Name: 脳からのアミロイド線維コアの生化学的浄化とプロテオミクス特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 学ぼう、アミロイド線維コアの生化学的浄化と質量分析によるプロテオミクス解析手法を。この方法はアルツハイマー病の診断と治療標的発見に重要な高純度アミロイドの分離を可能にします。

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この研究は、R.J.V.およびJ.N.S.に対するNIH助成金R01AG061865によって支援されました。著者らは、ノースウェスタン大学のヴァッサーとサヴァスの研究グループのメンバーに、思慮深い議論をしてくれたことに感謝している。また、Dr(複数可)にも心から感謝します。南カリフォルニア大学のAnsgar SeimerとRalf Langenは、彼らの重要なインプットのために。ノースウェスタン大学先端顕微鏡センターでのサンプル調製と陰性染色電子顕微鏡イメージングのファリダ・コラボワ博士に感謝します。

このプロトコルは、ヒトまたは脊椎動物の脳組織の使用を含む。すべての研究は、ノースウェスタン大学の承認された機関ガイドラインに準拠して実施されました。現在のワークフローは、APP−ノックイン(App NL−G−F/NL−G−F)マウス脳皮質および海馬脳領域抽出物11を用いて標準化されている。このプロトコルは、生後6〜9ヶ月のマウスからの脳抽出物に最適化されており、雄および雌の両方の動物からアミロイドを効果的に精製することができる。
注: 実験手順全体をよりよく理解するには、ワークフローの概略図について 図 1 を参照してください。
1. 組織採取とアミロイド精製
注:理想的には、アミロイド線維は、解剖したばかりの脳領域から単離されるべきである。しかし、この方法は、スナップまたはフラッシュ凍結した脳組織でもうまく機能します。以下は、後で使用するために保存するためのスナップ凍結脳組織の簡単な概要です。
<ol><li>脳組織の採取と保存:マウスの脳を解剖し、アミロイドを含む領域(皮質と海馬)を素早く採取し、液体窒素またはドライアイスアルコール浴でスナップ凍結します。 メモ:スナップ凍結は、組織の構成要素の構造的属性を保持するのに役立ちます。マウスをイソフルランおよび子宮頸部脱臼によって安楽死させる12、13。CO2は脳プロテオームの完全性を損なう可能性があるため、使用を避けることをお勧めします。</li>
	<li>解剖後、アミロイド抽出前のより効率的な均質化を促進するため、新鮮な組織を小さなブロック(例えば、5mm x 5mm)に切断して保存します。組織を滅菌極低温バイアルに移し、キャップを締め、急速に水没させる。</li>
	<li>組織を超低温条件(すなわち、-80°Cまたは液体窒素)で凍結させてください。抽出を数日後に行う場合は、組織を-20°Cで保存し、凍結および融解サイクルを避けてください。抽出と精製の準備ができたら、凍結組織を湿氷で解凍します。 注:組織と液体窒素を直接接触させると、組織やタンパク質に損傷を与える可能性があります。アルコール浴はチューブラベルから永久マーカーを除去することができることに注意してください。</li>
</ol>2. SDS不溶性物質の濃縮
メモ:特に明記されていない限り、氷上ですべての手順を実行し、4°Cで遠心分離機してください。このプロトコルで使用されるすべてのバッファーおよびソリューションの詳細は、 補足ファイル 1 に記載されています。化学品および機器の製造業者およびカタログ番号は、 材料表に記載されています。
<ol><li>まず、解剖したばかりの脳組織領域またはスナップ凍結(氷上で解凍)を、6〜8個のセラミックビーズと新たに調製した氷冷均質化緩衝液(0.25〜1gの湿組織塊に対して1mL)を含む2mLチューブに入れた。</li>
	<li>チューブをビーズミルホモジナイザーに移し、組織内容物を4000rpmで粉砕し、それぞれ30秒のサイクルを2サイクル、その間に30秒の間隔をあけます。 注:あるいは、電動スターラーまたはホモジナイザーシステムを使用して、組織を粉砕および均質化することができます。</li>
	<li>15 mL チューブ内の脳全組織ホモジネート 1 mL に 9 mL の氷冷ホモジナイズバッファーを加え、実験室用ワックスフィルムストリップで密封し、4 °C で一晩エンドツーエンド回転させて、堅牢な可溶化を確保します。 注:不要な大きな細胞破片や脂質を除去するには、翌朝、チューブを4°Cで800 x g で10分間回転させ、上清を新しいチューブに集めます。残りのペレットを2mLの氷冷ホモジナイズバッファーに再懸濁し、よく混合し、4°Cで10分間再びスピンし、2つの上清を結合する。</li>
	<li>固体スクロースを組織抽出物懸濁液に最終濃度1.2 Mになるようにゆっくりと加え、よく混合し、250,000 x g で4°Cで45分間遠心分離する。</li>
	<li>ピペットを使用して上清を慎重に取り除き、廃棄します。粉砕することにより1.9 Mスクロースを含む2 mLのホモジナイズバッファーにペレットを再懸濁し、続いて4°Cで45分間125,000 x g で遠心分離した。 メモ: バッファー容量は、前のステップから回収した材料の量に基づいて調整できます。一般に、このステップには10容量の均質化バッファー(V/V)が理想的です。</li>
	<li>ピペットを使用して上部の白色固体層を集め、それを新鮮なチューブに移し、気泡を導入せずに数回上下にピペッティングすることによって1mLの氷冷洗浄バッファーに可溶化する。</li>
	<li>最上層とは別に、ペレットはまたアミロイド線維で富化されている。より高い収率を得るには、2つの分数を組み合わせて続行します。ピペットを使用して真ん中の水層を慎重に取り出し、廃棄する。</li>
	<li>合わせた画分を8000 x g で4°Cで20分間遠心分離する。 上清を捨てる。</li>
	<li>洗浄したペレットに氷冷消化バッファー1mLを加え、蘇生させ、室温(RT)で3時間インキュベートした。</li>
	<li>8000 x g で4°Cで20分間遠心分離し、ピペットを用いて上清を除去した。</li>
	<li>消化したペレットを1mLの氷冷トリス緩衝液に2回再懸濁して洗浄する(ステップ2.8と同じ)。</li>
	<li>洗浄したペレットを、上下にピペッティングすることにより、1% SDSおよび1.3 Mスクロースを含む1 mLの可溶化緩衝液に再懸濁する。200,000 x g で 4 °C で 60 分間素早く遠心分離します。 注:アミロイド線維は洗剤および変性剤に対して高い耐性を有するが、洗剤に非常に長時間さらされると(1% SDS)、線維の完全性に影響を与えたり、強固に結合したタンパク質を除去したりして、その後の分析が損なわれる可能性がある。したがって、ペレットを再懸濁した直後に、遠心分離に進む。</li>
	<li>ペレットを保存し、50mMのトリス緩衝液(比1:0.3)を加えてスクロース濃度を1.3から1Mに下げ、200,000 x g で4°Cで45分間遠心分離して、残りの上清の量を増やします。</li>
	<li>2つのペレットを0.5% SDSおよびアミロイド精製用プールを含む100μLのトリス緩衝液に溶解する。目に見えるペレットは小さく、不透明でオフホワイトに見えます( 図2A参照)。</li>
</ol>3. アミロイド精製
注:2つのペレットを結合し、均一な溶液が得られるまでピペッティングによって可溶化し、アミロイド精製の以下のステップを続行する。
<ol><li>ペレット中に存在するアミロイドに富む材料の完全な可溶化のために、チューブを、20サイクルの間、中距離周波数で30秒ONおよび30秒OFFのために走る浴中超音波処理装置中の超音波によって生成される機械的剪断に晒す。</li>
	<li>直ちに材料を20,000 x g で4°Cで30分間遠心分離し、ペレットを500μLの0.5%SDS Tris緩衝液に再懸濁する。</li>
	<li>手順 3.1 を繰り返します。ステップ 3.2.合計5回の洗浄で4回。洗浄回数を増やして純度を向上させることができます。 注:超音波処理および洗浄ステップは、より高い濃度がフィブリルの構造、完全性、またはタンパク質組成に影響を与える可能性があるため、0.5% SDSで最適化されています。このステップでSDS濃度を上げることは推奨されません。</li>
	<li>最終遠心分離工程の後、ペレットを200μLの超純水で洗浄し、20,000 x g で4°Cで30分間遠心分離して、残りの洗剤を除去した。精製アミロイド線維を含む洗浄ペレットは、色が半透明に見え、時には見えにくい。</li>
	<li>精製アミロイド線維を含む最終ペレットを100μLの超純水に溶解する。下流処理のために直ちに次のステップに進むか、さらなる分析のためにフィブリル懸濁液を-20°Cで保存する。凍った場合は、沈殿を開始する前に氷上で解凍してください。</li>
</ol>4. メタノールクロロホルム沈殿
注:最終目標がタンパク質分析を実行することである場合は、脱塩して追加の非タンパク質性不純物を除去することをお勧めします。
<ol><li>精製した100 μLのアミロイド線維に400 μLのメタノールを1.5 mLチューブとボルテックスウェルに加える。</li>
	<li>チューブに100μLのクロロホルムを加え、よくボルテックスする。</li>
	<li>300μLの超純水とボルテックスを徹底的に加える。これにより、タンパク質沈殿のために混合物が曇ります。</li>
	<li>遠心分離機を 12,000 x g で RT で 2 分間。</li>
	<li>タンパク質フレークを含む界面層を乱すことなく、水層(すなわち、上部)を注意深く除去する。</li>
	<li>同じ量のメタノールを再度加え、RTで12,000 x g で2分間遠心分離します。</li>
	<li>ピペットを使用して上清を捨て、RTでペレットを風乾します。アミロイド画分は、過乾燥すると再溶解しにくい。</li>
</ol>5. トリプシン消化
<ol><li>ペレットを50 μLの塩酸グアニジン(GuHCl)バッファーに溶解する。氷冷水浴中で超音波処理し、必要に応じて95°Cで5分間加熱する。</li>
	<li>RTで45分から1時間かけてボルテックスを完全に溶かします。このステップの後、ペレットは見えなくなり、溶液は外観がはっきりと見えます。</li>
	<li>同じ量の0.2%界面活性剤溶液を加える。RTで60分間ボルテックスで可溶化する。このステップは、トリプシン酵素活性を増強する。</li>
	<li>500 mMのストック溶液から1 μLのトリス-2-カルボキシエチルホスフィン(TCEP)を加える。60分間インキュベートする。</li>
	<li>2 μLの500 mMヨードアセトアミド(IAA)を加え、暗所で20分間インキュベートする。</li>
	<li>5 μL の TCEP 溶液で IAA を 15 分間クエンチします。</li>
	<li>必要な量の50 mM重炭酸アンモニウム溶液をチューブに加え、グアニジン濃度を1.5 Mに下げます。</li>
	<li>チューブに1%界面活性剤溶液(1 μL/50 μgのタンパク質)を加えます。</li>
	<li>トリプシン(1 μg/100 μgのタンパク質)を加え、チューブ混合を37°Cで一晩放置する。</li>
</ol>6. ペプチドのクリーンアップ
<ol><li>翌朝、ギ酸を加えてpHを2.0に下げて消化ペプチド液を酸性化する。</li>
	<li>200 μL の 50% メタノール溶液を加えて 2 mL レシーバーチューブ内の C18 (n-オクタデシル) スピンカラムを活性化し、RT で 1500 x g で 2 分間スピンします。活性化ステップを繰り返します。</li>
	<li>C18カラム樹脂床に200 μLの平衡化バッファーを加えて平衡化し、同条件で2分間紡糸した。この手順を繰り返します。</li>
	<li>酸性化ペプチド溶液を C18 カラムにロードし、RT で 1500 x g で 2 分間遠心分離します。フロースルーを収集し、もう一度リロードします。2 番目のフロースルーを破棄します。</li>
	<li>ステップ6.3で行ったように、C18樹脂に結合したペプチドを洗浄バッファー2xで洗浄します。カラムの洗浄に同じ平衡化バッファーを使用します。</li>
	<li>溶出バッファーを 40 μL 加えてペプチドを溶出し、その後 RT で 1500 x g で 2 分間遠心分離します。溶出工程を 3 回繰り返して、回収したペプチドの収率を高めます。</li>
	<li>水溶液を蒸発させることにより速度真空濃縮器でペプチドを乾燥させる。乾燥ペレットは、MS分析の前に数週間-20°Cで保存することができます。</li>
</ol>7. ペプチド分析用の質量分析計の設置
メモ: MS パラメータについては、 補足ファイル 1 (ラボの以前の出版物から採用)14 を参照してください。
<ol><li>MS分析のためにペプチドサンプルをロードする前に、乾燥ペプチドペレットを20μLのサンプルローディングバッファーに溶解し、マイクロBCAを実行して回収ペプチドの濃度を定量する。</li>
	<li>溶解したペプチドをガラスバイアルに移し、3μg(マイクロBCAから定量)のペプチドをUPLCシステムオートサンプラーに負荷します。</li>
	<li>サンプルを通気トラップカラム(C18 HPLCカラム、0.075 mm x 20 mm)に流速250 nL/minでロードします。</li>
	<li>トラップカラムを分析カラム(0.075 μm x 500 mm)に沿って配置し、2000 Vのスプレー電圧をかけてエレクトロスプレーイオン化(ESI)源にエミッタチップを組み立てます。 注:この研究では、移動相が気相への高電圧イオン化を受けるESIが行われます。これにより作成されたスプレーは、加熱されたキャピラリーを介してMSの真空チャンバに送られます。真空下では、液滴の脱溶媒和およびイオンの放出は、熱および電圧の存在下で起こる。その後、イオンは、高電圧環境の存在下で質量分析器に向かって加速される。</li>
	<li>2時間の集録実行でサンプルを分析します。この研究は、最も強力なトップ20前駆体イオン選択パラダイムを有するデータ依存集録を用いて実施される。 注:データ依存の取得では、限られた数の前駆体ペプチドがMS1スキャンで検出され、MS2分析のために断片化が行われます。しかし、非常に豊富なAβペプチドは断片化のために省略され、それらの量の過小評価をもたらすため、動的排除はここで問題となる。</li>
	<li>Aβペプチドの絶対定量を行うには、標的MS/MS法を使用して同じサンプルをもう一度実行します。この研究のために、APPノックインマウスモデルのための様々な可能なトリプシンAβペプチドについてのすべてのm / z比の網羅的なリストが準備される( 補足表1を参照)。他の群は、利用可能なマウスモデルおよび目的のタンパク質から生成された可能性のあるペプチド(例えば、ADに対するAβ)に従って同様のリストを調製すべきである。 注:非常に豊富なペプチドの排除に対処するには、Aβトリプシンペプチドに対応する選択されたm / z値のリストを提供することによって、標的化アプローチを使用する。このアプローチは、Aβペプチドのデータ依存的な排除の問題に対処し、異なるモノマー(Aβ38、40、および42ペプチド)の絶対量を高分解能で定量することができる。</li>
	<li>質量分析計は、ペプチドサンプルのMSスペクトルを生成し、生データファイルをターゲットディレクトリに保存します。このファイルを使用して、確立された統計およびバイオインフォマティクスツールを使用してスペクトルマッチングを実行します。複数のオンラインおよびオフラインのデータベース検索および分析ツールが利用可能です。</li>
</ol>8. MSデータ解析
<ol><li>オフラインのRawconverterツール(http://www.fields.scripps.edu/rawconv/)を使用してMS1ファイルとMS2ファイルを抽出します。</li>
	<li>WebベースのMSデータ検索エンジンでデータの識別、定量化、および詳細な分析を実行します。本研究では、統合プロテオミクスパイプライン-IP2(ブルカー:http://www.integratedproteomics.com/)を用いた。 メモ:MaxQuant(https://www.maxquant.org/)など、他のいくつかのオンラインおよびオフラインMSデータ分析ツールが利用可能であり、使用することもできます。</li>
	<li>MS1 および MS2 ファイルをアップロードした後、更新されたマウスプロテオームデータベースを選択します。ここでは、ProLuCIdおよびSEQUESTアルゴリズム11を使用してペプチドを同定するために、追加のアプリノックイン特異的変異を含む更新されたマウスデータベースが選択される。</li>
	<li>IP2分析システムで、デフォルトのパラメータを選択し、実験要件に従って変更します。この研究では、前駆体について50ppm、断片について600ppmのペプチド質量耐性が使用されている(IP2で使用される他のパラメータについては 、補足ファイル1 を参照のこと)。 注:研究者は、実験目的に従って検索パラメータを変更することができます。例えば、翻訳後修飾を同定するために、種々のPTMについて差次修飾値(例えば、ユビキチン化、SUMOyl化、リン酸化)を加える。</li>
</ol>

<ol><li>Willbold, D., Strodel, B., Schröder, G. F., Hoyer, W., Heise, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-type+protein+aggregation+and+prion-like+properties+of+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids.</a> Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).</li>
<li>Rambaran, R. N., Serpell, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+fibrils%3A+abnormal+protein+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Amyloid fibrils: abnormal protein assembly.</a> Prion. 2 (3), 112-117 (2008).</li>
<li>Upadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+inclusion+bodies+and+defective+proteome+hubs+in+neurodegenerative+disease%3A+New+clues%2C+new+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22The+Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges.</a> The Neuroscientist. , (2021).</li>
<li>Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprecipitation+of+amyloid+fibrils+by+the+use+of+an+antibody+that+recognizes+a+generic+epitope+common+to+amyloid+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils.</a> PLOS ONE. 9 (8), 105433(2014).</li>
<li>Kourelis, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomic+atlas+of+cardiac+amyloid+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22JACC%3A+CardioOncology%22%5BJournal%5D)">A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques.</a> JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).</li>
<li>Mangione, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+accuracy+of+proteomic+typing+by+decellularisation+of+amyloid+tissue+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies.</a> Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).</li>
<li>Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+brain+A%CE%B2+heterogeneity+through+targeted+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Unveiling brain Aβ heterogeneity through targeted proteomic analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).</li>
<li>Roher, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+toxicity+of+A%CE%B2-%281-42%29+dimer+derived+from+neuritic+and+vascular+amyloid+deposits+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Morphology and toxicity of Aβ-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).</li>
<li>Lu, J. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+%CE%B2-amyloid+fibrils+in+Alzheimer%27s+disease+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of β-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue.</a> Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).</li>
<li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-state+NMR+studies+of+amyloid+fibril+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).</li>
<li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+App+knock-in+mouse+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).</li>
<li>Meyerhoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+mouse+brain+into+functionally+and+anatomically+different+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941(2021).</li>
<li>Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpijker%2C+S+%22Neuroproteomics.+Neuromethods%22">Neuroproteomics. Neuromethods</a>. Li, K. 57, Humana Press. Totowa, NJ. (2011).</li>
<li>Hark, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulse-chase+proteomics+of+the+App+knockin+mouse+models+of+Alzheimer%27s+disease+reveals+that+synaptic+dysfunction+originates+in+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals.</a> Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+intercellular+spreading+of+protein+misfolding+mediated+by+viral+ligand-receptor+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 5739(2021).</li>
<li>Toyama, B. H., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+structure%3A+conformational+diversity+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Amyloid structure: conformational diversity and consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).</li>
<li>Sundaria, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+%26+imperfect+ageing%3A+Technological+limitations+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration & imperfect ageing: Technological limitations and challenges.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574(2021).</li>
<li>Cendrowska, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+complexity+of+amyloid+polymorphism+using+gold+nanoparticles+and+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).</li>
<li>Seuring, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+fibril+polymorphism%3A+almost+identical+on+the+atomic+level%2C+mesoscopically+very+different%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).</li>
<li>Close, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+basis+of+amyloid+fibril+polymorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Physical basis of amyloid fibril polymorphism.</a> Nature Communications. 9 (1), 699(2018).</li>
<li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+polymorphism%3A+Structural+basis+and+neurobiological+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance.</a> Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).</li>
<li>Konstantoulea, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotypic+Amyloid+%CE%B2+interactions+facilitate+amyloid+assembly+and+modify+amyloid+structure%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Heterotypic Amyloid β interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure.</a> The EMBO Journal. 41, 108591(2022).</li>
<li>Hondius, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+identifies+new+markers+associated+with+capillary+cerebral+amyloid+angiopathy+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).</li>
<li>Luo, J., Wärmländer, S. K., Gräslund, A., Abrahams, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-interactions+between+the+Alzheimer+disease+amyloid-%CE%B2+peptide+and+other+amyloid+proteins%3A+a+further+aspect+of+the+amyloid+cascade+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-β peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).</li>
<li>Hosp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+proteomic+profiling+of+Huntington%27s+disease+inclusions+reveals+widespread+loss+of+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function.</a> Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).</li>
<li>Wallace, E. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible%2C+specific%2C+active+aggregates+of+endogenous+proteins+assemble+upon+heat+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress.</a> Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).</li>
<li>Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+disordered+proteome+of+human+membrane-less+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles.</a> Proteomics. 18 (5-6), 1700193(2018).</li>
<li>Kepchia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+proteins+aggregate+in+mild+cognitive+impairment+and+Alzheimer%27s+disease+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain.</a> Alzheimer's Research & Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).</li>
<li>Espay, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+protein+aggregation+as+pathogenic+in+sporadic+Parkinson+and+Alzheimer+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases.</a> Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).</li>
<li>Fändrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+understanding+Alzheimer%27s+%CE%B2-amyloid+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recent progress in understanding Alzheimer's β-amyloid structures.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).</li>
<li>Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoSIMS+observations+of+mouse+retinal+cells+reveal+strict+metabolic+controls+on+nitrogen+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).</li>
<li>Michno, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+spatial+A%CE%B2+aggregation+dynamics+in+evolving+Alzheimer%27s+disease+pathology+by+imaging+stable+isotope+labeling+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Following spatial Aβ aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li>
<li>Toyama, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+long-lived+proteins+reveals+exceptional+stability+of+essential+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures.</a> Cell. 154 (5), 971-982 (2013).</li>
<li>Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+mitochondrial+cristae+proteins+in+mouse+heart+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain.</a> Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193(2021).</li>
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著者らには開示するものは何もありません。

アミロイド構造と組成の明確な理解を発展させることは、AD脳組織から精製された線維を抽出する際の生物学的複雑さと実験上の制限のために、構造生物学者および生化学者にとって挑戦的である16,17。アミロイド線維は分子レベルで多型であり、様々な長さおよび複雑さの不均一な集団を示す18、19。それらの生物学的特徴および病理学的関連性をよりよく理解するためには、死後ヒトおよびADマウスの脳組織から得られた多形アミロイド線維の組成の網羅的な特徴付けが必要である20,21。タンパク質の大きなサブセットはAβ42と直接相互作用するが、他のものは大きな線維構造またはタンパク質複合体を形成する傾向を有し得る22、23、<sup class="...

アミロイドは、タンパク質の多様なパネルに見られる非常に安定した超分子配列であり、そのうちのいくつかは病理学的変化をもたらす1。細胞内または細胞外のアミロイド凝集体の蓄積は、いくつかの神経変性疾患において観察される2。アミロイド凝集体は不均一であり、多数のタンパク質および脂質で富化されている3。近年、アミロイドプロテオームへの関心は、基礎および翻訳神経科学者の間で大きな関心を生み出している。マウスおよび死後のヒト脳組織からアミロイド凝集体を抽出および精製するために、いくつかの方法が開発されている。レーザー捕捉マイクロダイセクション、免疫沈降、脱細胞化、およびアミロイド凝集体の生化学的単離は、アミロイドプラーク、線維、およびオリゴマーを抽出および精製するために広く使用されている方法である4,5,6,7。これらの研究の多くは、半定量的MSを使用して、これらの密に充填された線維性沈着物のタンパク質組成を決定することに焦点を当てている。しかし、利用可能な結果は一貫性がなく、以前に報告された驚くほど多数の共精製タンパク質は解釈が困難です。
ADおよびADマウスモデル脳におけるアミロイドコアプロテオームを記述する既存の文献の主な制限は、精製された材料が管理不能な数の共精製タンパク質を含むことである。この方法の全体的な目標は、この制限を克服し、アミロイド線維コアを単離するための堅牢な生化学的精製を開発することです。この戦略は、死後ADヒトおよびマウス脳組織からのSDS不溶性富化アミロイド画分の単離のために、先に記載したスクロース密度勾配超遠心ベースの生化学的方法を採用する8、9。この方法は既存の文献に基づいていますが、超音波処理とSDS洗浄をさらに進めて、緩く結合したアミロイド関連タンパク質の大部分を除去し、高度に精製されたアミロイド線維の単離につながります(図1)。このプロトコールによって精製された線維は、脳抽出物から単離されたアミロイド線維の構造研究において頻繁に遭遇するいくつかの既存の課題を克服する。透過型電子顕微鏡(TEM)によるこれらのフィブリルの可視化は、精製された材料の完全性および純度を確認する(図2)。この研究では、単離されたフィブリルを可溶化し、トリプシンでペプチドに消化し、ラベルフリーMS分析により、フィブリルコアを形成するタンパク質の同一性を容易に明らかにすることができる。特に、これらのタンパク質のいくつかは、非膜結合細胞小器官において超分子集合体を形成する固有の傾向を有する。さらに、アミロイドβ(Aβ)線維の分析で同定されたタンパク質の多くは、他の神経変性疾患とも関連しており、これらのタンパク質が複数のプロテインオパチーにおいて重要な役割を果たしている可能性があることが示唆されている。
このSDS /超音波処理方法は、フィブリルコアの構造を変更または破壊する可能性は低いです。精製された材料は、幅広いトップダウンおよびボトムアッププロテオーム分析アプローチや、化学架橋や水素 - 重水素交換などの追加のMSベースの構造解析戦略にも適しています。この方法を用いた全体的な回収率は比較的高く、したがって、精製された材料のマイクログラム〜ミリグラムを必要とする詳細な構造研究に適している。精製された材料は、クライオEMおよび原子間力顕微鏡を用いた構造研究にも適している。このプロトコールは、哺乳動物の安定同位体標識と組み合わせて、アミロイド構造10の固体核磁気共鳴(NMR)研究を促進することができる。

<table><tbody><tr><td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC カラム 0.075 mm x 20&nbsp;mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>164535</td><td>他のメーカーの代替機器、化学薬品、抗体を使用できます</td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>抗アミロイドベータ (1-16) 6E10 抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td>803001</td><td></td></tr><tr><td>抗アミロイドベータ (17-24) 4G8 抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td>800701</td><td></td></tr><tr><td>抗アミロイドベータ (N 末端 82E1)抗体</td><td>IBL America</td><td>10323</td><td></td></tr><tr><td>抗アミロイド線維LOC抗体</td><td>&nbsp;EMD Millipore</td><td>AB2287</td><td></td></tr><tr><td>BCAキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Pico Plus</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp;C1016</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>Σ-アルドリッチ</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>コンプリート&nbsp;プロテアーゼ阻害剤</td>カクテル <td>Sigma-Aldrich</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>グアニジン塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>HyperSep C18 カートリッジ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>60108-302</td><td></td></tr><tr><td>統合プロテオミクスパイプライン -IP2の&nbsp;</td><td>http://www.integratedproteomics.com/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ヨードアセトアミド(IAA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>K54組織均質化システムモーター</td><td>コールパー</td><td>マーGlas-Col 099C</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>https://www.maxquant.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Micro BCAキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Nanoviper 75 &mu;メートル×50&nbsp;cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>164942</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K 超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>BR-8101P-E</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Tribrid質量分析計</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td><td></td></tr><tr><td>Pierce C18 スピンカラム</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89870</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 組織ホモジナイザー</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000062-PEVO0-A</td><td></td></tr><tr><td>ProteaseMAX(TM) 界面活性剤 トリプシンエンハンサー</td><td>Promega</td><td>V2072</td><td></td></tr><tr><td>RawConverter</td><td>http://www.fields.scripps.edu/rawconv/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>VWR</td><td>97064-646</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>74255</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R 微量遠心分離機</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td>75002446</tr><tr><td>速真空濃縮器</td><td>Labconco</td><td>7315021</td><td></td></tr><tr><td>Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15568025</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン ゴールドマス spec grade</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td></td></tr><tr><td>UltiMate 3000 RSLCnano System</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td>ULTIM3000RSLCNANO</tr></tbody></table>

脳からのアミロイド線維コアの生化学的浄化とプロテオミクス特性評価

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

タンパク質性原線維含有物は、複数の神経変性疾患の重要な病理学的特徴である。アルツハイマー病(AD)の初期段階では、アミロイドβペプチドは細胞外空間でプロトフィブリルを形成し、徐々に成長し、大きなアミロイドプラークに成熟する種子として作用する。この基本的な理解にもかかわらず、脳内のアミロイド線維構造、組成、および沈着パターンに関する現在の知識は限られている。1つの大きな障壁は、高度に精製されたアミロイド線維を脳抽出物から単離することができないことであった。アフィニティー精製およびレーザー捕捉マイクロダイセクションベースのアプローチは、以前はアミロイドを単離するために使用されてきましたが、回収できる少量の材料によって制限されています。この新規で堅牢なプロトコルは、スクロース密度勾配超遠心および超音波によるドデシル硫酸ナトリウム(SDS)可溶化を用いたアミロイドプラークコアの生化学的精製を記述し、AD患者およびADモデル脳組織から高純度の線維を生じる。精製された材料の質量分析(MS)ベースのボトムアッププロテオーム分析は、アミロイド線維のほぼすべての一次タンパク質成分を同定するための堅牢な戦略を表しています。アミロイドコロナエのタンパク質に関する以前のプロテオミクス研究は、予想外に大きく、機能的に多様なタンパク質の集合体を明らかにした。注目すべきことに、精製戦略を精緻化した後、共精製タンパク質の数は10倍以上減少し、単離されたSDS不溶性物質の高純度を示す。陰性染色および免疫金電子顕微鏡観察により、これらの調製物の純度の確認が可能となった。アミロイド封入物へのこれらのタンパク質の沈着に寄与する空間的および生物学的属性を理解するためには、さらなる研究が必要である。まとめると、この分析戦略はアミロイド生物学の理解を深めるのに良い位置にあります。

ここで、改変スクロース密度勾配超遠心精製法を用いたアミロイド線維の単離精製の詳細な方法をまとめた( 図1参照)。この方法の革新は、非常に緻密で清潔な線維と共精製するアミロイド線維から多くの緩やかに関連するタンパク質を除去するSDS可溶化が続く水浴超音波処理システムを使用した超音波ベースの洗浄のステップを含めることです。超音波処理ステップは、高い剪断力を生成し、線維を攪拌し、疎水性力を緩め、SDS可溶性緩く関連するタンパク質をSDS洗浄バッファーに放出する。次に、少量の高純度アミロイド線維コアが回収される。 図2Aに示すように、最初は不透明に見える(おそらく不純物による)目に見えるペレットは、濃縮後に見ることができます。しかし、超音波処理と複数のSDS洗浄に続いて、ペレットは半透明になり、ほとんど見えません。SDS可溶性画分と比較した精製アミロイドの代表的なコンゴレッド染色は、アミロイド線維の富化を文書化する(図2B)。コンゴ赤色染色は、異なる画分のアミロイド物...

質量分析ベースのプロテオミクス分析によるこの生化学的精製方法は、アミロイド線維コアの堅牢な特性評価を容易にし、アルツハイマー病を予防するための標的の同定を加速させる可能性がある。

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

アミロイドプラークは、アルツハイマー病の診断に必要です.しかし、それだけでは不十分です。この事実にもかかわらず、彼らは部分的に彼らの内容を特徴付ける際の課題のために謎めいたままです。当社のプロトコルは、アミロイド線維を高純度で単離するのに非常に効率的であり、構造および組成の細部を理解するのに非常に適している。アミロイドプラークのタンパク質含有量を知ることは、それらの蓄積を遅らせ、妨害し、または防止する可能性のある治療介入の標的を特定するのに役立つ可能性がある。したがって、疾患発症を遅らせる。この方法は、変性した脳組織からタンパク質沈着物を抽出するのによく適しており、異なる他のタンパク質経路におけるタンパク質凝集体である。まず、解剖またはスナップ凍結したばかりの脳組織領域を、新たに調製した氷冷均質化バッファーに6〜8個のセラミックビーズを含む2ミリリットルのチューブに入れます。次いで、ビーズミルホモジナイザーを用いて、30秒間のオンおよびオフパルスの2サイクルで4,000rpmで組織を粉砕する。次に、1ミリリットルの脳組織ホモジネートと15ミリリットルのチューブに9ミリリットルの氷冷ホモジナイゼーションバッファーを加え、実験室用ワックスフィルムストリップでシールします。堅牢な可溶化を確実にするために、チューブを摂氏4度で一晩回転させてください。翌日、固体スクロースを組織抽出物懸濁液に終濃度1.2モルとなるように添加する。よく混合し、遠心分離機は摂氏4度で45分間250,000 x gであった。上清を捨てた後、ペレットを粉砕して1.9モルのスクロースを含む2ミリリットルの均質化緩衝液に再懸濁し、摂氏4度で125,000 x gで45分間遠心分離する。遠心分離後、上部の白色固体層を新鮮なチューブに移し、数回上下にふれあげて1ミリリットルの氷冷洗浄バッファーを可溶化する。ペレットはまたアミロイド線維で富んでいるので、水性中間層を捨て、より高い収率のためにペレットを最上層と組み合わせる。結合画分を8, 000 x gで摂氏4度で20分間遠心分離する。上清を捨てた後、ペレットを1ミリリットルの氷冷消化バッファーに再懸濁し、ボルテックス上で室温で3時間インキュベートする。試料を再度遠心分離し、次いでペレットを1ミリリットルの氷冷トリス緩衝液中で2回洗浄し、再度遠心分離する。2回目の洗浄後、ペレットを上下にピペッティングして1ミリリットルの可溶化バッファーに再懸濁し、チューブを摂氏4度で60分間200,000 x gで素早く遠心分離します。ペレットを保存し、次いで、上清に50ミリモルのトリス緩衝液を加えてスクロース濃度を1.3モルから1モルに減少させる。上清を再び遠心分離し、次いで、0.5%SDSを含むペレットおよび100マイクロリットルのトリス緩衝液の両方を溶解する。アミロイド精製のために、浴中超音波処理装置中で超音波を使用してアミロイドが豊富なペレットを20サイクル可溶化し、次いで直ちに材料を20, 000 x gで4°Cで30分間遠心分離する。ペレットを500マイクロリットルの0.5%SDSトリス緩衝液に再懸濁し、洗浄をさらに4回繰り返し、最終遠心分離工程の後、ペレットを200マイクロリットルの超純水で洗浄し、20,000 x gを摂氏4度で30分間遠心分離して、残りの洗剤を除去した。精製アミロイド線維を含む最終ペレットを100マイクロリットルの超純水に溶解する。精製された100マイクロリットルのアミロイド線維を400マイクロリットルのメタノールおよびボルテックスウェルに溶解する。その後、100マイクロリットルのクロロホルムとボルテックスを再び混ぜる。次に、300マイクロリットルの超純水とボルテックスを徹底的に加えます。室温で12, 000 x gで2分間遠心分離した後、タンパク質フレークを含む界面層を乱すことなく上部の水層を注意深く除去し、同じ量のメタノールを再度加える。遠心分離を繰り返し、上清を捨て、ペレットを風乾する。消化のために、ペレットを50マイクロリットルの塩酸グアニジン緩衝液に溶解し、氷冷水浴中で超音波処理する。次いで、室温で45分〜1時間十分にボルテックスし、50マイクロリットルの0.2%界面活性剤溶液を加え、さらに60分間ボルテックスを再度ボルテックスする。次に、1マイクロリットルの500ミリモルTCEPを加え、60分間インキュベートする。次いで、2マイクロリットルの500ミリモルヨードアセトアミドを加え、暗所で20分間インキュベートする。インキュベーション後、ヨードアセトアミドを5マイクロリットルのTCEP溶液で15分間クエンチする。次に、必要量の50ミリモルの重炭酸アンモニウム溶液をチューブに加え、グアニジン濃度を1.5モルに減らす。また、チューブに1%界面活性剤溶液を加える。その後、トリプシンを加え、チューブを摂氏37度で一晩混合したままにします。翌日、消化ペプチド溶液にギ酸を加えてpHを2.0に下げ、200マイクロリットルの50%メタノール溶液を加え、室温で1500 x gで2分間回転させてC18スピンカラムを活性化します。次に、200マイクロリットルの平衡化バッファーを加えてC18カラム樹脂床を平衡化し、再度2分間紡糸する。平衡化後、酸性化ペプチド溶液をC18カラムにロードし、室温で1500 x gで2分間遠心分離します。フローをリロードし、カラムを回転させて、2 番目のフロースルーを破棄します。次いで、C18樹脂に結合したペプチドを洗浄バッファーで2回洗浄する。40マイクロリットルの溶出バッファーを加え、カラムを遠心分離してペプチドを3回溶出する。水溶液を蒸発させることにより速度真空濃縮器でペプチドを乾燥させる。乾燥ペレットは、MS分析の前に数週間摂氏20度で保存することができます。精製アミロイドのコンゴレッド染色は、SDS可溶性画分と比較したアミロイド線維の濃縮を文書化する。SDS可溶性画分にはアミロイドの存在は示さなかった。精製された線維の構造は、ほぼ純粋なアミロイド線維の存在を確認した。また、イムノゴールド標識はアミロイドβ-42ペプチドの存在を確認した。抗アミロイドβ−42および抗フィブリル抗体を用いた染色は、フィブリル中のアミロイドβ−42ペプチドの相対的存在量を示した。精製アミロイド画分は約250タンパク質の存在を示したが、超音波処理およびSDS洗浄前に収集された画分は2,500以上のタンパク質を含んでいた。フィブリルコアは、非膜結合オルガネラおよび超分子複合体に関連するタンパク質の濃縮を示した。アミロイドは存在量の少ない種であり、おそらく脳組織のミリグラムあたり数ピコグラムから数マイクログラムである。したがって、層、パレットを拾うとき、または上澄み液を捨てるときは、非常に注意する必要があります。この技術の開発により、初期のアミロイド種子に関連するタンパク質をより自信を持って同定し、その構造を特徴付け、治療介入のためにそれらを標的とすることができるようになりました。したがって、この致命的な病気の発症を予防する。

biochemical-purification-proteomic-characterization-amyloid-fibril

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は明らかに人間の皮質ホモジネート、SDS -...

ヒト皮質組織におけるAβ多量体のSDS-PAGE/Immunoblotの検出は、抗原エピトープの検索を使用してホモジネート

APPの細胞内ドメイン（AICD）の大規模な精製のための方法が記載されている。我々はまた、誘導する方法を説明します...

アミロイド前駆体タンパク質細胞内ドメインの精製と集約

このビデオでは、密度勾配遠心分離と非アミロイドタンパク質の消化を使用して、マウス脳組織抽出物からアミロイド線維を分離するプロトコルを示しています。...

脳組織抽出物からのアミロイド線維の単離

人間とマウスの脳組織のために尿素/チオ尿素/ SDS緩衝液を使用した一般的なタンパク質抽出プロトコルを可能にする2D-DIGEとミニ2DEのイムノブロット法によるそれに続くキャラクタライゼーションによるタンパク質のINDENTIFICATION。この方法は、人間の生検および実験モデルから、より再現性と信頼性の高い結果を得るために1を可能にします。...

コンセンサス脳由来のタンパク質、2D-DIGEとミニ2DEイムノ両方を使用して、ヒトおよびマウスの脳プロテオーム研究のための抽出プロトコール

ここでは、死後のヒト脳組織からますます不溶性/凝集したα-シヌクレイン（α-syn）を単離するためのプロトコルを提示します。界面活性剤強度が増大するバッファーと高速超遠心分離技術の利用により、疾患組織および非疾患組織におけるα-syn凝集の変動特性を調べることができます。...

パーキンソン脳からの可溶性および不溶性のα-シヌクレインの逐次抽出

ここで我々は、オリゴマー形成が可能な高純度のアミロイドベータ42（Aβ42）とアミロイドベータ40（Aβ40）のペプチドを、もたらす仕立てHPLC精製プロトコルを報告しています。アミロイドベータは、アルツハイマー病に関与する高度に凝集しやすい、疎水性ペプチドです。ペプチドのアミロイド形成性の性質は、その精製の挑戦になります。...

オリゴマー形成可能な高純度のアミロイドベータ42とアミロイドベータ40ペプチドを、利回りテーラードHPLC精製プロトコル

ひと死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の強化のため、省略された分別のプロトコルを説明します。...

人間の死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化に基づくイメージング質量分析法 (MALDI 分子研) 分子イメージングは、生体試料中の複数検体の同時マッピングをことができます。ここでは、アルツハイマー病、脳アミロイドアンギオパチー サンプル MALDI IMS を使用しての脳組織のアミロイド β タンパク質の可視化と検出のためのプロトコルを提案する.

マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量顕微鏡を用いたひと脳のアミロイド β の堆積物の可視化

フィブリン凝固組織に及ぼす β-アミロイドを分析する個別にまたは組み合わせて使用することができます 2...

Β アミロイド誘起分光と電子顕微鏡によるフィブリン血栓構造異常の解析

ここで提供されるプロトコルは、異なる組織および脳の様々な領域から分離されたミトコンドリアを有する異なるペプチドおよびタンパク質のネイティブ形態、プレフィブリル、および成熟したアミロイド線維の相互作用を調るためのプロトコルである。...

アミロイドフィブリルスによる脳ミトコンドリアの相互作用と膜透過性

本研究は、フィラメントの組み立て、凝集、翻訳後修飾に焦点を当て、GFAPおよびその病原変異を生化学的に特徴づける実験的方法を示しています。高純度のGFAPタンパク質を解析し、アレクサンダー病のメカニズムに関する洞察が明らかになり、潜在的な治療標的の研究やGFAP変異および関連疾患の理解の枠組みとなり得ました。...

グリア線維酸性タンパク質およびその疾患関連変異体の生化学的解析における実験的アプローチ

学ぼう、アミロイド線維コアの生化学的浄化と質量分析によるプロテオミクス解析手法を。この方法はアルツハイマー病の診断と治療標的発見に重要な高純度アミロイドの分離を可能にします。

脳からのアミロイド線維コアの生化学的浄化とプロテオミクス特性評価

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