため、追跡可能な時間や観察可能な複雑な行動に制約が生じます。したがって、プレートを大型化するか、あるいはプレートの境界に全く制限されないシステムを開発できれば有用です。もう一つの課題は、現在のソフトウェアでは複数の個体を同時に追跡することが困難であり、集団行動をリアルタイムで観察することが不可能である点です。

今回のセットアップでは検証できない、行動におけるもう一つの興味深い側面は、幼虫の空間における実際の三次元的な動きです。個体を追跡していると、例えば、彼らが臭気ドロップレットに到達した際に、頭を上げたり、濃度の変化を検知しようとして頭を左右に振ったりすることが観察されるでしょう。現在の私たちの特定のセットアップでは、おそらくこのような観察は不可能であるため、これを可能にする手法を開発できれば有益だと思われます。