Name: 無傷の清澄化臓器における トリパノソーマクルジ感染細胞、休眠中のアマスティゴート、およびT細胞の定量的3Dイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 学ぶ ライトシート蛍光顕微鏡法による無傷の清澄化臓器におけるトリパノソーマ・クルジ感染細胞と休眠アマスティゴート、T細胞の定量的3Dイメージング。マウスシャーガス病モデルでの治療効果評価と寄生虫・免疫細胞相互作用の可視化に応用できます。

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須崎悦夫博士の組織透明化および免疫染色プロトコルに関する貴重な支援と推奨事項に感謝します。また、LSFMと共焦点イメージングを使用した技術サポートを提供してくれたCTEGD生物医学顕微鏡コアのM.カンダサミーに感謝しています。また、この研究を通して有益な提案をしてくれたタールトン研究グループのすべてのメンバーに感謝します。

<ol><li>Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+Chagas+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The future of Chagas disease control.</a> Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).</li>
<li>Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+chronic+Chagas+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of chronic Chagas heart disease.</a> Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).</li>
<li>Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+cells+in+Trypanosoma+cruzi+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).</li>
<li>Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insufficient+TLR+activation+contributes+to+the+slow+development+of+CD8%2B+T+cell+responses+in+Trypanosoma+cruzi+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection.</a> Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).</li>
<li>Basso, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+immune+response+in+experimental+Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modulation of immune response in experimental Chagas disease.</a> World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Martin, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T-Cell+responses+to+Trypanosoma+cruzi+are+highly+focused+on+strain-variant+trans-sialidase+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes.</a> PLOS Pathogens. 2 (8), 77(2006).</li>
<li>Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+dormancy+protects+Trypanosoma+cruzi+during+extended+drug+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure.</a> Elife. 7, 34039(2018).</li>
<li>Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+dormant+Trypanosoma+cruzi+amastigotes+using+bioluminescent-fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters.</a> Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).</li>
<li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), 199369(2021).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).</li>
<li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17, 9807(2021).</li>
<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning+reveals+cancer+metastasis+and+therapeutic+antibody+targeting+in+the+entire+body%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body.</a> Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDISCO%3A+Advanced+solvent-based+clearing+method+for+imaging+whole+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs.</a> Science Advances. 5, 8355(2019).</li>
<li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+landscape+for+tissue+clearing+based+on+hydrophilic+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents.</a> Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).</li>
<li>Murakami, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+single-cell-resolution+whole-brain+atlas+using+CUBIC-X+expansion+microscopy+and+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing.</a> Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+probing+of+intact+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular probing of intact human organs.</a> Cell. 180 (4), 796-812 (2020).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10, 508-513 (2013).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+whole-organ%2Fbody+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11, 1982(2020).</li>
<li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Bustamante, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+drug+regimen+clears+active+and+dormant+trypanosomes+in+mouse+models+of+Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease.</a> Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).</li>
<li>Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACT+or+PACT%3A+A+comparison+between+free-acrylamide+and+acrylamide-based+passive+sodium+dodecyl+sulfate+tissue+clearing+for+whole+tissue+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Journal%22%5BJournal%5D)">FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging.</a> Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).</li>
<li>Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+tissue+clearing+and+multi-organ+volumetric+imaging+enable+quantitative+visualization+of+sparse+immune+cell+populations+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 11, 599495(2020).</li>
<li>Messal, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+and+clearing+for+whole-organ+immunofluorescence+by+FLASH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH.</a> Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).</li>
<li>Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+and+3D+imaging+techniques+for+visualization+of+GFP-expressing+mouse+embryos+and+embryonic+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+tiling+light+sheet+microscope+for+imaging+of+cleared+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues.</a> Cell Reports. 33, 108349(2020).</li>
</ol>

著者は、競合する利益がないことを宣言します。

寄生虫と免疫応答の広範な全臓器イメージングの欠如は、宿主と寄生虫の相互作用の複雑さの理解を制限し、シャーガス病の治療法の評価を妨げます。本研究では、 C. cruzi感染マウスの無傷の臓器および組織を清澄化および染色するためにCUBICパイプラインを採用しました。
この研究では、複数の組織クリアリングプロトコルがテストされました(PACT32、ECi 33、FLASH34、iDISCO11、26、およびfDISCO13)。しかし、CUBICのみが高レベルのtdTomatoまたはGFP寄生虫蛍光を維持しました。同様に、以前の報告では、他の組織透明化アプローチと比較して、内因的に発現されたマーカーのCUBIC保存が示されました3...

原虫寄生虫T. cruziによって引き起こされるシャーガス病は、世界で最も無視されている熱帯病の1つであり、年間約13,000人が死亡しています。感染症はしばしば急性期から慢性期に進行し、不整脈、心不全、突然死などの患者の30%に心臓病を引き起こします1,2。急性期に寄生虫に対して強い宿主免疫応答が誘発されるにもかかわらず、少数の寄生虫は、心臓や骨格筋などの組織で宿主の生涯を通じて慢性的に存続します。適応免疫応答の開始遅延および寄生虫の非複製型の存在を含むいくつかの要因は、免疫系による完全な排除を回避するT. cruziの能力に寄与する可能性がある3,4,5,6。さらに、寄生虫の非複製休眠型は、トリパノシド薬に対する低い感受性を示し、多くの場合に観察される治療の失敗に部分的に関与している可能性があります7,8。
新しいイメージング技術の開発は、感染した組織における寄生虫の空間分布と、それらの制御に関与する免疫細胞との関係についての洞察を得る機会を提供します。これらの特性は、免疫系による寄生虫制御のプロセスをよりよく理解し、慢性組織に存在するまれな休眠中の寄生虫を追跡するために重要です。
ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)は、薄切片なしで大きな組織や臓器を3Dイメージングするための最も包括的で偏りのない方法の1つです。ライトシート顕微鏡は、薄い光シートを利用して、焦点面内の蛍光色素のみを励起し、サンプルの光退色と光毒性を低減し、超高速カメラを使用して数千の組織層の画像を記録します。組織へのレーザー光の適切な浸透に必要な高レベルの組織透明性は、組織の脱脂質化および脱色に続く屈折率(RI)を均質化することによって得られ、光の散乱を低減し、高品質の画像をレンダリングする9,10,11。
組織クリアリングアプローチは、マウス全体12、13、14、オルガノイド15、16、17、レポーター蛍光マーカー18、19、20、21、22、23、および最近では限られた数のヒト組織のイメージングのために開発されています24.現在の組織透明化の方法は、(1)DISCOプロトコル25,26などの有機溶媒ベースの方法、(2)CLARITY27などのヒドロゲルベースの方法、およびCUBICなどの水性方法(透明で遮るもののない脳/身体イメージングカクテルおよび計算分析)18,19,28,29の3つのファミリーに分類されます。.CUBICプロトコルは、臓器の形状と組織の完全性を維持し、内因的に発現したレポータータンパク質の蛍光を維持します。この技術の最新のアップデートであるCUBIC-HistoVision(CUBIC-HV)では、蛍光タグ付き抗体とDNA標識を使用したエピトープの検出も可能です28。
本プロトコルでは、清澄化された無傷のマウス組織において蛍光タンパク質を発現 するT. cruzi を検出するためのCUBICパイプラインを使用した。光学的に透明な組織をLSFM画像化し、3D再構成し、 臓器あたりのT. cruzi 感染細胞、休眠中のアマスティゴート、およびT細胞の正確な総数を自動的に定量化しました。また、このプロトコルは、抗体および核染色で透明化された臓器の均一な標識を得るために首尾よく採用された。これらのアプローチは、感染した宿主における T. cruzi の増殖と制御を理解するために不可欠であり、シャーガス病の化学療法および免疫治療薬を完全に評価するのに役立ちます。

<table><tbody><tr><td>1-メチルイミダゾール</td><td>ミリポアシグマ</td><td>616-47-7</td><td></td></tr><tr><td>2,3-ジメチル-1-フェニル-5-ピラゾロン (アンチピリン</td><td>TCI</td><td>D1876</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル 細胞培養プレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 抗マウス Fab フラグメント</td><td>ジャクソン免疫研究所</td><td>315-607-003</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 抗ウサギFab fragment</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>111-607-003</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647</td><td>Chromotek</td><td>gb2AF647-50</td><td></td></tr><tr><td>anti-RFP</td><td>Rockland</td><td>600-401-379</td><td></td></tr><tr><td>anti-&alpha;-SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td></td></tr><tr><td>B6.C+A2:A44G-GT(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/Jマウス</td> ジャ<td>クソン研究所</td><td>株 #007914</td><td>一般名:Ai14、Ai14DまたはAi14(RCL-tdT)-D</td></tr><tr><td>B6。CG-GT(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/Jマウス</td> ジャ<td>クソン研究所</td><td>株 #007914</td><td>一般名:Ai14、Ai14DまたはAi14(RCL-tdT)-D</td></tr><tr><td>BOBO-1 ヨウ化物</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>B3582</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma</td> <td>#A7906</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/Jマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>株 #032080</td><td>共通名称:CD8A-CRE (E8III-CRE)</td></tr><tr><td>CAPSO</td><td>Sigma</td> <td>#C2278</td><td></td></tr><tr><td>クリーニングワイプ キムワイプ&</td><td>nbsp;Kimberly-Clark</td><td>T8788</td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>LSM 790</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-HV 1 3D免疫染色キット</td><td>TCI</td><td>C3699</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-HV 1 3D核染色キット</td><td>TCI</td><td>C3698</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-L</td><td>TCI</td><td>T3740</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-P</td><td>TCI</td><td>T3782</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-R +</td> <td>TCI</td><td>T3741</td><td></td></tr><tr><td>シアノアクリレートベースのゲル瞬間接着剤</td><td>スコッチ</td><td>571605</td><td></td></tr><tr><td>DiR (DiIC18(7); 1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドトリカルボシアニン ヨウ化物) 会社: Biotium</td><td>Biotium</td><td>#60017</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミンテトラ酢酸 (EDTA)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Centrifuge tubes 15 mL</td><td>Corning</td><td></td><td></td>CLS430791</tr><tr><td>Falcon 遠心分離チューブ 50&nbsp; mL</td><td>コーニング</td><td>CLS430290</td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>J16920。BBR</td><td></td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td>Sigma</td> <td>#H3884 または #H4272</td><td></td></tr><tr><td>Imaris ファイル コンバーター x64</td><td>BitPlane</td><td>v9.2.0</td><td></td></tr><tr><td>Imaris ソフトウェア</td><td>BitPlane</td><td>v9.3</td><td></td></tr><tr><td>ImSpector ソフトウェア</td><td>LaVision BioTec、Miltenyi Biotec</td><td>v6.7</td><td></td></tr><tr><td>静脈注射針 23-G</td><td>Sartori、Minisart シリンジ フィルター</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td>糸くずの出ないワイプ</td></tr><tr><td>ライトシート 蛍光顕微鏡</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>ULtramicroscope II イメージングシステム</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>041838.K2</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットチップ、10 & マイクロ;L、200 &micro;Lと1,000 & マイクロ;L</td><td>Axygen</td><td>T-300、T-200-YおよびT-1000-B</td><td></td></tr><tr><td>電動ピペットディスペンサー</td><td>Fisher Scientific、Fisherbrand</td><td>03-692-172</td><td></td></tr><tr><td>取付液</td><td></td><td>TCI M3294</td><td></td></tr><tr><td>N-ブチルジエタノールアミン</td><td>TCI</td><td>B0725</td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>TCI</td><td>N0078</td><td></td></tr><tr><td>N-メチルニコチンアミド</td><td>TCI</td><td>M0374</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain</td><td>Biotium</td><td>#40061</td><td></td></tr><tr><td>Sacrifice Perfusion System</td><td>Leica</td><td>10030-380</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>血清学的ピペット</td><td>Costar 滅菌</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>振盪インキュベーター</td><td>TAITEC</td><td>BR-43FM MR</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム (NaN3)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>447815000</td><td></td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム (Na2CO3)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>L13098.36</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>447302500</td><td></td></tr><tr><td>炭酸水素ナトリウム (NaHCO3)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>014707.A9</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX-G グリーン核酸染色</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

無傷の清澄化臓器における トリパノソーマクルジ感染細胞、休眠中のアマスティゴート、およびt細胞の定量的3dイメージング

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

シャーガス病は、ラテンアメリカを中心に世界中の何百万人もの人々に影響を与える無視された病理です。シャーガス病剤である トリパノソーマ クルジ(T.クルジ)は、ヒトを含むいくつかの哺乳類種に感染し、心臓および消化器系の病状を引き起こす多様な生物学を持つ絶対性細胞内寄生虫です。 T. cruziのin vivo 感染の信頼性の高い検出は、シャーガス病の複雑な生物学を理解し、治療レジメンの結果を正確に評価するために長い間必要とされてきました。現在のプロトコルは、3D再構築されたクリアされた臓器における T.cruzi感染細胞の自動定量のための統合パイプラインを示しています。ライトシート蛍光顕微鏡法は、臓器または組織全体において活発に増殖および休眠している T. cruzi 寄生虫および免疫エフェクター細胞を正確に視覚化および定量することを可能にする。また、抗体および核染色で透明化された臓器の均一な標識を得るためのCUBIC-HistoVisionパイプラインも採用されました。組織クリアリングと3D免疫染色を組み合わせることで、薬物治療プロトコルを包括的に評価し、 T. cruzi感染組織の細胞組織の理解を深めるための公平なアプローチを提供し、シャーガス病における抗T.クルジ 免疫応答、組織損傷、および修復に関連する発見を進めることが期待されます。

CUBIC固定組織をPBSで洗浄して固定液を除去した後、組織から色素と脂質を抽出するアミノアルコールの基本的な緩衝溶液であるCUBIC-Lカクテルと一緒にインキュベートし、組織構造を維持しながら組織の脱色を行いました。紙のグリッド線は、臓器の適切な透明化を示す組織を通して見ることができます(図2A)。脱脂質化後、組織を洗浄し、それぞれCUBIC-R+およびRIホモジナイゼーションおよびイメージング用のマウント溶液に浸漬した(図2B)。
野生型マウスに、DiR近赤外シアニン色素で予め染色したtdTomato発現トリポマスティゴテスを感染させた。マウスは感染の15日後に安楽死させ、無傷の心臓を解剖し、固定し、クリアしました。LSFMイメージングと3D再構成により、tdトマトを発現する増殖するT. cruzi寄生虫(赤)を可視化することができました。赤チャンネルの自己蛍光レベルは、心臓...

本プロトコルは、無傷で除去された臓器および組織における増殖および休眠中の トリパノソーマクルジ 寄生虫およびT細胞を視覚化および正確に定量するためのライトシート蛍光顕微鏡法および自動化されたソフトウェア支援方法について説明しています。これらの手法は、治療結果を評価するための信頼できる方法を提供し、寄生虫と宿主の相互作用に関する新しい洞察を提供します。

無傷の清澄化臓器における トリパノソーマクルジ感染細胞、休眠中のアマスティゴート、およびT細胞の定量的3Dイメージング

Chagas disease is a neglected pathology that affects millions of people worldwide, mainly in Latin America. The Chagas disease agent, Trypanosoma cruzi ...

この技術は、透明な臓器全体のより完全な3D画像を提供し、複製だけでなく、休眠中の寄生虫細胞や免疫因子細胞の定量化にも役立ちました。この技術により、寄生虫、免疫細胞、および感染に起因する組織損傷の特別な関連を決定することができます。エピトープ免疫染色およびDNA標識もこの技術に匹敵した。このプロトコルは、シャーガス病のマウスモデルにおける治療転帰を評価するために効果的に使用されました。より高い個別用量の治療は、長期間の治療期間にわたってより少ない頻度で与えられ、複製および休眠中の寄生虫の両方を排除します。.手順を実演するのは、リック・タールトンの研究室の研究技術者であるカレブ・ホーキンスです。原稿に記載されているように感染したマウスの臓器を安楽死させ、解剖し、固定した後、個々の臓器を10ミリリットルの50%水で希釈したCUBIC-Lに浸し、光から保護された50ミリリットルの円錐管に室温で穏やかに振とうします。翌日、50%CUBIC-Lを10ミリリットルの100%CUBIC-Lに交換し、シェーカーインキュベーター上でチューブを平らに保ちながら、摂氏37度で6日間インキュベートします。この潜伏期間の終わりには、組織はほぼ完全に透明になるはずです。透明な臓器をPBSで2回、摂氏37度で2時間、穏やかに振とうします。洗浄するたびに、組織を新しい50ミリリットルの円錐形チューブに移してTriton X-100を取り外します。DNA染色の場合は、市販の核酸色素を5ミリリットルの染色バッファーで1:2, 500に希釈します。次に、核色素溶液を含む15ミリリットルの円錐管に組織を浸し、摂氏37度で、静置姿勢で5日間穏やかに回転させてインキュベートします。組織を15ミリリットルの3D核染色洗浄バッファーで室温で2時間、穏やかに振とうしながら3回洗浄します。一次抗体と二次抗体の必要量を計算します。一次抗体と二次抗体を琥珀色の2ミリリットルのチューブで混合し、摂氏37度で1.5時間インキュベートします。バッファー交換には、7.5ミリリットルの2x HV1 3D免疫染色バッファーを7.5ミリリットルの二重蒸留水と混合します。組織サンプルをバッファーに浸し、15ミリリットルの円錐管で水平位置に穏やかに振とうしながら、摂氏32度で1.5時間インキュベートします。バッファー交換培地から組織サンプルを採取し、抗体染色液に浸します。32°Cで1週間組織を個別にインキュベートし、光から離れた立った姿勢でチューブを静かに振ってください。組織サンプルを摂氏4度に移動し、立位でインキュベートします。HV1 3D免疫染色洗浄バッファーを摂氏4度に冷却した後、15ミリリットルのバッファーでサンプルを摂氏4度で30分間2回、それぞれ水平に穏やかに振とうしながら洗浄します。ホルマリンをHV1 3D免疫染色洗浄バッファーで1%に希釈し、穏やかに振とうしながら、サンプルを摂氏4度で24時間8ミリリットルの溶液に浸します。次に、サンプルを新鮮な1%ホルマリン溶液で摂氏37度で1時間インキュベートし、15ミリリットルのPBSで摂氏25度で2時間洗浄します。透明な臓器を、50ミリリットルの50%水で希釈したCUBIC-R +溶液を含む50ミリリットルの円錐管に室温で軽く振とうしながら浸します。5ミリリットルの100%CUBIC-R +と交換し、2日間穏やかに振とうしながらインキュベートします。キムワイプを使用して組織を乾燥させた後、6ウェル培養プレート内の5ミリリットルのマウント溶液に移し、室温でインキュベートします。ゲルスーパーグルーを使用して、組織を顕微鏡サンプルホルダーに接着します。120ミリリットルの封入液で満たされた顕微鏡石英キュベットにサンプルを浸します。それらを縦軸に対して横方向に画像化し、頂点と大動脈を水平に揃えて心臓を接着します。3D再構成されたトリパノソーマクルジ感染心臓は、心室と比較して、心房内の感染細胞の割合が高いことを示した。休眠中の寄生虫は、3D拡大インセットに示されているように、心臓で識別できます。ZsGreen1発現T細胞、ならびにトリパノソーマ・クルジ感染細胞を、トリパノソーマ・クルジに感染したCD8レポーターマウス由来の骨格筋において可視化した。3D再構成画像の3Dズームインにより、感染細胞の領域にあるT細胞が特定されました。宿主感染細胞におけるT細胞の界面を共焦点顕微鏡で可視化した。免疫不全マウスの心臓では、2つの異なる株のトリパノソーマクルジに感染した宿主細胞が検出され、組織をスライスすると、さまざまな組織の深さの心房に豊富な寄生虫感染細胞が見られました。トリパノソーマクルジに感染し、クリアされた心臓における血管系の免疫検出は、心臓の複雑な血管系を明らかにします。心臓心房に寄生虫感染細胞が認められた。骨格筋の核染色は、tdTomato寄生虫がほとんどまたは検出できない領域に核の蓄積を示しました。tdTomatoおよびGFP寄生虫レポーターマーカーをRFPおよびGFPに対する抗体でブーストし、骨格筋全体を透明にすると、強い蛍光が得られました。したがって、重要なポイントは、CUBICバッファーでのインキュベーション時間、DNA色素での希釈時間とインキュベーション時間、抗体でのインキュベーション時間、および屈折インデックスマッチング溶液でのインキュベーション時間です。特異的抗体色素と迅速な反応による追加の染色を使用すると、この技術の可能性が大幅に高まり、無傷の臓器の複数の細胞、プロセス、および構造の検出が可能になります。私たちは今、寄生虫を殺す原因となる免疫細胞、寄生虫が慢性的に存続する組織、および組織への特定の薬物の分布を探索するためのより良い、より完全な方法を持っています。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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学ぶ ライトシート蛍光顕微鏡法による無傷の清澄化臓器におけるトリパノソーマ・クルジ感染細胞と休眠アマスティゴート、T細胞の定量的3Dイメージング。マウスシャーガス病モデルでの治療効果評価と寄生虫・免疫細胞相互作用の可視化に応用できます。

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