Name: 凍結熱分解と同重体担体を用いた質量分析のためのシングルセルプロテオミクス調製(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: 学ぶSCoPE2法によるシングルセルプロテオミクス調製。質量分析で哺乳類細胞の数千種タンパク質を抗体なしで定量し、がん・免疫学研究における細胞内タンパク質発現の異質性を解明する手法です。

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この出版物に資金を提供してくれた2021年秋のNSF I-Corpsプログラム(ノースイースタン大学サイト)賞に感謝したいと思います。

<ol><li>Symmons, O., Raj, A. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27259209/">What's luck got to do with it: single cells, multiple fates, and biological nondeterminism.</a> Molecular Cell. 62 (5), 788-802 (2016).</li>
<li>Paul, I., White, C., Turcinovic, I., Emili, A. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33351222/">Imaging the future: the emerging era of single-cell spatial proteomics.</a> The FEBS Journal. 288 (24), 6990-7001 (2020).</li>
<li>Levy, E., Slavov, N. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30072488/">Single cell protein analysis for systems biology.</a> Essays in Biochemistry. 62 (4), 595-605 (2018).</li>
<li>Nagasawa, S., Kashima, Y., Suzuki, A., Suzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+and+spatial+analyses+of+cancer+cells%3A+toward+elucidating+the+molecular+mechanisms+of+clonal+evolution+and+drug+resistance+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Single-cell and spatial analyses of cancer cells: toward elucidating the molecular mechanisms of clonal evolution and drug resistance acquisition.</a> Inflammation and Regeneration. 41 (1), 22(2021).</li>
<li>Shaffer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+cell+variability+and+drug-induced+reprogramming+as+a+mode+of+cancer+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rare cell variability and drug-induced reprogramming as a mode of cancer drug resistance.</a> Nature. 555 (7695), 274(2018).</li>
<li>Pan, D., Jia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+single-cell+multi-omics+in+dissecting+cancer+cell+plasticity+and+tumor+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Application of single-cell multi-omics in dissecting cancer cell plasticity and tumor heterogeneity.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 757024(2021).</li>
<li>Segerstolpe, Å, et al. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27667667/">Single-cell transcriptome profiling of human pancreatic islets in health and type 2 diabetes.</a> Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).</li>
<li>Tritschler, S., Theis, F. J., Lickert, H., Böttcher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+single-cell+analysis+provides+new+insights+into+heterogeneity+and+plasticity+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Systematic single-cell analysis provides new insights into heterogeneity and plasticity of the pancreas.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 974-990 (2017).</li>
<li>Hanna, S. J., Tatovic, D., Thayer, T. C., Dayan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+single+cell+rna+sequencing+into+the+immunology+of+type+1+diabetes-+cell+phenotypes+and+antigen+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insights from single cell rna sequencing into the immunology of type 1 diabetes- cell phenotypes and antigen specificity.</a> Frontiers in Immunology. 12, 751701(2021).</li>
<li>Baron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+map+of+the+human+and+mouse+pancreas+reveals+inter-+and+intra-cell+population+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure.</a> Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).</li>
<li>Franks, A., Airoldi, E., Slavov, N. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28481885/">Post-transcriptional regulation across human tissues.</a> PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005535(2017).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpicking+the+proteome+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Unpicking the proteome in single cells.</a> Science. 367 (6477), 512-513 (2020).</li>
<li>Specht, H., Slavov, N. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29945450/">Transformative opportunities for single-cell proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 17 (8), 2565-2571 (2018).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34986167/">Learning from natural variation across the proteomes of single cells.</a> PLoS Biology. , (2021).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Driving+single+cell+proteomics+forward+with+innovation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Driving single cell proteomics forward with innovation.</a> Journal of Proteome Research. 20 (11), 4915-4918 (2021).</li>
<li>Specht, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+and+transcriptomic+analysis+of+macrophage+heterogeneity+using+SCoPE2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2.</a> Genome Biology. 22 (1), 50(2021).</li>
<li>Petelski, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+single-cell+proteomics+using+SCoPE2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplexed single-cell proteomics using SCoPE2.</a> Nature Protocols. 16 (12), 5398-5425 (2021).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8683604/">Scaling up single-cell proteomics.</a> Molecular and Cellular Proteomics: MCP. 21 (1), 100179(2022).</li>
<li>Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+single-cell+proteomics+workflow+identifies%3E+1000+protein+groups+per+mammalian+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive single-cell proteomics workflow identifies> 1000 protein groups per mammalian cell.</a> Chemical Science. 12 (3), 1001-1006 (2021).</li>
<li>Lombard-Banek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+subcellular+mass+spectrometry+enables+proteo-metabolomic+single-cell+systems+biology+in+a+chordate+embryo+developing+to+a+normally+behaving+tadpole+%28X.+laevis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">In vivo subcellular mass spectrometry enables proteo-metabolomic single-cell systems biology in a chordate embryo developing to a normally behaving tadpole (X. laevis).</a> Angewandte Chemie. 60 (23), 12852-12858 (2021).</li>
<li>Specht, H., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+accuracy+and+depth+of+protein+quantification+in+experiments+using+isobaric+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Optimizing accuracy and depth of protein quantification in experiments using isobaric carriers.</a> Journal of Proteome Research. 20 (1), 880-887 (2020).</li>
<li>Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCoPE-MS%3A+mass+spectrometry+of+single+mammalian+cells+quantifies+proteome+heterogeneity+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation.</a> Genome Biology. 19 (1), 161(2018).</li>
<li>Specht, H., Harmange, G., Perlman, D. H., Emmott, E. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/10.1101/399774v1">Automated sample preparation for high-throughput single-cell proteomics.</a> BioRxiv. , at https://www.biorxiv.org/content/10.1101/399774v1.abstract (2018).</li>
<li>Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+resolving+proteomes+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Towards resolving proteomes in single cells.</a> Nature Methods. 18 (8), 856(2021).</li>
<li>Huffman, R. G., Chen, A., Specht, H., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DO-MS%3A+Data-driven+optimization+of+mass+spectrometry+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">DO-MS: Data-driven optimization of mass spectrometry methods.</a> Journal of Proteome Research. 18 (6), 2493-2500 (2019).</li>
<li>Chen, A. T., Franks, A., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DART-ID+increases+single-cell+proteome+coverage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">DART-ID increases single-cell proteome coverage.</a> PLoS Computational Biology. 15 (7), 1007082(2019).</li>
<li>Cheung, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+carrier+proteome+limit+for+single-cell+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Defining the carrier proteome limit for single-cell proteomics.</a> Nature Methods. 18 (1), 76-83 (2021).</li>
<li>Leduc, A., Huffman, R. G., Slavov, N. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.04.24.441211v4.article-info">Droplet sample preparation for single-cell proteomics applied to the cell cycle.</a> bioRxiv. , https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.04.24.441211v1.abstract (2021).</li>
<li>Vanderaa, C., Gatto, L. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/14789450.2021.1988571">Utilizing Scp for the analysis and replication of single-cell proteomics data.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
</ol>

著者には利益相反はありません。

SCoPE2による単一細胞の調製と分析を成功させるための鍵の1つは、キャリアとリファレンスチャネルの調製です。推奨されるキャリアサイズは100〜200セルです。しかしながら、特定の単一細胞実験に必要な細胞の数は、他の場所で論じられたような原理に基づいて決定することができる21。推奨サイズでは、384ウェルプレートあたり少なくとも~11,275細胞が必要であり、各セットで200セルのキャリアと5セルのリファレンスが可能です。所望の細胞集団が制限因子ではない場合、より多くの細胞を単離し、ミスの場合に単に余分な材料を有することが有利であり得る(このプロトコルで行われたように、11,275細胞の代わりに22,000細胞を単離する)。目的のプレート数に必要なキャリアとリファレンスの量は、バッチ間でペプチドの同定または定量が異なる原因となる可能性のあるバッチ間のばらつきを最小限に抑えるために、単一のバッチで調製する必要があります。
シングルセルを384ウェルプレートのウェルに単離する前に、プレートレイアウトの設計を考慮することが重要です。各384ウェルプレート内では、ポジティブコントロールとネガティブコントロールの両方を実装することをお勧めします。ネガティブコントロールは、細胞が添加されていないが、単一細胞ウェルと同じ試薬添加および手順を経るウェルです。ポジティブコントロールは、単一細胞の代わりに2〜5細胞/μLに希釈した細胞ライセートを添加したウェルです。これは、単一細胞単離法が十分に検証されていない場合に実装することが特に重要です。各384ウェルプレートは、理想的には単一細胞と対照のランダム化された分布を有するべきである(例えば、陰性または陽性の対照が1列だけにない)。各プレートは、1つのプレートで1つの細胞タイプを分離し、2番目のプレートで2番目の細胞タイプを分離するのではなく、関心のあるすべての細胞集団の均等な分布を持つ必要があります。これにより、バッチ効果と目的の細胞タイプが結び付けられるのを防ぐことができます。さらに、解析に複数の384ウェルプレートが必要な場合は、可能であれば、単離ステップを数日間に分散させるのではなく、1回のセッションで細胞を単離することをお勧めします。
単一細胞および担体/基準の両方の溶解は、凍結熱サイクル23を通じて水中で行われる。このステップでほとんどのプロテアーゼが変性することが予想されます。次いで、トリプシンは変性ステップの直後に高濃度で添加され、最も豊富な細胞プロテアーゼよりも何桁も高い濃度である。質量作用により、プロテアーゼ活性のほとんどの生成物はトリプシンによるものになります。
システイン残基の還元/アルキル化は、トリプシン消化の前にこのプロトコルでは行われません。システイン含有ペプチドは、ヒトプロテオーム由来のトリプシンペプチドの約10%を占めています。還元/アルキル化なしのアプローチを使用して、より少ないシステイン含有ペプチドを観察します。これらのステップでは、消化直後のTMT(NHSエステル化学)による標識に適合しない試薬を使用します。
このTMT標識戦略では、キャリアとリファレンスはそれぞれ126および127Nで標識され、シングルセルウェルとコントロールウェルは128Cから135Nで標識されます。参照後の2つの標識、127Cおよび128Nは、単一細胞よりもペプチド材料中に明らかにはるかに豊富である担体および参照チャネルから生じる同位体交差汚染のために使用されていない。TMTpro-16plexではシングルセルまたはコントロールウェルの標識に使用できるTMTチャンネルは合計12個、TMTpro-18plexではセットあたり14個のTMTチャンネルがあります。
このプロトコルを使用してシングルセルプロテオミクス測定を実行するためのプロトコルの重要なステップには、キャリアの調製、シングルセル単離、溶解、消化、バーコードラベリング、および適切な質量分析パラメーターが含まれます。これらの手順は、このドキュメントで概説されており、他の場所で広範囲に詳述されています17、21、25。各ステップには、DO-MSに対応するプロットまたはプロットのセットがあり、品質管理が容易です。例えば、担体の作成が成功した場合、同定されたペプチドの数、標識効率、およびミスカット率の割合を示すプロットにより、その成功した調製の検証が可能になります。代表的なDO−MSレポートは、この出版物に含まれており、元のデータ16について http://scope2.slavovlab.net/ で見ることができます。これらのDO-MSレポートは、より長いLC勾配、異なる消化酵素、代替化学バーコードなど、著者によってまだ調査されていない方向でのメソッドの最適化を評価することを可能にします。
現在、データ依存取得アルゴリズムによるペプチドの連続分析では、妥当な長さのLCランで分析できるペプチドの数が制限されています。これは、信頼性の高い単一細胞定量に十分なイオンを正常に取得するために必要な充填時間が長くなることに一部起因しています21。担体を使用することに固有の制限は、単一細胞の消化および標識効率の直接評価の欠如である。現在、この制限に対する1つの解決策は、単一細胞と一緒に処理されたより大きなサンプルに対して品質管理を実行することです。
私たちは、複数の分析装置を備えた質量分析計を構築するなど、シングルセルプロテオミクスを改善するための多くの機会を提案しました。現在の方法では、市販の試薬と装置を使用して、1日あたり約100細胞の速度で単一の哺乳類細胞から数千のタンパク質を定量することができます。SCoPE-MSアプローチの第2世代であるSCoPE2は、単位時間あたりに分析可能な細胞数、単位時間あたりに分析可能なタンパク質の数、サンプル調製に必要な時間、試薬と機器のアクセス可能性、および単一細胞あたりの調製と分析の全体的なコストに関して、前任者よりも大幅に改善されました。膜結合タンパク質は、尿素溶解と比較して示されているように、凍結熱溶解およびプロテアーゼ消化を使用してアクセス可能である23。この方法は、存在量16に関してプロテオームの上位3分の1から多くのタンパク質を同定する。修飾プロテオフォームがプロテオームの上部3分の1にあり、修飾ペプチドが質量分析に適している場合(イオン化がよく、非修飾ペプチドとは質量差がある)、このプロトコルに適している可能性が高くなります。この方法は、分化、老化、免疫学的応答(すなわち、食作用)など、細胞間に意味のある不均一性がある生物学的システムに実りあるものに適用できます。

シングルセル解析は、バルク測定では識別できない生物学的システム内の不均一性のレベルを研究するために広く使用されています1,2,3。このような細胞の多様性は、癌細胞の治療抵抗性4,5,6から糖尿病における細胞間不均一性7,8,9,10まで、不可欠な生物学的プロセスの理解を促進することができる機能的結果をもたらす可能性がある。多くの研究は、遺伝的またはトランスクリプトームレベルを測定することによって、単一細胞中の核酸を測定することに焦点を当てており、細胞の種類と状態の分類を可能にしました。しかし、核酸空間におけるこのような進歩は、転写後制御11の知識ギャップを埋めることができず、単一細胞における同様にハイスループットなタンパク質測定の必要性を推進している12、13、14、15。
私たちは、哺乳類系の厳密で堅牢なシングルセルプロテオミクスの需要に対応するために、SCoPE216,17を開発しました。これは多重化された方法であり、一度に1つの細胞を分析するラベルフリーのmthodとは対照的に、多くの細胞を並行して標識および分析することによりスループットを向上させることができます18,20。サンプル調製方法、質量分析アプローチ、およびその後のデータ分析ステップにより、単一細胞あたり数百から数千のタンパク質を正確に定量できます。この方法は、対象とする単一細胞集団と生物学的に類似している細胞の小さなバルクサンプル(通常25〜200)である同重体担体21を介して単一細胞の質量分析を可能にする。このキャリア材料は、タンデム質量タグ(TMTラベル)を使用して、同じ材料と単一セルの基準チャネルとのセットで多重化されます。キャリアチャネルは、サンプルの損失を表面積まで低減し、ペプチド同定を成功させるためのイオンバックボーンフラグメントを提供します。バルクで調製され、その後、各単一細胞セットに対して5〜10細胞当量に希釈される参照チャネルは、分析における技術的な変動性を制御するのに役立ちます。具体的には、このリファレンスにより、イオンサンプリングやイオン化効率など、LC-MS/MS関連の影響によって引き起こされる変動性の正規化が可能になります。通常、基準チャネルとキャリアチャネルは同じ細胞集団から作られます。
このサンプル調製プロトコルは、SCoPE-MS22をベースに複数の相乗的な改良を加えた第2世代のメソッドです。改善には、MSプロテオミクス調製の一般的なステップであるサンプルクリーンアップを回避する細胞溶解法が含まれます。凍結熱溶解法であるmPOP(最小プロテオミックサンプル調製)23を使用しています。この方法では、バイアルではなく、少量およびマルチウェルプレートでの単一細胞の溶解が可能になり、より高いスループットレートとサーマルサイクラーによる自動化が容易になりました。全体として、この方法はSCoPE-MS16,24と比較して、単一細胞あたりのコストを削減し、定量精度を向上させました。
このプロトコルでは、TMTpro 18-plexアイソバリック標識を使用してキャリアチャネルとリファレンスチャネルを準備する方法など、プロテオミクス解析用のシングルセルを準備する方法について説明します。シングルセル懸濁液中であり、384ウェルプレートに単離できる哺乳類細胞は、このプロトコルに適している可能性があります。また、成功したシングルセルセットの代表的な結果も含まれており、R ShinyアプリDO-MS25によって生成されたいくつかの品質管理プロットが表示されます。他の公開されたソフトウェアツール26、27および実験ガイドライン17、21は、このプロトコルの採用を改善した。このビジュアルガイドが、研究者がシングルセルプロテオミクス実験を行うのにさらに役立つことを願っています。

<table><tbody><tr><td>384ウェルプレート、標準PCRプレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AB1384</td><td>ポリプロピレンプレートを代わりに使用する必要があります。置換する場合は、SCoPE2を調製する前に、他のプレートからの潜在的なポリマー汚染のレベルを評価する必要があります。</td></tr><tr><td>アセトニトリル(緩衝液の調製用)、Optima LC-MS/MSグレード</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A955-1</td><td>このアセトニトリルは、SCoPE2セットを組み合わせる際にキャリアとリファレンスを通過した後、ウェルを通過するために使用される50%アセトニトリル、すなわち50%アセトニトリルに使用されます><。皮膚、目、気道、中枢神経系を刺激する可能性があります。必ず個人用保護具を着用してください。ケミカルヒュームフードの下でハンドルを握ります。</td></tr><tr><td>アセトニトリル(TMTの調製用)、無水、99.8%</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>271004-100ML</td><td>このアセトニトリルは、TMTラベルをメーカーの濃度で再懸濁するために使用されます。 注意:アセトニトリルは可燃性の液体です。皮膚、目、気道、中枢神経系を刺激する可能性があります。必ず個人用保護具を着用してください。ケミカルヒュームフードの下でハンドルを握ります。</td></tr><tr><td>接着性 PCRプレートホイル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AB0626</td><td></td></tr><tr><td>オートサンプラーバイアル スクリュースクリューキャップ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C5000-51B</td><td></td></tr><tr><td>オートサンプラーバイアルスピナー(例:myFuge 5)</td><td>MTC Bio</td><td>C2595</td><td>このモデルには速度制御はありません。これは、オートサンプラーバイアルの底に液体を収めるために簡単に使用されます。</td></tr><tr><td>ベンゾナーゼヌクレアーゼ</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>E1014-25KU</td><td></td></tr><tr><td>透明ガラスねじバイアル、9 mm</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>60180-509</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸、ピアス、LC-MS/MS グレード</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>85178</td><td>注意:ギ酸は可燃性の液体です。深刻な目の損傷や皮膚の火傷を引き起こす可能性があります。必ず個人用保護具を着用してください。風通しの良い場所で取り扱ってください。</td></tr><tr><td>ガラス製オートサンプラーインサート、9 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C4010-630</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxylamine (HA)、50% wt/vol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>467804-50ML</td><td>注意:ヒドロキシラミンは皮膚の炎症を引き起こす可能性があります。必ず個人用保護具を着用してください。</td></tr><tr><td>Mantisマイクロ流体チップ、少量3PFEチップ</td><td>Formulatrix</td><td>MCLVPR2</td><td>これらのチップは、Mantisマイクロ流体液体ハンドラーと一緒に有機溶液を分配するために使用することを目的としています。これらは、TMTラベルのディスペンスに使用できます。</td></tr><tr><td>カマキリマイクロ流体チップ、少量シリコンチップ</td><td>Formulatrix</td><td>MCLVS12</td><td>これらのチップは、マンティスマイクロ流体液体ハンドラーと一緒に水溶液を分配するために使用することを目的としています。これらはTMTラベルのディスペンスには使用できません。</td></tr><tr><td>カマキリのマイクロ流体液体のハンドラー</td><td>Formulatrix</td><td></td><td>の液体のハンドラーは代用することができます。ただし、システムが 100% アセトニトリルに適合しているかどうか(TMT ラベルの場合など)、システムがサンプルにポリマー汚染やその他の種類の汚染を導入していないことを確認することが重要です。</td></tr><tr><td>自動プレートハンドリング用の幅広円錐ピン付きカマキリPCRプレートアダプター</td><td>Formulatrix</td><td>232400</td><td></td></tr><tr><td>MassPREPペプチド混合物</td><td>ウォーターズ</td><td>186002337</td><td>9つの非トリプシンペプチドの混合物</td></tr><tr><td>PCRチューブスピナー(すなわち、0.2mLチューブ用の16場所微量遠心分離機)</td><td>USA Scientific</td><td>2621-0016</td><td>このモデルには速度制御はありません。チューブの底に液体を集めるだけのものです。</td></tr><tr><td>PCRチューブ: TempAssure 0.2 mL PCR 8チューブストリップ</td><td>USA Scientific</td><td>1402-3900</td><td>交換された場合、SCoPE2調製前に他のプレートからの潜在的なポリマー汚染のレベルを評価する必要があります。</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、10倍、pH 7.4、RNaseフリー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>プレートスピナー(PlateFuge微量遠心分離機)</td><td>ベンチマークサイエンティフィック</td><td>モデル C2000</td><td>このモデルには速度制御はありません。それは単に井戸の底で液体を集めるために使用されます。</td></tr><tr><td>サーマルサイクラー(例:C1000 Touch with 384-well module)</td><td>Biorad</td><td>1851138</td><td></td></tr><tr><td>TMTpro 16plex ラベル試薬セット、1 x 5 mg</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A44520</td><td></td></tr><tr><td>トリエチルアンモニウム重炭酸塩 (TEAB)、1 M、pH 8.5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7408100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Gold Mass Spectrometry Grade</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td>これはトリプシンが非常に高純度です。他のトリプシン試薬は、純度のレベルが異なる場合があります。SCoPE2の陽性結果を得るためには、純度のレベルが重要です 注意:トリプシンは、皮膚、呼吸器、眼の炎症を引き起こす可能性があります。必ず個人用保護具を着用してください。ケミカルヒュームフードの下でハンドルを握ります。</td></tr><tr><td>ボルテックス(アナログボルテックスミキサー)</td><td>VWR</td><td>モデル58816-121</td><td></td></tr>ウォーター<tr><td>バスソニケーター(デジタルタイマー付き2.8L超音波洗浄機)</td><td>VWR</td><td>97043964</td><td></td></tr><tr><td>水、オプティマLC-MS / MSグレード</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>W6-1</td>希釈<td>または製造する必要があるすべての溶液は、質量分析グレードの水で作ることをお勧めします。希釈液やマスターミックスは新鮮にする必要があります。低品位の水による汚染は、ペプチドの検出やシングルセルのデータ品質に悪影響を及ぼす可能性があります。</td></tr></tbody></table>

凍結熱分解と同重体担体を用いた質量分析のためのシングルセルプロテオミクス調製(英語)

Single-Cell Proteomics Preparation for Mass Spectrometry Analysis Using Freeze-Heat Lysis and an Isobaric Carrier

シングルセルプロテオミクス解析には、高感度で定量的に正確で、広くアクセス可能で堅牢な方法が必要です。これらの要件を満たすために、シングルセルプロテオミクス(SCoPE2)プロトコルは、限られたサンプルから数百から数千のタンパク質を単一細胞レベルまで定量するための第2世代の方法として開発されました。この方法を用いた実験により、1,500個の哺乳類細胞(細胞あたり500〜1,000個のタンパク質)にわたって3,000を超えるタンパク質を10日間の質量分析計装置で定量することを達成しました。SCoPE2は、細胞溶解に凍結熱サイクルを活用することで、単一細胞のクリーンアップの必要性を排除し、その結果、サンプル損失を低減すると同時に、サンプル調製を迅速化し、自動化を簡素化します。さらに、この方法では同重体キャリアを使用しているため、タンパク質の同定が容易になり、サンプルの損失が減少します。
このビデオプロトコルは、広くアクセス可能な機器と試薬のみを使用した自動シングルセルタンパク質分析の採用を可能にするための詳細なガイダンスを提供します。採取から注入、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)分析まで、プロテオミクス解析用の単一細胞を調製する手順における重要なステップを示します。さらに、視聴者は、同重体担体を用いた実験計画の原則、等圧担体と単一細胞調製物の両方の品質管理、およびアプローチの限界についての議論を伴う代表的な結果を通して導かれます。

プロトコルからの肯定的な結果は、プロトコル内のいくつかの重要なステップが正常に実行されたことを確認することを伴います。これらには、担体の調製、シングルセル単離、溶解、消化、バーコード標識、およびMSパラメータの最適化が含まれます。DO-MSプロットにより、プロトコルの各重要なステップの完了を簡単に評価できます。正常に調製された担体は、通常、量(セットあたり)で25および200細胞に相当し、よく消化され、よく標識されています。DO-MSのプロットにより、サンプルの強度(量を推定するため)、消化効率(理想的には&lt;25%のミスカット)、および標識効率(&gt;99%である必要があります)を定量化できます。最も重要なのは、完全に標識されていないキャリアサンプルは、単一細胞を対象としたバーコードとの交差反応を可能にし、単一細胞ペプチドの定量に偽のシグナルを追加する可能性があることです。
陰性対照ウェルには、すべての実験試薬が含まれていますが、細胞がありません。これにより、バックグラウンドノイズを評価するだけでなく、空のウェルの代表的なシグナルを提供することによって細胞分離効率も決定できます。DO-MSレポートは、単一細胞ウェルと一緒にコントロールウェルの測定シグナルを評価し、細胞分離とバックグラウンドノイズの成功を判断するためのプロットを提供します。さらに、定量の質は、SCoPE2パイプライン(GitHub:github.com/SlavovLab/SCoPE2 で入手可能)またはSCPバイオコンダクターパッケージ29を使用して評価できます。
単一細胞の消化および標識効率は、担体のように直接アッセイされない場合もあるが、DO-MSは、消化および標識効率の推定を可能にするプロットを再び提供する。単一細胞の調製と並行して100〜200細胞のコントロールを含める(すなわち、すべて同じ試薬添加を受ける)ことにより、そのコントロールの消化および標識効率を評価し、一緒に調製された単一細胞によって共有されると仮定することができる。消化不良は、完全に切断されたペプチドに対する切断されたペプチドの強度の比率が高いことによって示されます(図1)。
セットで考慮すべき別の要素は、各TMTチャネルの欠損データの割合とレポーターイオン強度の中央値です(図2)。単一細胞が正常に調製されると、細胞およびポジティブコントロールあたりの欠損データの量は、ネガティブコントロールサンプルよりもはるかに少なくなります。同様に、前駆体の強度の中央値は、ネガティブコントロールよりも単一細胞およびポジティブコントロールではるかに高くなります。MSパラメータの最適化は、他の場所で広く議論されており21、最適なパラメータは、DO−MSまたはSCPコンパニオン25,27などのツールを使用して決定することができる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63802/63802fig01.jpg"> 図1:キャリア調製の品質管理。 DO-MSプロットは、(A)TMTによる標識部位(リジンの側鎖上の第一級アミンおよびペプチドN末端)での正常調製担体の標識効率、および(B)トリプシン切断のアミノ酸残基における消化効率を示すプロットです。略称: TMT = タンデム質量タグ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63802/63802fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63802/63802fig02.jpg"> 図2:シングルセル調製の品質管理。 DO-MSプロットは、(A)単一細胞(C5-10)、コントロール(C13、16)、キャリア(C1)、および参照(C2)の欠損データの割合、および(B)単一セルおよびコントロールの強度を示しています。C3、C4、C11、C12、およびC15に対応するタグ127C、128N、131C、132N、133N、および133Cは、この特定のセットでは使用されていない。ポジティブコントロールは、細胞物質をバルクでペプチドに加工し、標識前に2〜5細胞/ μLのレベルに希釈することで構成されます。陰性対照は、単一細胞を添加することなく、単一細胞に使用されるすべての準備ステップによく供されるものからなる。略称: TMT = タンデム質量タグ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63802/63802fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルでは、市販の試薬と機器を使用した質量分析 による シングルセルプロテオミクス分析用の哺乳類細胞を調製する方法を説明し、手動および自動ピペッティングの両方のオプションを提供します。

Single-cell proteomics analysis requires sensitive, quantitatively accurate, widely accessible, and robust methods. To meet these requirements, the ...

SCoPE2は、抗体なしで数千の単一の哺乳類細胞から数千のタンパク質を定量することができます。このプロトコルは、バルク解析では見えないプロテオームの不均一性を明らかにするのに役立ちます。SCoPE2アプローチを使用したシングルセルプロテオミクスは、単なるピペットからリキッドハンドリングロボットまで、さまざまなリソースを持つ研究者がアクセスできるように設計されています。SCoPE2は、同じ集団の単一細胞間でタンパク質の存在量がどのように異なるかについての洞察を提供することにより、癌や免疫学を含む多くの研究分野に広く適用できます。まず、単細胞を選別した384ウェルプレートをサーマルサイクラーに入れ、摂氏90度で10分間加熱した後、摂氏12度で冷却して、細胞溶解手順を開始します。ベンチトッププレートスピナーでプレートを摂氏18〜22度で簡単に回転させます。18〜22°Cの水浴超音波処理器で5分間プレートを超音波処理します。次に、氷の上に置きます。トリプシン消化を進めるには、100マイクロリットルのマスターミックスを調製し、リキッドハンドラーを使用して0.2マイクロリットルのマスターミックスを384ウェルプレートの各ウェルに加えます。プレートを密閉し、5秒間ボルテックスし、ベンチトッププレートスピナーで摂氏18〜22度で回転させます。蓋の温度を摂氏52度に設定して、384ウェルプレートを摂氏37度で3時間加熱します。タンデムマスタグ反応を設定するには、摂氏マイナス80度の冷凍庫から85ミリモルのタンデム質量タグを取り出します。それらを開く前に、チューブを室温に温め、無水アセトニトリルでラベルを22ミリモルに希釈します。このラベリング戦略を使用して、液体分注ロボットまたは手動ピペットを使用して、384ウェルプレートの各ウェルに0.5マイクロリットルの希釈タンデムマスタグを追加します。プレートを密閉し、5秒間ボルテックスし、ベンチトッププレートスピナーで摂氏18〜22度で回転させます。標識反応を摂氏18〜22度で1時間進行させます。タンデムマスタギング反応のクエンチのために、HPLCグレードの水で希釈した0.2マイクロリットルの0.5%ヒドロキシルアミンを、リキッドハンドラーを使用して384ウェルプレートの各ウェルに加えます。プレートを密封し、5秒間ボルテックスし、ベンチトッププレートスピナーでスピンダウンしてから、プレートを摂氏18〜22度に30分間保ちます。LC-MS分析の準備は、マイナス80°Cの冷凍庫から担体または標準物質を取り出すことから開始されます。各セットについて、1マイクロリットルの担体および標準物質を最初のウェルにピペットで入れ、1セットの一部となる。最初のウェルから次のウェルまでの全容量をピペットで固定します。1つのセットに含まれるすべてのウェルが最終的なウェルに結合されるまで、1つのウェルから次のウェルに全容量をピペッティングし続けます。各セットについて、HPLCグレードの水で希釈した50%アセトニトリルを5マイクロリットル加え、最初の単一セルウェルを各セットに含めます。最初のウェルから次のウェルまでの全容量をピペットで固定します。1つのセットに含まれるすべてのウェルが最終的なウェルに結合されるまで、1つのセルから次のセルに全容量をピペッティングし続けます。次に、各セットをオートサンプラーガラスインサートに移します。すべてのセットを組み合わせてガラスインサートに入れたら、サンプルを乾燥させます。LC-MS-MS分析の前に、1.2マイクロリットルの0.1%ギ酸を各セットに追加して、標識ペプチドを再懸濁します。オートサンプラーインサートをガラスオートサンプラーバイアルに入れ、各サンプルをキャップで閉じます。各バイアルを5秒間ボルテックスして再懸濁が完了したことを確認してから、バイアルスピナーで摂氏18〜22度でスピンダウンします。各サンプルが側面に飛び散るのではなく、インサートの下部にあることを確認してください。バイアルをオートサンプラートレイに入れ、セットごとにLC-MS-MS分析用の1マイクロリットルのサンプルを注入します。単一細胞の消化および標識効率は、キャリアのように直接アッセイされない場合がありますが、DO-MSソフトウェアは、消化および標識効率を推定するプロットを提供します。消化不良は、完全に切断された対応物に対する誤切断されたペプチドの強度の高い比によって示される。セットで考慮すべき別の要因は、各タンデム質量タグ付けチャネルにおけるレポーターイオン強度の中央値の欠落データの割合です。単一細胞が正常に調製されると、細胞あたりの欠損データおよびポジティブコントロールは、ネガティブコントロールサンプルよりもはるかに低くなります。LC-MS-MSサンプル調製中の慎重な液体の取り扱いは、ペプチドを最大限に回収するために重要です。ウェル当たり約100ピコグラム〜100ナノグラムの小さなサンプルを、同重体担体を用いたプロテオミクス分析用に調製することができる。SCoPE2は、一般的な試薬と市販の機器のみを使用して、世界中の研究者がシングルセルプロテオミクス測定にアクセスできるようにします。ロボットリキッドハンドリングによる手動処理または高スループット自動化に適しています。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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ここでは、さまざまな細胞タイプの細胞表面プロテオームの特性評価のためのプロテオミクスワークフローについて説明します。このワークフローには、細胞表面タンパク質の濃縮、その後のサンプル調製、LC-MS/MSプラットフォームを使用した分析、および専用ソフトウェアによるデータ解析が含まれます。...

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細胞外小胞のプロテオミクス分析におけるポリカーボネート超遠心チューブの再利用

ここでは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片の単離関心領域を用いた質量分析法に基づくプロテオミクス法を確立します。このプロトコールは、アーカイブされたホルマリン固定パラフィン包埋組織切片の特定の組織領域からのプロテオームを解析するために使用されます。...

選択した組織領域を用いた質量分析ベースのプロテオミクスのための合理化されたアプローチ

このプロトコルは、揮発性塩溶液洗浄、急速液体窒素急冷、凍結乾燥、および-8°C保存を組み合わせることにより、単一細胞質量分析(SCMS)用の細胞代謝産物を保存することを目的としています。これは、液体窒素の急冷が代謝産物プロファイルを維持するために不可欠である一方で、代謝の変化を防ぐために長期の冷蔵保管を最小限に抑える必要があることを示しています。...

シングルセル質量分析メタボロミクス研究のためのサンプル前処理:細胞洗浄、急冷、乾燥、保管の組み合わせ

このビデオでは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（MALDI -...

MALDIサンプル調製：超薄層法

学ぶSCoPE2法によるシングルセルプロテオミクス調製。質量分析で哺乳類細胞の数千種タンパク質を抗体なしで定量し、がん・免疫学研究における細胞内タンパク質発現の異質性を解明する手法です。

凍結熱分解と同重体担体を用いた質量分析のためのシングルセルプロテオミクス調製(英語)

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