凍結熱分解と同重体担体を用いた質量分析のためのシングルセルプロテオミクス調製(英語)

SCoPE2は、抗体なしで数千の単一の哺乳類細胞から数千のタンパク質を定量することができます。このプロトコルは、バルク解析では見えないプロテオームの不均一性を明らかにするのに役立ちます。SCoPE2アプローチを使用したシングルセルプロテオミクスは、単なるピペットからリキッドハンドリングロボットまで、さまざまなリソースを持つ研究者がアクセスできるように設計されています。

SCoPE2は、同じ集団の単一細胞間でタンパク質の存在量がどのように異なるかについての洞察を提供することにより、癌や免疫学を含む多くの研究分野に広く適用できます。まず、単細胞を選別した384ウェルプレートをサーマルサイクラーに入れ、摂氏90度で10分間加熱した後、摂氏12度で冷却して、細胞溶解手順を開始します。ベンチトッププレートスピナーでプレートを摂氏18〜22度で簡単に回転させます。

18〜22°Cの水浴超音波処理器で5分間プレートを超音波処理します。次に、氷の上に置きます。トリプシン消化を進めるには、100マイクロリットルのマスターミックスを調製し、リキッドハンドラーを使用して0.2マイクロリットルのマスターミックスを384ウェルプレートの各ウェルに加えます。

プレートを密閉し、5秒間ボルテックスし、ベンチトッププレートスピナーで摂氏18〜22度で回転させます。蓋の温度を摂氏52度に設定して、384ウェルプレートを摂氏37度で3時間加熱します。タンデムマスタグ反応を設定するには、摂氏マイナス80度の冷凍庫から85ミリモルのタンデム質量タグを取り出します。

それらを開く前に、チューブを室温に温め、無水アセトニトリルでラベルを22ミリモルに希釈します。このラベリング戦略を使用して、液体分注ロボットまたは手動ピペットを使用して、384ウェルプレートの各ウェルに0.5マイクロリットルの希釈タンデムマスタグを追加します。プレートを密閉し、5秒間ボルテックスし、ベンチトッププレートスピナーで摂氏18〜22度で回転させます。

標識反応を摂氏18〜22度で1時間進行させます。タンデムマスタギング反応のクエンチのために、HPLCグレードの水で希釈した0.2マイクロリットルの0.5%ヒドロキシルアミンを、リキッドハンドラーを使用して384ウェルプレートの各ウェルに加えます。プレートを密封し、5秒間ボルテックスし、ベンチトッププレートスピナーでスピンダウンしてから、プレートを摂氏18〜22度に30分間保ちます。

LC-MS分析の準備は、マイナス80°Cの冷凍庫から担体または標準物質を取り出すことから開始されます。各セットについて、1マイクロリットルの担体および標準物質を最初のウェルにピペットで入れ、1セットの一部となる。最初のウェルから次のウェルまでの全容量をピペットで固定します。

1つのセットに含まれるすべてのウェルが最終的なウェルに結合されるまで、1つのウェルから次のウェルに全容量をピペッティングし続けます。各セットについて、HPLCグレードの水で希釈した50%アセトニトリルを5マイクロリットル加え、最初の単一セルウェルを各セットに含めます。最初のウェルから次のウェルまでの全容量をピペットで固定します。

1つのセットに含まれるすべてのウェルが最終的なウェルに結合されるまで、1つのセルから次のセルに全容量をピペッティングし続けます。次に、各セットをオートサンプラーガラスインサートに移します。すべてのセットを組み合わせてガラスインサートに入れたら、サンプルを乾燥させます。

LC-MS-MS分析の前に、1.2マイクロリットルの0.1%ギ酸を各セットに追加して、標識ペプチドを再懸濁します。オートサンプラーインサートをガラスオートサンプラーバイアルに入れ、各サンプルをキャップで閉じます。各バイアルを5秒間ボルテックスして再懸濁が完了したことを確認してから、バイアルスピナーで摂氏18〜22度でスピンダウンします。

各サンプルが側面に飛び散るのではなく、インサートの下部にあることを確認してください。バイアルをオートサンプラートレイに入れ、セットごとにLC-MS-MS分析用の1マイクロリットルのサンプルを注入します。単一細胞の消化および標識効率は、キャリアのように直接アッセイされない場合がありますが、DO-MSソフトウェアは、消化および標識効率を推定するプロットを提供します。

消化不良は、完全に切断された対応物に対する誤切断されたペプチドの強度の高い比によって示される。セットで考慮すべき別の要因は、各タンデム質量タグ付けチャネルにおけるレポーターイオン強度の中央値の欠落データの割合です。単一細胞が正常に調製されると、細胞あたりの欠損データおよびポジティブコントロールは、ネガティブコントロールサンプルよりもはるかに低くなります。

LC-MS-MSサンプル調製中の慎重な液体の取り扱いは、ペプチドを最大限に回収するために重要です。ウェル当たり約100ピコグラム〜100ナノグラムの小さなサンプルを、同重体担体を用いたプロテオミクス分析用に調製することができる。SCoPE2は、一般的な試薬と市販の機器のみを使用して、世界中の研究者がシングルセルプロテオミクス測定にアクセスできるようにします。

ロボットリキッドハンドリングによる手動処理または高スループット自動化に適しています。