Name: Sf9精製超加工キネシン-3ファミリーモーターの1分子解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 学ぶSf9バキュロウイルス系を用いたキネシン-3ファミリーモーターKIF1Aの精製法と1分子モーター運動アッセイ。この手法は、細胞内輸送メカニズムの解明と他の細胞骨格タンパク質研究への応用に有用です。

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V.S.とP.S.は、Kristen J. Verhey教授(ミシガン大学、米国ミシガン州アナーバー)とRoop Mallik教授(インド工科大学ボンベイ校(IITB)、ムンバイ、インド)の研究を通して無条件の支援に感謝します。P.S. シヴァプリヤ・キルバカラン博士のプロジェクト全体を通しての支援に感謝します。V.S.は、DBT(助成金番号:BT/PR15214/BRB/10/1449/2015およびBT/RLF/再入国/45/2015)およびDST-SERB(助成金番号:ECR/2016/000913)を通じた資金提供を認めています。P.K.Nは、ICMRの資金提供を認めています(助成金番号5/13/13/2019/NCD-III)。P.S. は DST からの資金提供を認めます (助成金番号: SR/WOS-A/LS-73/2017)。D.J.SはIITガンディナガルからのフェローシップを認めています。

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</ol>

著者は、宣言する競合する金銭的利益を持っていません。

Sf9-バキュロウイルス発現システムは、ハイスループットタンパク質生産のための最も用途が広く成功した方法の1つです19、36、37。Sf9細胞の翻訳後修飾能は、哺乳動物系15と非常に同等である。このシステムを使用することのかなりの欠点は、それが遅く、汚染に敏感であることです。最も重要なステップの1つは、Sf9細胞での効率的な感染と発現の成功であり、汚染のないSf9細胞の適切な取り扱いと維持が必要です。このシステムには、専用のほこりのないスペースと、温度制御されたインキュベーターやシェーカーなどの機器が必要です。不規則な細胞培養の実践と生い茂った培養の使用は、感染不良、成長の鈍化、および重大な細胞死をもたらします。
Sf9細胞で発現するタンパク質のFLAGタグ精製にはいくつかの利点があります。まず、Sf9細胞を効率的に溶解して、ほとんどのタンパク質を活...

非常に混雑した細胞環境は、運命のタンパク質や分子を選別する際に多くの課題をもたらします。細胞質内の分子の組織化と時空間分布のこの激しい作業負荷は、分子モーターと細胞骨格トラックによって促進されます。分子モーターは、ATPなどのエネルギー通貨を加水分解し、運動や力の生成中にそのエネルギーを利用する酵素です1。アミノ酸配列の類似性に基づいて、キネシンは14のファミリーにグループ化され、この類似性にもかかわらず、各モーターは細胞の機能に一意に貢献します。キネシン3ファミリーモーターは、5つのサブファミリー(KIF1、KIF13、KIF14、KIF16、KIF28)2からなる最大のモーターの1つであり、小胞輸送、シグナル伝達、有糸分裂、核移動、発生など、多様な細胞および生理学的機能に関連しています3,4,5。キネシン-3輸送機能の障害は、多くの神経変性疾患、発達障害、および癌疾患に関与しています6,7,8,9。
最近の研究では、キネシン-3モーターはモノマーであるが、貨物誘起二量体化を受け、従来のキネシン10,11,12,13と比較して高速で超加工的な運動性をもたらすことが実証されている。それらの生化学的および生物物理学的特性評価には、大量の精製された活性タンパク質が必要です。しかし、原核生物発現系におけるそれらの産生は、おそらく不適合なタンパク質合成、折り畳みおよび修飾機構のために、不活性または凝集したモーターをもたらした14,15,16,17,18。このような制限を回避し、収量を増やすために、ここでは、これらのモーターを発現および精製するための堅牢なSf9バキュロウイルス発現システムを確立しました。
バキュロウイルス発現システムは、ハイスループット真核生物組換えタンパク質発現のための宿主系としてSf9昆虫細胞株を使用する19,20。バキュロウイルスは、異種遺伝子発現と可溶性組換えタンパク質の産生を補助する強力なポリヘドリンプロモーターを持っています17。その費用対効果、取り扱いが安全で、かつ大量の活性タンパク質発現のために、それは強力なツール21となっている。目的のタンパク質を発現させるための重要なステップは、組換えバクミドを生成することです。市販のバクミド生成キットは高価であり、より多くのサンプルを扱うため、キネシン-3モーターをバクミドに大小両方のインサートするための社内プロトコルを開発しました。Sf9精製されたキネシン-3モーターを使用して、全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を使用してin vitroの単一分子およびマルチモーター微小管滑走特性を特徴付けました。モーターは、3タンデム蛍光分子(3xmCit)でC末端にタグ付けされており、シグナルを強化し、光退色を低減します。TIRFイメージングは、シグナル対ノイズ比の増加、光毒性の低減、カバーガラスに近い非常に小さな領域の選択的イメージングにより、in vivoおよびin vitroで単一分子レベルでタンパク質動態を視覚化するために広く使用されています。
本研究では、Sf9バキュロウイルス発現系を用いたキネシン3モーターの精製と、TIRF顕微鏡を用いたモーターの in vitro 単一分子イメージングおよびマルチモーター滑空解析について説明します。全体として、この研究は、Sf9精製モーターの運動特性が哺乳類細胞溶解物から調製されたモーターの運動特性と同一であることを示しています。したがって、Sf9-バキュロウイルスシステムは、目的のモータータンパク質を発現および精製するように適応できると考えています。

<table><tbody><tr><td>Sf9 培養およびトランスフェクション材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗FLAG M2 アフィニティー</td><td>バイオレジェン</td><td>ド 651502</td><td>タンパク質精製用</td></tr><tr><td>アプロチニン</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td>タンパク質精製用</td></tr><tr><td>Cellfectin</td><td>Invitrogen</td><td>10362100</td><td>Sf9 トランスフェクション用</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D5545</td><td>運動アッセイおよびタンパク質精製用</td></tr><tr><td>FLAGペプチド</td><td>Sigma</td><td>F3290</td><td>タンパク質精製用</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマ</td><td>G5516</td><td>タンパク質を凍結するには</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Sf9溶解バッファー用</td></tr><tr><td>IGEPAL CA 630</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td>Sf9溶解バッファー用</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>バッファー調製用</td></tr><tr><td>ロイペプチン</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>タンパク質精製用</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td>バッファー調製用</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>溶解バッファー調製用</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>タンパク質精製用</td></tr><tr><td>Sf9細胞</td><td>トーマス・プカディル博士(インド科学研究所)からの親切な贈り物Education and Research、プネー、インド)。</td><td></td><td>バクロビルの発現およびタンパク質精製用</td></tr><tr><td>Sf9培養ボトル</td><td>Thermo Scientific</td><td>4115-0125</td><td>懸濁培養用</td></tr><tr><td>Sf-900/SFM 培地 (1X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>10902-096 -500ml</td><td>Sf9細胞の培養用</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>シグマ</td><td>S1888</td><td>Sf9細胞の溶解緩衝液の調製</td></tr><tr><td>Unsupplemented Grace's media</td><td>Thermo Scientific 11595030</td><td>-500ml</td><td>Sf9 トランスフェクション</td></tr><tr><td>Mirotubule 重合および単一分子アッセイ用 materails</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A2647</td><td>運動性および滑走アッセイ用</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>ブロッキング運動性チャンバー</td></tr>用 <tr><td>カタラーゼ</td><td>ΣC9322</td><td></td><td>運動性および滑走アッセイ</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td>ローダミン</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>3777</td><td>バッファー調製用</td></tr><tr><td>グルコース</td><td></td><td>ΣG7021</td><td>運動性および滑走アッセイ用</td></tr><tr><td>グルコースオキシダーゼ</td><td></td><td>ΣG2133</td><td>運動性および滑走アッセイ用</td></tr><tr><td>GTP</td><td></td><td>ΣG8877</td><td>微小管重合用</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P1767</td><td>PIPESバッファーの調製 pH 6.9</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P6757</td><td>運動性および滑走アッセイバッファーの調製</td></tr><tr><td>用微小管滑走アッセイ 材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>26G&nbsp; 針</td><td>Dispovan</td><td></td><td>微小管のせん断用</td></tr><tr><td>カゼイン</td><td>Σ</td><td>C3400</td><td>微小管滑走アッセイ</td></tr><tr><td>GFPナノボディ</td><td>Sivaraj Sivaramakrishnan博士(ミネソタ大学、米国)からのギフトカバー</td><td></td><td>スリップへのモーターの取り付け用</td></tr><tr><td>Rhodamine</td><td>Thermo Scientific</td><td>46406</td><td>ラベリングチューブの調製用チューブリン</td></tr><tr><td><ストロング>顕微鏡およびその他の機器</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5ml、1.5および2mlの微量遠心チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>Sf9の培養と精製</td></tr><tr><td>10ml&nbsp; 使い捨て滅菌ピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>Sf9の培養と精製</td></tr><tr><td>10ul、200ul、1mlのマイクロピペットチップ</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>Sf9の培養と精製</td></tr><tr><td>15mlのコンカルチューブ</td> エ<td>ッペンドルフ</td><td></td><td>Sf9の培養と精製</td></tr><tr><td>35mm細胞培養ディッシュ</td><td>コール・パーマー</td><td>15179-39</td><td>Sf9培養</td></tr><tr><td>用バランス</td><td>Sartorious</td><td></td><td>0.01g-300g</td></tr><tr><td>卓上型オービアル振盪インキュベーター</td><td>REMI</td><td></td><td>Sf9 suspenculture at 28oC</td></tr><tr><td>カメラ</td><td>EMCCD Andor iXon Ultra 897</td><td></td><td>TIRF イメージングおよびアクセション用</td></tr><tr><td>両面テープ</td><td>スコッチ</td><td></td><td>運動性チャンバーを作るため</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>フィッシャーファイネスト</td><td>12-548-5A</td><td>サイズ; 22X30</td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td>ブルースター</td><td></td><td>運動性チャンバーを作るため</td></tr><tr><td>加熱ブロック</td><td>ノイエーション</td><td></td><td>パラフィンワックスを溶解</td></tr>する <tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ニコン エクリプス Ti- U</td><td></td><td>タンパク質発現をチェックするため</td></tr><tr><td>レーザー</td><td>488nm (100mW)</td><td></td> <td>TIRFイメージング用</td></tr><tr><td>液体窒素</td><td></td><td></td><td>サンプルの凍結および保存用</td></tr><tr><td>マイクロキャピラリーローディングチップ</td><td>エッペンドルフ</td><td>EP022491920</td><td>微小管のせん断用</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ニコン Eclipse Ti2-E DICセットアップ</td><td></td><td>用 TIRFイメージング用</td></tr><tr><td>ミニスピン</td><td>Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd</td><td></td><td>クイックスピン</td></tr><tr><td>用 対物レンズ</td><td>100X TIRF対物レンズ、1.49NA油浸</td><td></td><td>TIRFイメージング用</td></tr><tr><td>オプティマ ウルトラ遠心分離機 XE</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>タンパク質精製用</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>コーニング</td><td>コアリング430</td><td>pHを調整するため</td></tr><tr><td>ピペットボーイ</td><td>VWR</td><td></td><td>Sf9の培養と精製用</td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td><td>タンパク質精製用</td></tr><tr><td>Sorvall ST8R遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>タンパク質精製</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>微小管重合用</td></tr><tr><td>超遠心ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>SW60Tiローター</td></tr><tr><td>超遠心チューブ</td><td>ベックマン</td><td></td><td>5 mL、オープントップ薄壁超透明チューブ、13 x 51mm</td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>ニューエーション</td><td></td><td>サンプルミキシング</td></tr><tr><td>ワックス</td><td>シグマ</td><td>V001228</td><td>運動性チャンバーをシールするために</td></tr></tbody></table>

sf9精製超加工キネシン-3ファミリーモーターの1分子解析

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

複雑な細胞環境は、単一分子の運動性解析に課題をもたらします。しかし、イメージング技術の進歩により、単一分子の研究が改善され、蛍光タグ付き分子の動的挙動の検出と理解において絶大な人気を得ています。ここでは、全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いたキネシン-3ファミリーモーターのin vitro 単一分子研究の詳細な方法について説明します。キネシン-3は、細胞内貨物輸送から細胞分裂、発生に至るまで、細胞および生理学的機能において重要な役割を果たす大きなファミリーです。我々はこれまで、構成的に活性な二量体キネシン-3モーターが、哺乳類細胞でモーターを発現させて調製した細胞ライセートを用いて、1分子レベルで高い微小管親和性を有する高速かつ超加工的な運動性を示すことを示した。私たちの研究室では、キネシン3モーターとその制御機構を細胞学的、生化学的、生物物理学的アプローチを用いて研究しており、そのような研究では大規模な精製タンパク質が必要です。哺乳類細胞を用いたこれらのモーターの発現および精製は高価で時間がかかるが、原核生物発現系での発現は有意に凝集し、不活性なタンパク質をもたらした。細菌精製システムと哺乳類細胞ライセートによってもたらされる制限を克服するために、これらのモーターを発現および精製するための堅牢なSf9バキュロウイルス発現システムを確立しました。キネシン-3モーターは、シグナルを増強し、光退色を減少させる3タンデム蛍光タンパク質(3xmシチリンまたは3xmCit)でC末端にタグ付けされています。Sf9精製タンパク質の in vitro 単一分子およびマルチモーター滑走分析は、キネシン-3モーターが哺乳類細胞溶解物を用いた以前の研究と同様に高速で超加工的であることを示しています。これらのアッセイを使用する他のアプリケーションには、モーターのオリゴマー条件、生化学的研究と並行している特異的結合パートナー、およびそれらの速度論的状態に関する詳細な知識が含まれます。

Sf9バキュロウイルス発現を用いて活性型および機能的組換えモータータンパク質を大規模に発現・精製するためには、Sf9細胞に感染するためのコード配列を安定に保持するウイルス粒子の生成が必要です。これを達成するために、Sf9細胞にKIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAGをコードする組換えバクミドをトランスフェクトした。72時間後、有意な細胞集団が細胞および核の拡大を伴う緑色蛍光タンパク質(mCitrine)の発現を示し(図1 および 図2)、ウイルス粒子(P0)の生成に成功したことが示唆された。これらのウイルス粒子は、新鮮なSf9集団に大量に感染させて、貯蔵および大規模感染用のP1ウイルスストックを生成することによってさらに拡大した。キネシン-3モーターの精製のために、Sf9細胞の30mL培養物を1mLのP1ウイルス粒子で感染させた。感染の72時間後、緑色蛍光タンパク質を明るく発現する細胞を回収し、溶解し、抗FLAG抗体コーティング樹脂によるC末端FLAGタグアフィニティー精製を用いて精製した。興味深いことに、...

本研究では、キネシン-3ファミリーのメンバーであるKIF1A(1-393LZ)をSf9-バキュロウイルス発現系を用いて精製する。これらの精製モーターの in vitro 単一分子およびマルチモーターグライディング分析は、哺乳類細胞ライセートからのモーターに匹敵する堅牢な運動特性を示しました。したがって、Sf9-バキュロウイルス系は、目的のモータータンパク質を発現および精製するのに適している。

Sf9精製超加工キネシン-3ファミリーモーターの1分子解析

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

このプロトコルは、Sf9バキュロウイルスシステムを使用して活性分子モーターを精製するための簡単な方法を提供します。また、モータータンパク質の調節メカニズムを研究するための単一分子運動およびマルチモーターグライディングアッセイについても詳しく説明します。従来のベクター発現Sf9バキュロウイルス発現とシングルステップアフィニティー精製はすべて、純粋で活性なモータータンパク質を、単一分子およびマルチモーターシステムにおけるスーパープロセシティブキネシンの機構の詳細を研究するように導きます。キネシンモーターに加えて、このプロトコルは、ジオニンやミオシンなどの他の細胞骨格ベースのタンパク質の生化学的および生物物理学的特性の研究に適用できます。プロトコルは詳細でわかりやすいです。いくつかの提案は、Sf9細胞は汚染されやすいため慎重に取り扱い、プロトコルで提供されているメモに従うことです。視覚的なデモンストレーションは非常に効果的で、特にこれらのアッセイを実行したことがない人にとって、重要なステップに従いやすく理解しやすいです。手順を実演するのは、私とプラディープ・ナイクと一緒に働いている博士課程の学生であるプシュパンジャリ・ソッピーナとディペシュワリ・シェワレです。はじめに、細胞を35ミリリットルの皿に、1ミリリットルあたり10から5番目の細胞に4.5倍の密度で播種します。24時間後、1マイクログラムのバクミドDNAと100マイクロリットルの未添加グレース培地をチューブに入れて混合します。6マイクロリットルのトランスフェクション試薬を別のチューブに入れて、100マイクロリットルの未添加のグレース培地と混合します。最初のチューブの内容物を2番目のチューブに慎重に移します。それらを混合し、室温で45分間混合物をインキュベートする。0.8ミリリットルの未添加グレース培地を混合物に加える。細胞からSf900 SFM培地を混合して吸引します。調製したトランスフェクション培地を細胞の上部に滴下し、プレートを6時間インキュベートします。その後、トランスフェクション混合物を慎重に除去します。2ミリリットルのSF900 SFM培地を加え、さらに摂氏28度で48時間インキュベートします。次に、倒立蛍光顕微鏡でモータータンパク質発現を確認する。感染した細胞を含む培地を回収し、500 Gで5分間回転させ、上清を収集し、アリコートをスナップフリーズします。細胞を含む10ミリリットルのSF900 SFM培地と1ミリリットルのPゼロウイルスストックを、滅菌済みの100ミリリットルの円錐フラスコに入れます。摂氏28度でインキュベートし、90rpmで絶えず振とうします。72時間後、15ミリリットルの滅菌コニカルチューブで500 Gで5分間細胞をスピンダウンし、上清を収集します。大規模なタンパク質発現のた

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Research

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Biochemistry

生物化学

これからアクティブ全長キネシンを分離するためのプロトコルです。...

キネシンの単離及び精製からショウジョウバエ胚

小胞や細胞小器官などの貨物の細胞内輸送は、分極した微小管を追跡する分子モータータンパク質によって行われます。このプロトコルは、ニューロン内を移動する個々の貨物粒子の輸送の方向性と、関連するモータータンパク質の相対的な量とタイプとの相関関係を説明しています。...

「カーゴマッピング」解析を用いた軸索貨物を移動するに分子モーターの構成を特徴づける

ここでは、プロトコルは、キネシン-1貨物を識別するために提示されています。キネシン-1重鎖（KIF5B）のモータレス変異体は、細胞質内で凝集し、その貨物の凝集を誘導します。両方の凝集体は、蛍光顕微鏡下で検出されます。同様の戦略は、他のモータータンパク質の貨物を識別するために使用することができます。...

蛍光顕微鏡を用いたキネシン1貨物の同定

表面付着キネシン モーター蛋白質が色素標識微小管を推進分子シャトルを構築するためのプロトコルを提案します。表面とキネシンの弱い相互作用は、それへのリバーシブルの愛着をできます。これは、動的アセンブリとそのコンポーネントの機能を維持しながら分解を表わすナノスケール...

キネシンを添付可逆的アトス分子シャトルの組み立て

このプロトコルの目的は、DNA折り紙ナノ構造上の分子モーターのアンサンブルを形成し、全内部反射蛍光顕微鏡を使用してアンサンブル運動性を観察することです。...

単一分子観測のためのDNA折り紙ナノ構造に関するダインとキネシンモーターアンサンブルの製造

S. cerevisiae細胞から精製された双方向キネシン-5 Cin8の一分子およびクラスターの運動性

ここでは、微小管束を in vitroで...

再構成された活性微小管束内の力を直接測定

単一分子レベルでの高精度FRET実験のプロトコールをここに示します。さらに、この方法論は、N-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体のリガンド結合ドメインにおける3つの構造状態を同定するために使用することができる。正確な距離を決定することは、FRET実験に基づく構造モデルを構築するための第一歩です。...

生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

G quadruplexes を操作する単一分子磁気ピンセット プラットフォームによって報告されます、G4 の安定性と制御の研究によって、様々...

磁気ピンセットで G quadruplexes の単一分子マニピュレーション

このプロトコルを記述する、heterobifunctional シラン カップリング剤による酸化シリコン薄膜表面の原子間力顕微鏡による単一分子力分光法のために設計するで例示されている蛋白質の共有結合固定化、RrgA の相互作用 (毛 1 先端付着性S.

力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定

学ぶSf9バキュロウイルス系を用いたキネシン-3ファミリーモーターKIF1Aの精製法と1分子モーター運動アッセイ。この手法は、細胞内輸送メカニズムの解明と他の細胞骨格タンパク質研究への応用に有用です。

Sf9精製超加工キネシン-3ファミリーモーターの1分子解析

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