Name: ヒト人工多能性幹細胞由来2型肺胞上皮細胞の3Dスフェアおよび2D気液界面培養物の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 学ぶ、ヒトiPSC由来2型肺胞上皮細胞の3Dスフェアおよび気液界面培養法。この技術は肺の恒常性と疾患における肺生物学を研究し、遺伝的要因や環境暴露の影響を調査するのに役立ちます。

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ウィルソン研究所、コットン研究所、ホーキンス研究所のメンバーの有益な議論に心から感謝します。また、Greg Miller(CReM Laboratory Manager)とMarianne James(iPSCコアマネージャ)の貴重なサポートにも非常に感謝しています。ブライアン・ティルトンとBUMCフローサイトメトリーコアの細胞選別に関する技術支援に感謝します(NIH助成金#1S10OD021587-01A1の支援を受けています)。この研究は、RBWに授与されたオーストラリア国立保健医療研究評議会のCJ Martin Early Career Fellowshipによって支援されました。NIHはKMAにF30HL147426を付与します。肺線維症財団からIM Rosenzweig Junior Investigator Awardを、ボストン大学臨床・トランスレーショナルサイエンス研究所(1UL1TR001430)からKDAにIntegrated Pilot Grant Awardを授与。スイス国立科学財団(P2ELP3_191217)からABAへ。NIHは、U01HL148692、U01HL134745、U01HL134766およびR01HL095993をDNKに付与します。NIHは、AAWに授与されたU01TR001810、R01DK101510、およびR01DK117940を付与します。iPSCのメンテナンス、バンキング、および共有は、NIHグラントNO1 75N92020C00005によってサポートされています。図 1 は、Biorender.com を使用して作成されました。

ヒトiPSC株の分化を含むすべての実験は、ボストン大学の治験審査委員会(プロトコルH33122)に準拠して実施した。iPSCへのリプログラミングのために調達された皮膚線維芽細胞は、ワシントン大学医学部(ミズーリ州セントルイス)のヒト研究保護室の承認の下、書面によるインフォームドコンセントでドナーから入手した。
1. 肺胞圏解離
<ol><li>表1に記載の組成に従って完全無血清分化培地(cSFDM)を調製した。</li>
	<li>表2に従って、調製したcSFDMベースにCK+DCIメディアを準備する。</li>
	<li>実験ニーズに応じて、2D(ヒト胚性幹細胞認定)および/または3D(成長因子低減)マトリックスを氷上で融解する。</li>
	<li>指向性分化19に由来する肺胞球を含む3Dマトリックス液滴から、ピペットまたは吸引ピペットを用いて真空ですべてのCK+DCI培地を12ウェルプレートに吸引する。</li>
	<li>液滴あたり1 mLのディスパーゼ(2 mg/mL)を加える。液滴をP1000ピペットを用いてディスパーゼに穏やかにピペットする。37°Cで1時間インキュベートし、30分後に上下に1回ピペッティングする。</li>
	<li>解離したオルガノイド(ステップ1.5から)をディスパーゼ内の1つのマトリックス液滴から15mLの円錐管に移す。洗浄するには、10mLのIscoveの改変ダルベッコ培地(IMDM、 材料表を参照)を加えます。</li>
	<li>300 x g で室温で5分間遠心分離する。上清をピペットまたは吸引ピペットを使用して真空で吸引し、上清をできるだけ残さないでください。 注:残りのディスパーゼは、細胞がその後に播種されるマトリックスを溶解する可能性があるため、すべてのディスパーゼを除去することが重要です。ペレットの上に明確なヘイズが見られる場合、ディスパーゼはマトリックスを完全に溶解しておらず、さらにディスパーゼを37°Cでさらに20〜30分間ペレットに添加することができる。</li>
	<li>細胞を液滴あたり0.05%トリプシン1mLに再懸濁し、12ウェルプレートに戻した。37°Cで12〜15分間インキュベートする。解離を顕微鏡で観察する。この段階でセルを過剰にピペッティングすることは避けてください。 注:インキュベーションの終わりに、細胞はP1000ピペットで3〜5回ピペッティングした後、単一細胞懸濁液を達成する必要があります。iAT2sをALIに継代する場合(ステップ3)、細胞培養インサートへのプレーティングの準備ができたら、細胞が単一細胞懸濁液ではなく2〜3細胞凝集塊になるように、トリプシン処理時間を最小限に抑える必要があります(最大12分)。</li>
	<li>等量のFBS含有培地(DMEM中の10%ES修飾FBS)を用いてトリプシンの作用を停止する。300 x g で室温で5分間遠心分離する。</li>
	<li>細胞を10mLのIMDMで洗浄する。300 x g で室温で5分間遠心分離する。</li>
	<li>計数のために細胞を適切な体積に再懸濁し、次いで血球計数器を用いて細胞を計数する( 材料表を参照)。 注: 400 cells/μL で播種された 1 つのコンフルエントな 50 μL マトリックス液滴から、期待される収量は 1 液滴あたり 500,000 ~ 1.5 x106 細胞です。</li>
	<li>iAT2細胞の単一細胞懸濁液を使用して、3Dマトリックスにプレーティング(ステップ2)および/またはALI培養用の細胞培養インサートにプレーティング(ステップ3)することによって肺胞スフェアを生成します。</li>
</ol>2.3D iAT2のめっき
<ol><li>カウント後(ステップ1.11)、3Dマトリックスにリプレートする所望の細胞数を決定します(12ウェルプレートのウェルあたり50〜100μLの3Dマトリックス液滴を含むマトリックスの400細胞/μL)。細胞を300 x g で室温で5分間遠心分離する。ピペットを使用してできるだけ多くの上清を除去します。</li>
	<li>3D マトリックス内のセルを再懸濁します。必要に応じて、マトリックスが重合するのを防ぐために、素早く氷の上に再懸濁します(これは暖かいときに起こります)。</li>
	<li>P200ピペットを使用して、ウェルごとに1つの3Dマトリックス液滴を事前に温めた12ウェルプレートに分配します。ピペットは、マトリックス液滴中に気泡を生じさせないように注意深くする。複数の液滴を分配している間、細胞懸濁液が沈降しないようにしてください。</li>
	<li>プレートを37°Cのインキュベーターに20〜30分間置き、マトリックス液滴が重合できるようにします。</li>
	<li>1 ウェルあたり 1 mL の CK + DCI + 10 μM の Y-27632 培地 ( 材料表を参照) を加えて、マトリックス液滴を覆います。</li>
	<li>72時間後、培地を10μMのY-27632を含まないCK+ DCIに変更する。</li>
	<li>培地を48〜72時間ごとに新鮮なCK + DCIに交換してください。 注: iAT2 は通常、細胞株およびプレーティング密度に応じて、約 10 ~ 14 日ごとに継代する必要があります。</li>
</ol>3. iAT2 の ALI への受け渡し
<ol><li>2Dマトリックスの製造元の指示に従って、ダルベッコの改変イーグル培地/栄養素混合物F-12(DMEM/F12)で2Dマトリックスを作業溶液に希釈することにより、使用の1時間前にコーティングしたばかりの6.5mm細胞培養インサートを準備します( 材料表を参照)。次いで、6.5 mm細胞培養インサートあたり100 μLの希釈マトリックスを加える。マトリックスを37°Cのインキュベーター内で30分間または室温で1時間重合させます。</li>
	<li>細胞培養インサートから余分なマトリックスをピペットまたは吸引ピペットを使用して真空で吸引し、DMEM/F12で1回すすいでください。細胞を加える直前にこの洗浄液を吸引する。</li>
	<li>カウント後、培養インサート内の所望の細胞数を播種するために必要な細胞数を決定します(520,000生細胞/cm2、6.5 mm細胞培養インサートあたり172,000個の生細胞に相当)。細胞を300 x gで室温で5分間遠心分離する。できるだけ多くの上清を取り除きます。</li>
	<li>細胞を適切な容量で再懸濁し、細胞培養インサートあたり100 μLのCK + DCI + 10 μM Y-27632を播種する(細胞懸濁液は1,720細胞/μLにする必要がある)。細胞培養インサートの頂端区画に100μLを加える。プレートをクロスパターンで穏やかに攪拌して、細胞培養インサート全体に細胞が均一に分布していることを確認し、4倍の対物レンズで顕微鏡下で確認することでこれを確認します。 注: 播種密度は重要であり、6.5 mm 細胞培養インサートあたり 160,000 ~ 300,000 個の細胞の範囲で最適化が必要な場合があります。カルセイングリーン( 材料表を参照のこと)細胞透過性色素を細胞に添加し、播種後の細胞を可視化するために倒立蛍光顕微鏡で観察してもよい。</li>
	<li>500 μLのCK+DCI + 10 μMのY-27632を各細胞培養インサートの側方区画に加える。</li>
	<li>播種後48時間後に頂端CK+DCI+10μMのY-27632培地をピペットを用いて吸引し、ALIを開始した(「エアリフト」として知られる)。 注: この時点で、セルは 100% コンフルエントである必要があります。セルが 100% コンフルエントでない場合、ステップ 3.7 ~ 3.8 は指示された時点で実行する必要があります。コンフルエントな細胞単層は、形成に時間がかかることがある。</li>
	<li>72時間後に側底CK+DCI+10μMのY-27632培地を10μM Y-27632を含まないCK+DCIに変更する。 注:頂端側への媒体の「漏れ」があれば、最小限に抑える必要があります。ただし、これが最初の数日間に発生した場合は、それ以上の漏れがなくなるまで毎日頂端側を吸引し続けます。</li>
	<li>基底培地を48〜72時間ごとに新鮮なCK+ DCIと交換する。 注: ALI 培養で使用される iAT2 は、めっき後 5 ~ 14 日で最大限に成熟します。</li>
	<li>必要に応じて、めっき後最大28日間、細胞を注意深く監視して維持し、より長期間の実験を行います。 注:インサートの端から細胞が剥離したり、単層に穴が開いたりするなど、ALI障害の目に見える兆候は、培養中の過度の延長時間後に観察され、その時点でALIはもはや実験に使用できなくなります。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もありません。

AT2は肺の恒常性を維持し、これらの重要な肺胞細胞の機能不全は、様々な肺疾患を引き起こし、その結果として生じる可能性がある。一次ヒトAT2へのアクセスと分離が困難なため、iAT2が生成されます。他の場所25 に記載された指向性分化法およびここに記載される拡大および細胞播種を適用することによって、任意の個体から生成されたiPSCを、堅牢に自己再生するiAT2に分化させることができ、したがって、基礎生物医学研究開発研究、疾患モデリング、細胞ベースの治療、または薬物スクリーニングを含む生物医学研究のための患者特異的細胞を提供する。本プロトコールは、iAT2を単一細胞懸濁液に解離させる方法を詳述し、次いで、これを3Dマトリゲル中で再播種して細胞増殖のための肺胞スフェアを生成するか、またはさらなる実験のために2D ALI培養において再播種することができる。
このプロトコルには、3D培養とALI培養の両方で継代と再めっきを成功させるためのいくつかの重要なステップがあります。過度のピペッティングは細胞の生存率を低下させる可能性があるため、機械的摩砕は最小限に抑える必要があります。さらに、3D および 2D ALI 培養の両方における iAT2 の播種密度は非常に重要です。3D培養では、一般に、400細胞/μLの3DマトリゲルがほとんどのiPSC株に最適です。しかし、100~500細胞/μLの密度の範囲が成功していることもあり、異なる細胞株では密度の最適化が必要になる場合があります。ALI培養の場合、細胞培養インサート上のiAT2sの播種密度を最適化することも、播種後48時間(すなわち、エアリフトの日)の細胞のコンフルエントな単層を達成するために不可欠である。一部の iAT2 ラインでは、インサートごとにより多くのセルが必要です。したがって、トラブルシューティングが必要な場合は、24 ウェル細胞培養インサート用に 160,000 ~ 300,000 セル/インサートの範囲をお勧めします。3D 培養は、播種密度を 3D マトリックスの 400 cells/μL に維持し、マトリックス液滴サイズをそれぞれ 25 μL および 20 μL に減らすことによって、24 ウェルプレートおよび 48 ウェルプレートにスケーリングすることもできます。ALI 培養は、各インサートに 30 μL のマトリックスをコーティングし、インサートあたり 30 μL で 80,000 個の細胞をプレーティングし、1 ウェルあたり 150 μL の側底培地を供給することにより、96 ウェル細胞培養インサートにスケールすることができます。シード密度、マトリックスおよびメディアボリュームは、他のプレート形式に合わせてスケーリングおよび最適化する必要があります。
このプロトコルの制限は、ALIプレーティングに使用される細胞がiAT2 ALIを形成するためにNKX2-1+およびSFTPC+19,20,21,23であるように十分に精製されなければならないことであり、ALI培養形成はラインごとに異なる可能性がある。さらに、このプロトコルは、AT2のみの培養物の拡大および生成を可能にし、単一の重要な肺胞細胞型に基づく還元主義モデルシステムを提供する。重要なことに、肺胞1型細胞などの他の関連する肺胞細胞型が、これらのプラットフォームから欠落していた。他のグループは、線維芽細胞の有無にかかわらず、初代ヒトAT2をスフェロイドまたは有機型培養物として培養することに成功している1、14、15、16、17;しかしながら、初代ヒトAT2は、ALI条件を有さない通常の2D培養で培養すると、主要な界面活性剤の発現を失う傾向がある26。さらに、最近の研究は、iAT2sが新鮮で未培養のヒト初代AT2sよりも高い増殖マーカーおよび低いAT2成熟マーカーを発現することを示した27。iAT2と新鮮な初代ヒトAT2sとの間のこれらの違いにもかかわらず、我々は、培養された初代AT2でさえ、新鮮で未培養の初代AT2s2s27とのトランスクリプトーム的差異を示すことを見出し、したがって、これらのin vitroモデルは、in vivo肺生物学をモデル化するための様々な長所と限界を有すると結論付けた。
iAT2プラットフォームは、患者由来のiPSCからの遺伝子変異の研究に適用することができる19,20。このシステムは、ハイスループットの薬物スクリーニングに対応するために大幅にスケールアップすることもできます。加えて、iAT2 ALIsは、ウイルス感染もしくは細菌感染、またはタバコ煙、電子タバコ蒸気、または他のエアロゾル23への曝露などの環境曝露に適している。要約すると、iAT2sの3Dおよび2D ALI培養の両方を生成するためのこのプロトコルは、疾患関連細胞型の長期培養を可能にし、多くのアプリケーションでこれらの細胞の使用を可能にする生理学的でスケーラブルなプラットフォームを提供する。

肺では、気道および肺胞上皮細胞は、吸入エアロゾルおよびタバコの煙などの有害な刺激を介して伝達される病原体を含む、吸入環境曝露に最初に遭遇する。2型肺胞上皮細胞(AT2s)は、遠位肺上皮の通性前駆細胞であり、肺胞表面張力を緩和する界面活性剤を産生し、吸入曝露に対する自然免疫応答をマウントするため、肺恒常性を維持するのに不可欠である1,2。しかし、AT2機能障害は、肺損傷またはAT2において選択的に発現される遺伝子(SFTPC、SFTPBおよびABCA33、4、5)の変異に起因する可能性がある。これらの遺伝子変異を研究するための以前のアプローチは、マウスモデル6または不死化細胞株7に導入された操作された変異含有ベクターに依存していた。したがって、生理学的に関連する細胞型および生産的なin vitroシステムにおけるAT2sに対する遺伝的および環境的摂動の影響をモデル化できるプラットフォームは、AT2が健康および疾患において果たす役割をさらに理解するために必要である。
空気中曝露のモデリングに関して、初代気道上皮細胞の気液界面(ALI)培養は、タバコの煙8に対する重要な分子応答を明らかにし、気道感染9,10をモデル化するために首尾よく利用されている。疾患における感染または傷害の重要な部位である肺胞上皮のための同等のALI培養系は、気道上皮モデル系と比較してはるかに開発されていない。不死化細胞株は、肺胞上皮11、12の代理としてALIで培養されてきたが、これらの細胞株は、初代肺胞上皮細胞13とは転写学的に異なり、界面活性剤を分泌する能力やALI12でタイトジャンクションを形成する能力などの重要な細胞機構を欠いている。初代ヒトAT2は、線維芽細胞1,14の存在下で3Dスフェアで培養することができるが、外植肺からのアクセスが制限されていること、およびこれまでのほとんどの培養において細胞表現型を老化または喪失させる傾向など、制限を受ける。これらの特性は、一次AT2のインビトロ研究の広範な採用に対する障壁を提示するが、一次AT2の拡大のためのフィーダーフリー3D培養の最適化において最近の進歩がなされている15、16、17、18。
ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)由来の2型肺胞上皮細胞(iAT2s)を生成するためのin vivo発生マイルストーンを再現するために、指向性分化プロトコルが開発されています19。iAT2sは、CHIR99021、KGF、デキサメタゾン、cAMP、および「CK+DCI」19と称される3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)を含む規定培地中で、3D無血清培養において自己再生スフェアとして増殖し、線維芽細胞フィーダーの非存在下で、20、21>20継代で培養することができる。さらに、iAT2sはトランスクリプトームプログラムをヒト成人原発性AT2と共有し、層状体を形成し、界面活性剤19、21、22を産生およびパッケージ化する。このプロトコルは、細胞を単一細胞懸濁液に解離させることによるiAT2のシリアル継代を詳述する。この時点で、iAT2sは、3D培養においてさらに再播種および増殖され得るか、または2D ALI培養物23において播種され得る。これらの方法は、ホメオスタシスおよび疾患20,22におけるAT2sの内因性生物学を研究し、以前に示されたように、スケーラブルで生理学的に関連するプラットフォーム23,24における化合物または刺激の効果を調査するために使用することができる。

<table><tbody><tr><td>3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)</td><td>シグマ</td><td>I5879</td><td>CKDCI</td></tr><tr><td>12ウェル細胞培養プレート</td><td>用 コーニング</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>1-チオグリセロール(MTG)</td>培養用プレート<td>M6145</td><td>シグマ</td><td>CKDCI</td></tr><tr><td>2Dマトリゲル(マトリックス)用 - マトリゲルhESC認定マトリックス</td><td>コーニング</td><td>8774552</td><td>ALIトランズウェル3D</td></tr><tr><td>マトリゲル(マトリックス)をコーティングするには - 成長係数低減マトリゲル</td><td>コーニング</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>8-ブロモアデノシン30,50-環状一リン酸ナトリウム塩(cAMP)</td>でiAT2球を成長させるには、<td>シグマ</td><td>B7880</td><td>CKDCI</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>A4544</td>シ<td>グマ</td><td>CKDCI</td></tr><tr><td>B27 w /アウト レチノイン酸</td><td>ライフ</td><td>テクノロジー12587-010</td><td>CKDCI</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)(7.5%)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15260037</td><td>CKDCI用</td></tr><tr><td>カルセインブルー</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ C1429</td><td>フローサイトメトリーにおける生死識別用</td></tr><tr><td>カルセイングリーン</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ C1430</td><td>細胞培養インサート上の細胞の可視化</td></tr><tr><td>(オプション 細胞培養インサート - Costar 6.5 mm クリアトランズウェル、0.4 & マイクロ;mの細孔サイズ</td><td>Millipore-Sigma</td><td>CLS3470-48EA</td><td>ALIのトランズウェル</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td>CKDCI</td></tr>の<tr><td>デキサメタゾン</td><td>Σ</td><td>D4902</td>のための<td>CKDCI</td></tr><tr><td>のDispase(2 mg/mL)</td><td>のためのThermo Fisher</td><td>354235</td><td>matrigel</td></tr><tr><td>Dulbeccoの変更されたEagle媒体(DMEM)</td><td>を</td><td></td>分解するためにトリ<td>プシンの不活性化を作るために培地 (DMEM 中 10% FBS)</td></tr><tr><td>ダルベッコの改良型イーグル培地/栄養混合物 F-12 (DMEM/F12)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A4192002</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td> を洗浄するためサー<td>モフィッシャー</td><td>14190</td><td>フローサイトメトリー分析用</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS) (ハイクロン特性化)</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>SH30071.03</td><td>トリプシン不活性化培地 (DMEM 中の 10% FBS)</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>CKDCI</td></tr><tr><td>Ham's F-12 Nutrient Mixture (F12)</td><td>Cellgro</td><td>10-080-CV</td><td>For CKDCI</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Invivogen&nbsp;プリモシン 1 G (50 mg/mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9392943</td><td>For CKDCI</td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12440053</td><td>For CKDCI</td></tr><tr><td>Millicell ERS-2 Voltohmeter Millipore</td><td></td><td>MERS00002</td><td>Trans-Epithlial 電気抵抗の測定には</td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>CKDCI 用</td></tr><tr><td>組換えヒトKGF</td><td>R&D Systems</td><td>251-KG-010</td><td>CKDCI</td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td>シグマ</td><td>用 R2625</td><td>CKDCI</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15250061</td><td>継代中の細胞数</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.05%)</td> <td>Gibco</td><td>25-300-062</td><td>iAT2 球体を解離するには</td></tr><tr><td>Y-27632 二塩酸塩</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>継代後に細胞に加え</td></tr></tbody></table>る

ヒト人工多能性幹細胞由来2型肺胞上皮細胞の3dスフェアおよび2d気液界面培養物の生成

Generating 3D Spheres and 2D Air-Liquid Interface Cultures of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Type 2 Alveolar Epithelial Cells

肺では、肺胞上皮は環境刺激からの物理的な障壁であり、恒常性および疾患において不可欠な役割を果たす。2型肺胞上皮細胞(AT2s)は、遠位肺上皮の通性前駆細胞である。AT2の機能不全および傷害は、様々な肺疾患に起因し、寄与し得る。したがって、AT2生物学の理解の向上は、肺生物学および疾患を理解するために重要である。しかし、主要なヒトAT2は一般に分離が難しく、供給が限られている。これらの制限を克服するために、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)由来の2型肺胞上皮細胞(iAT2s)を、in vivo肺発生を反復する指向性分化プロトコールを介して生成することができる。iAT2はフィーダーフリーの状態で成長し、トランスクリプトームプログラムをヒト成人原発性AT2と共有し、界面活性剤の生産、包装、分泌などのAT2の主要な機能を実行します。このプロトコルは、3次元(3D)培養におけるシリアル継代によって自己再生iAT2を維持する方法、またはiAT2を気液界面(ALI)培養に適合させる方法を詳述する。iAT2sの単一細胞懸濁液は、3D可溶化基底膜マトリックス(以下「マトリックス」という)中でプレーティング前に生成され、そこで単層上皮球に自己集合する。3D培養中のiAT2sは、2D ALI培養において継代または播種される単一細胞懸濁液に連続的に解離させることができる。ALI培養では、iAT2は頂端表面が空気にさらされた偏光単分子膜を形成し、このプラットフォームを環境暴露に容易に順応させます。したがって、このプロトコルは無尽蔵のiAT2の供給を生成し、SFTPCtdTomato発現によって示されるAT2プログラムを維持しながら、15継代にわたって入力セルあたり1 x 1030セル以上を生成します。得られた細胞は、遺伝子変異の研究、環境曝露のモデル化、または薬物のスクリーニングに適用できる再現性のある関連性の高いプラットフォームを表します。

iAT2sを単一細胞懸濁液に継代し、次いでALI培養用の細胞培養インサート上で3Dマトリックスまたは2Dで再播種した(図1)。単一細胞解離後、iAT2sをフローサイトメトリーによって分析した。簡単に説明すると、細胞をカルセインブルー生存率色素(1:1000)と共にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の1%ウシ胎児血清(FBS)に再懸濁し、フローサイトメーターで分析し、非断片、一重項、およびtdTomatoについてゲーティングした。ここで、一例として、培養中のAT2プログラムの経時的な可視化および追跡を容易にするために、内因性SFTPC遺伝子座を標的とするtdTomatoレポーターを有するSPC2ライン(SPC2−ST−B2クローン20)がある(図2A)。iAT2 SFTPC-tdTomatoの発現は、スフェアとして3Dマトリックスに再播種した場合(図2B)、および細胞培養インサートに播種した場合(図2C)に維持された。上皮経電気抵抗(TEER)を測定して、ALI培養物の完全性を決定することができる(図2D)。TEERを測定するために、ボルトマンメーター(材料表を参照)を使用し、100μLのCK+ DCI培地を頂端チャンバーに添加した。播種した細胞の非存在下でマトリゲルでコーティングした細胞培養インサートをブランクとして処理した。測定値は、すべての井戸の3つの場所で撮影されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63875/63875fig01v2.jpg"> 図 1: プロトコル ワークフローの概略図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63875/63875fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63875/63875fig02.jpg"> 図2:プロトコルの代表的な結果 (a)3Dで培養したヒト人工多能性幹細胞由来2型肺胞上皮様細胞(iAT2s)におけるSFTPC−tdTomatoについての代表的なフローサイトメトリー結果。示された陰性対照は、非肺内胚葉(CD47lo)である。(b)継代後様々な日数(dpp)で3Dで培養したiAT2sの代表的な生細胞イメージング(SFTPC-tdTomato、スケールバー=50μm)。(C)気液界面(SFTPC-tdTomato、スケールバー=500nm)でメッキされたiAT2sの代表的な生細胞イメージング。(D)気液界面にメッキされたiAT2sの代表的な上皮経電気抵抗。n=3、エラーバーは標準偏差を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63875/63875fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>500 mL の容量</td>
			<td>最終濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td>
			<td>375ミリリットル</td>
			<td>75%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ハムのF-12栄養混合物(F12)</td>
			<td>125ミリリットル</td>
			<td>25%</td>
		</tr>
<tr>
<td>B-27 (RA付) サプリメント</td>
			<td>5キロリットル</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-2サプリメント</td>
			<td>2.5キロリットル</td>
			<td>0.50%</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA(7.5%の在庫)</td>
			<td>3.3ミリリットル</td>
			<td>0.05%</td>
		</tr>
<tr>
<td>プリモシン (50 mg/mL ストック)</td>
			<td>1キロリットル</td>
			<td>100 μg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>グルタマックス(100xストック)</td>
			<td>5キロリットル</td>
			<td>1倍速</td>
		</tr>
<tr>
<td>アスコルビン酸 (50 ミリグラム/mL ストック)</td>
			<td>500 μL</td>
			<td>50 μg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1-チオグリセロール (MTG) (2 mL IMDM 中の 26 μL から)</td>
			<td>1.5キロリットル</td>
			<td>4.5 × 10〜4メートル</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:完全無血清分化培地(cSFDM)の組成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>最終濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>チル99021</td>
			<td>3 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>ティッカー</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>デキサメタゾン</td>
			<td>50 ナノメートル</td>
		</tr>
<tr>
<td>8-ブロモアデノシン-30,50-環状一リン酸ナトリウム塩(cAMP)</td>
			<td>0.1 ミリアンペア時</td>
		</tr>
<tr>
<td>3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)</td>
			<td>0.1 ミリアンペア時</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:CK+DCI媒体の組成

本プロトコールは、ヒト人工多能性幹細胞由来2型肺胞上皮様細胞(iAT2s)を記載する。これらの細胞は、3D培養において自己再生スフェアとして培養することも、気液界面(ALI)培養に適合させることもできる。

ヒト人工多能性幹細胞由来2型肺胞上皮細胞の3Dスフェアおよび2D気液界面培養物の生成

In the lung, the alveolar epithelium is a physical barrier from environmental stimuli and plays an essential role in homeostasis and disease. Type 2 ...

このプロトコルは、肺内の重要な細胞集団を培養および継代するための方法を概説し、環境曝露のための生理学的に関連するプラットフォームを確立する。この技術の主な利点は、恒常性と疾患の文脈で肺生物学を調査するために使用できることです。この方法は、特に肺胞に影響を及ぼす肺疾患、遺伝的変異、環境曝露、感染因子、またはこれらの因子の組み合わせによって引き起こされるものを含む、洞察を提供することができる。手順を実演するのは、私とRhiannon Werderで、医学博士課程の学生であるKristy Aboと、私たちの研究室のラボマネージャーであるOlivia Hixによって支援されます。まず、12ウェルプレートにおける指向性分化に由来する肺胞スフェアを含む3Dマトリックス液滴から全てのCK DCI培地を吸引する。液滴ごとに1ミリリットルのディスパーゼを加える。液滴をP−1000ピペットを用いてディスパーゼに穏やかにピペットする。インキュベーション後、解離したオルガノイドをディスパーゼ内の1つのマトリックス液滴から15ミリリットルの円錐管に移す。10ミリリットルのIscoveの改質ダルベッコの培地を加え、室温で5分間300 x gで遠心分離機をかけます。上澄み液をできるだけ吸引する。液滴あたり1ミリリットルの0.05%トリプシンで細胞を再懸濁し、12ウェルプレートに戻します。これを摂氏37度で12〜15分間インキュベートしてから解離を顕微鏡で観察し、細胞のピペッティングを避けてください。インキュベーションの終わりに、単一細胞懸濁液が得られる。等量のウシ胎児血清含有培地でトリプシンの作用を停止し、続いて300 x gで5分間遠心分離を行った。次の遠心分離の前に、10ミリリットルのIMDMで細胞を洗浄する。カウントのために適切な体積に細胞を再懸濁する。次いで、血球計数器を用いて細胞を計数した。iAT2細胞の単一細胞懸濁液を3Dマトリックスにプレーティングするか、または気液界面培養用の細胞培養インサート上にプレーティングすることによって、肺胞スフェアを生成する。細胞をカウントした後、3Dマトリックスで再生する所望の細胞の数を決定し、室温で5分間、300 x gで細胞を遠心分離する。ピペットを使用してできるだけ多くの上清を除去し、3Dマトリックス中の細胞を迅速に再懸濁する。P-200ピペットを使用して、1つの3Dマトリックス液滴を予温した12ウェルプレートのウェルに分配し、マトリックス液滴に気泡を生じさせることなく、また複数の液滴を分配しながら細胞懸濁液を沈降させることなく分配する。プレートを摂氏37度のインキュベーターに20〜30分間置いてマトリックス液滴を重合させ、次いで1ウェルあたり1ミリリットルのCK DCI 10マイクロモルのY−27632培地を加えてマトリックス液滴を覆う。72時間後に培地を10マイクロモルのY−27632を含まないCK DCIに変更し、48〜72時間ごとに新鮮なCK DCIと交換する。使用の1時間前に、ダルベッコの改変イーグル培地/栄養素混合物F-12で2Dマトリックスを作業溶液に希釈することによって、新しくコーティングされた6.5ミリメートルの細胞培養インサートを準備します。次いで、6.5ミリメートル細胞培養インサート当たり100マイクロリットルの希釈マトリックスを加える。マトリックスを摂氏37度のインキュベーター内で30分間、または室温で1時間から重合させます。細胞培養インサートから過剰のマトリックスをピペットを用いて吸引する。DMEM F-12ですすぎ、細胞を加える前に直ちにこの洗浄液を吸引してください。細胞を300 x gで5分間遠心分離し、できるだけ多くの上清を除去します。細胞を適切な体積に再懸濁して、細胞培養インサートあたり10マイクロモルY−27632のCK DCI 10マイクロモルY−27632を播種し、細胞培養インサートの頂端区画に100マイクロリットルを加える。プレートを十字パターンで穏やかに攪拌して細胞の分布が均一になるようにし、顕微鏡で10倍の対物レンズで確認します。500マイクロリットルのCK DCI 10マイクロモルのY−27632を各細胞培養インサートの側底区画に加え、播種後48時間後に、ピペットを用いて頂端培地を吸引し、気液界面を開始した。72時間後、10マイクロモルY−27632を含まない側底培地をCK DCIに変更し、続いて、めっき後最大28日間、48〜72時間ごとに側底培地を新鮮なCK DCIに交換した。代表的なフローサイトメトリー結果は、内因性界面活性剤プロテインC遺伝子座を標的とするtdTomatoレポーターを有するSPC2株に対する可視化の容易さ、および培養中の経時的な2型肺胞上皮細胞プログラムの追跡の容易さを実証する。IPSC由来肺胞2型細胞界面活性剤プロテインC tdTomatoの発現は、スフェアとして3Dマトリックス中で再播種した場合、および細胞培養インサート上に播種した場合に維持された。経上皮電気抵抗を測定して、気液界面培養の完全性を決定することができる。この手順を試みるときは、機械的ピペッティングまたは酵素消化のいずれかによる過度の解離は、細胞生存率の低下および生存率の低下につながる可能性があるため、避けてください。この手順の後に行われるさらなる方法は、アッセイバリア完全性に対する経上皮電気抵抗の測定、細胞を刺激するウイルスまたは化合物の添加、免疫蛍光、およびRNA、タンパク質、または上清収集である。この技術は、SARSのCOVID-2のようなウイルスや電子タバコの蒸気のような化合物が肺胞上皮にどのように影響するかなど、研究者が新しい肺生物学や病気の質問を探求する道を開きました。

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Research

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