Name: 水系抗生物質耐性菌の単離・同定と抗生物質耐性遺伝子の分子特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 学ぶ、水環境から抗生物質耐性菌を単離・同定し、耐性遺伝子を分子レベルで特性評価する手法。培養依存法とメタゲノム解析を組み合わせ、培養困難な細菌も含めた総合的な細菌叢と耐性遺伝子の解析が可能です。

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この作業は、ムンバイ大学の科学技術省-大学研究および科学的卓越性促進(DST-PURSE)スキームからの財政的助成金によって部分的に支援されました。Devika Ghadigaonkarは、このスキームの下でプロジェクトフェローとして働いていました。科学技術省科学技術研究委員会(DST-SERB)プロジェクト番号:CRG/2018/003624の上級研究員であるHarshali Shindeによる技術的支援が認められています。

1.サンプルの収集と処理
<ol><li>サンプル収集<ol><li>適切な量の水サンプルを滅菌サンプル容器に収集し、容器の3/4以下が満たされていることを確認します。</li>
		<li>採取後できるだけ早く無菌条件下でサンプルを実験室に輸送し、直ちに処理します。</li>
	</ol></li>
	<li>サンプル処理<ol><li>滅菌モスリン布で水サンプルを無菌ろ過し、粒子状物質を除去します。</li>
		<li>さらなる分析のために、ろ過水の適切な段階希釈を実行します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 総細菌量と抗生物質耐性菌数の推定
<ol><li>総細菌量の決定<ol><li>18.12 gのR2A寒天、改質粉末を1,000 mLの二重蒸留水に懸濁し、加熱して溶解します。溶解した混合物を121°C、15psiで20分間オートクレーブします。 R2A寒天培地を調製し、 適量のオートクレーブ処理された混合物を滅菌ペトリプレートに注ぐことにより、プレートを変更します(たとえば、約20 mLのオートクレーブ滅菌培地を90 mmの滅菌ペトリプレートに加えます)。</li>
		<li>ろ過水サンプルの適切な希釈液100 μLをR2A寒天培地上に均一に広げ、培地が固まったら修正プレート。実験を二重に実行します。</li>
		<li>上記のすべてのプレートを35〜37°Cで48時間インキュベートします(分離に使用する培地に応じて温度とインキュベーション時間を変えます)。</li>
		<li>式 (1) を使用して、ミリリットルあたりのコロニー形成単位 (CFU/mL) で総細菌負荷を表します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63934/63934eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)</li>
	</ol></li>
	<li>AR細菌数の決定<ol><li>手順 2.1.1-2.1.4 に従います。ただし、R2A寒天培地の代わりに、R2A寒天培地を使用し、セフォタキシム(3μg/mL)、シプロフロキサシン(0.5μg/mL)、エリスロマイシン(20μg/mL)、カナマイシン(15μg/mL)、およびバンコマイシン(3μg/mL)の5つの異なる抗生物質を個別に補充した改変プレートを使用する。</li>
		<li>手順2.2.1で述べたように、最終的な抗生物質濃度を達成するために、20 mLの滅菌溶融R2A寒天培地(溶融R2A寒天培地の温度、≤40°Cで修正)を含むチューブに抗生物質を別々に追加します。</li>
		<li>均一に混合するために渦巻き、寒天が固まる前に滅菌ペトリプレートに注ぎます。実験を二重に実行します。</li>
		<li>上記のすべてのプレートを35〜37°Cで48時間インキュベートします(異なる培地を使用する場合、温度とインキュベーション時間は異なる場合があります)。</li>
		<li>抗生物質の品質管理と有効性の確認のために、大腸菌ATCC 25922および黄色ブドウ球菌ATCC 29213株の細菌懸濁液100 μLをそれぞれの抗生物質含有R2A寒天培地、修飾プレートに広げます(接種に使用される新鮮な培養物の密度が600 nmでOD = 0.5であることを確認してください)。</li>
		<li>ステップ2.1.4で説明されているように、CFU / mLの観点から抗生物質耐性菌数を決定します。</li>
	</ol></li>
	<li>分離株のグリセロールストック<ol><li>形態学的に異なるARコロニーを選択します。</li>
		<li>単一の単離されたコロニーを、それぞれの抗生物質を含有する滅菌ルリア・ベルタニブロス2mLに懸濁する(例えば、コロニーがセフォタキシムを含有するプレートから選択される場合、ステップ2.3.1のコロニーを、それぞれの濃度のセフォタキシムを含有する滅菌ルリア・ベルタニブロスに接種する)。</li>
		<li>接種したチューブを37°C、80rpmでOD600 が0.5に達するまでインキュベートします。</li>
		<li>ステップ2.3.3の培養懸濁液750 μLを無菌条件下で滅菌100%グリセロール250 μLに混合することにより、分離株のグリセロールストックを調製します。</li>
		<li>グリセロールストックは、さらに分析されるまで-80°Cで保存してください。 注:グリセロールストックから培養物を復活させるには、グリセロールストックを4°Cで解凍します。 このストックを、それぞれの抗生物質を含む2 mLの滅菌ルリアベルターニブロスにループで接種し、増殖させます。.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 16S rRNA遺伝子シーケンシングによる培養可能菌の同定
<ol><li>PCR用の分離株からのDNAテンプレートの調製 注:細菌からの粗DNAの単離のためのPCR用のDNAテンプレートの調製について記載されているプロトコルは、Carlsonらによって与えられています10。<ol><li>滅菌つまようじを使用して、ペトリプレート上で成長している分離物の単一の分離された純粋なコロニーを取ります。細菌コロニーを滅菌マイクロ遠心チューブ内の滅菌二重蒸留水100 μLに懸濁し、10分間煮沸します。</li>
		<li>懸濁液を10,000 × g で2分間遠心分離して破片をペレット化し、上清を新しい滅菌マイクロ遠心チューブに移して粗DNAテンプレートとして使用します。</li>
	</ol></li>
	<li>16S rRNA遺伝子のV3領域の標的PCR増幅とシーケンシング<ol><li>表1に記載されているように、PCR増幅用のPCRチューブで40 μLの反応混合物を調製します。 注:DNA調製は、汚染の可能性を最小限に抑えながら、氷のブロックで実行する必要があります(試薬を取り扱うときは手袋を着用し、70%エタノールで作業面を完全に洗浄してください)。</li>
		<li>チューブをサーマルブロックに入れ、PCRサーマルサイクラーで適切なプログラムを実行します。標準化されたPCRサイクリング条件および16S rRNA遺伝子のV3領域の増幅のためのプライマー情報については 、表2 を参照されたい。</li>
		<li>アンプリコンの分解と可視化のために、アガロースゲル電気泳動(AGE)を実施してください。増幅PCR産物10 μLと6xゲルローディングバッファー2 μLを混合し(表3)、この混合物を10 mg/mLのエチジウムブロマイド(EtBr)を含む1.5 μLの1.5%アガロースゲル(100 mLの1x TAEバッファーに1.5 gのアガロース粉末を溶解[表3])のウェルにロードします。 注意: EtBrは強力な発がん性物質です。EtBrおよびEtBrを含むジェルを取り扱うときは、常に手袋を着用する必要があります。</li>
		<li>アンプリコンのサイズを推定するためのDNAラダーを追加します。</li>
		<li>80〜100 VのTAEタンクバッファー中でゲルの電気泳動を実行します。</li>
		<li>トラッキング色素がゲルの3/4を走ったら、電気泳動を停止し、UVトランスイルミネーターの下でアンプリコンバンドを可視化します。</li>
		<li>16S rRNA遺伝子シーケンシング用のPCR産物(アンプリコン)を使用して、分離株を特定します。</li>
		<li>アンプリコンを式(2)を用いた分光光度分析に供して定量する。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63934/63934eq02.jpg" style="margin: auto;">(2)</li>
		<li>DNAの純度を確認するには、A260 / A280の比率を計算します。 注: 理想的には、この数値は 1.5 より大きく、できれば 1.8 から 2.0 の間である必要があります。</li>
		<li>分離株を特定するには、適切なアライメント検索ツールを使用して、取得した配列を配列データベースと比較します。</li>
	</ol></li>
</ol>4.抗生物質感受性試験を用いた分離株中の抗生物質耐性の検出
注:このプロトコルは、椎間板拡散による抗生物質感受性試験(AST)の方法を説明しています。以下の抗生物質ディスクを使用した:セフォタキシム(5μg)、アンピシリン(10μg)、レボフロキサシン(5μg)、クロラムフェニコール(30μg)、チゲサイクリン(15μg)、セフトリアキソン(30μg)、イミペネム(10μg)、ゲンタマイシン(10μg)、ネオマイシン(10μg)、トリメトプリム(5μg)、およびシプロフロキサシン(5μg)。
<ol><li>ASTのための接種材料の調製<ol><li>Luria-Bertaniブロス(抗生物質なし)などの滅菌非選択培地2 mL中の滅菌ループを使用して、単一の単離精製ARコロニーを無菌的に接種し、37°Cで80rpmで一晩インキュベートします。</li>
		<li>100〜150 μLの一晩培養培養物(約OD600 = 1.8-2.0)を2 mLの新鮮な非選択的Luria-Bertaniブロス培地に取り、2〜4時間インキュベートします(OD600 が0.4〜0.5に達するまで)。</li>
		<li>培養液の密度が0.5マクファーランド標準(約OD600 = 0.1)に等しくなるように、滅菌0.85%生理食塩水を使用してこの新たに成長した培養懸濁液を希釈し、これはおよそ1〜2 ×10 8 細胞/ mLに相当します。</li>
		<li>均一な細胞分布のために細菌懸濁液を穏やかに混合する。</li>
		<li>上記の懸濁液は、希釈から15分以内に使用してください。.</li>
	</ol></li>
	<li>寒天プレートの接種<ol><li>1,000 mLの二重蒸留水にMHA38 gを混合してASTを行うためのミューラーヒントン寒天培地(MHA)プレートを準備し、加熱して溶解します。溶解した混合物を121°C、15psiで15分間オートクレーブします。</li>
		<li>プレート内のMHAの深さが4 mm(プレートあたり25 mLの培地)であることを確認します。</li>
		<li>同時に、抗生物質ディスクを冷凍庫から取り出し、室温まで温めます。 注意: 抗生物質ディスクは、最初に4°Cでディスクを解凍し、その後室温で解凍して徐々に解凍し、ディスク上の結露の潜在的な危険性を減らす必要があります。</li>
		<li>無菌条件下で、滅菌綿棒をステップ4.1で調製した接種材料に浸し、プレートの過剰接種を避けるために余分な懸濁液を取り除きます。</li>
		<li>MHAプレートの上部から始めて、端から端まで前後に培養液をプレートに均等に広げます。拭き取りながらプレートを60°回転させます。</li>
	</ol></li>
	<li>抗生物質ディスクの応用<ol><li>火炎滅菌された鉗子の助けを借りて、抗生物質ディスクを接種されたMHAプレートに無菌的に移し、ディスクを軽く押して寒天との完全な水平接触を確保します。 注:この手順は、プレート上の培養物の接種から15分以内に行わなければなりません。</li>
		<li>阻害ゾーンの重なりを避けるために、生物、使用する抗生物質、およびプレートのサイズを考慮して、適切な数の抗生物質ディスクを寒天プレートに配置します。 注意: 90mmの円形プレートに4〜5枚のディスクを収容できます。</li>
	</ol></li>
	<li>プレートのインキュベーション<ol><li>抗生物質ディスクの適用から15分以内に、プレートを反転させ、37°Cで一晩インキュベートします。</li>
	</ol></li>
	<li>結果の解釈<ol><li>ZOI の直径をミリメートル (mm) 単位で測定し、EUCAST11 で指定されたブレークポイント値に従って解釈します。以下の2つの例を参照してください。<ol><li>エンテロバクテラレスのシプロフロキサシン系抗生物質ディスク(5μg)のゾーン直径ブレークポイント(mm)はS ≥ 25およびR &lt; 22であり、これはZOIが25mm≥場合は感度(S)であると見なされ、ZOIが22mmの場合は耐性(R)である&lt;であることを意味します。ZOI直径が22〜25の場合、分離物は中間(I)と見なされます。</li>
			<li>ブドウ球菌属のクロラムフェニコール系抗生物質ディスク(30μg)のゾーン直径ブレークポイント(mm)はS ≥ 18およびR &lt; 18であり、ZOIが18 mmであれば感度がある≥、ZOIが18 mm&lt;場合は耐性があると考えられます。</li>
		</ol></li>
		<li>分離株が曝露される抗生物質の総数に対する分離株が耐性である抗生物質の数の比率を見つけることにより、複数の抗生物質耐性(MAR)指数を決定します。 注:品質管理のために、 大腸菌 ATCC 25922および S。 黄色ブドウ球菌 ATCC 29213は、ステップ4のようなプロトコルに従って参照株として使用されます。</li>
	</ol></li>
</ol>5. PCRによる分離株中の抗生物質耐性遺伝子の検出
<ol><li>分離株中のARGの同定には、標準的なPCRプロトコルを使用してください。ステップ3.1で与えられたプロトコルを使用してDNAテンプレートを準備します。 注:この研究で使用されたPCRサイクル条件は、94°Cで10分間、続いて94°Cで30秒間の35サイクル、適切な温度で30秒間のアニーリング(各プライマーセットで標準化)、72°Cで40秒間の伸長、および72°Cで5分間の最終延長でした。反応混合物を 表4に記載する。ARG、プライマー、およびアニーリング温度のリストを 表5に示します。</li>
	<li>アンプリコンの純度を分解、視覚化、および確認するには、手順3.2.3〜3.2.10に従います。</li>
</ol>6.細菌全体の多様性の同定とメタゲノム中のARGの検出のための全メタゲノムDNA分析
<ol><li>水サンプルからの全DNA(メタゲノム)の抽出<ol><li>ろ過された水サンプルからメタゲノムDNAを抽出します。 注:現在の研究では、メタゲノムDNA(総DNA)は、製造元のプロトコルに従って参照されたDNA分離キットを使用して、ろ過された水サンプルから抽出されました( 材料の表を参照)。</li>
		<li>抽出したメタゲノムDNA3 μLを0.8%アガロースゲルにロードしてDNAの品質を確認し、ゲルを80-110 Vで約30分間実行します。</li>
		<li>単一の無傷のバンドの存在を確認します。</li>
		<li>蛍光光度計を使用してDNA濃度を確認します。</li>
	</ol></li>
	<li>全メタゲノムDNAシーケンシングを用いた細菌多様性の決定とARGの検出<ol><li>ライブラリ調製とPCR増幅:<ol><li>参照されているDNAライブラリ調製キットを使用して、ペアエンドシーケンシングライブラリを調製します(材料表を参照)。</li>
			<li>200 ngのDNAを採取し、それを機械的に小さな断片にせん断した後、3'末端に「A」を追加するエンドリペアの連続ステップを行うことにより、アダプターライゲーション用のDNAを準備します。</li>
			<li>シーケンシングに使用するプラットフォームに応じて、DNA断片の両端に特定のアダプターをライゲーションします。 注:シーケンスのためにデュアルバーコードライブラリをフローセルにバインドするために重要なシーケンスは、これらのアダプターに存在します。これにより、アダプターライゲーションフラグメントのPCR増幅と標準シーケンシングプライマーの結合が可能になります。</li>
			<li>品質と量を確認するには、製造元の指示に従って、高感度DNAチップを使用して増幅ライブラリを分析します。</li>
		</ol></li>
		<li>クラスターの生成と順序付け:<ol><li>増幅されたライブラリを適切なシーケンシングプラットフォームにロードして、クラスター生成とその後のシーケンシングを行います。 注:ライブラリ分子は、ペアエンドフローセル上の相補的なアダプターオリゴに結合します。シーケンシング中、順鎖は、逆鎖の再合成後に選択的に切断される。次いで、このコピーされた逆鎖は、フラグメントの反対側の端部から配列決定される。</li>
		</ol></li>
		<li>バイオインフォマティクス解析:<ol><li>適切なプラットフォームを使用して、高品質のデータからスキャフォールドを生成します。</li>
			<li>これらの足場を、分類学的分類とARGの同定のためのバイオインフォマティクス分析にかけます。 注:細菌全体の多様性の同定とメタゲノム中のARGの検出のためのメタゲノムDNA分析全体のワークフローを 図1に示します。原稿に記載されている完全な方法論のフローシートを 図2に示します。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者は、開示する相反する利益を持っていません。

サンプルの収集と処理は重要な役割を果たし、研究の結果と解釈に影響を与える可能性があります。したがって、サンプルの変動性を排除するには、調査対象の淡水域の複数の場所でサンプリングを実行することが重要です。このようなサンプルを取り扱う際に適切な無菌環境条件を維持することで、汚染を防ぐことができます。さらに、抽出された核酸の質と量に影響を与える可能性のある細菌組成の変化を防ぐために、通過条件は4°Cに維持され、サンプル収集の時点からその後の処理までの時間経過を最小限に抑える必要があります。いくつかの研究は、サンプルの収集と処理の間のこの中間期間が、慎重に行われない場合、分析の後の段階でさまざまな結果をもたらす可能性があることを強調しています12,13。
めっきにさまざまな希釈液を使用することで、コロニーが凝集したり、コロニーが少なすぎて数えられないことが保証されます。ピペッティング/ハンドリングエラーによって発生する可能性のあるCFU/mLの変動を考慮するには、実験を重複...

薬剤耐性(AMR)は、最も差し迫った地球規模の問題の1つとして認識されています。AMRの急速な進化とその世界的な普及は、それに関連する医療費の観点から、人間の健康と世界経済にとって最大の脅威の1つです1。抗生物質の過剰使用と誤用は、ARの増加につながっています。これはCOVID-19のパンデミックによって強調されており、その間、多くの場合、影響を受けた患者のAMRにより、関連する二次感染症の治療が大幅に損なわれました2。人間による抗生物質の直接使用/誤用に加えて、農業および畜産における抗生物質の過剰使用および誤用、および水域を含む環境への不適切な排出が大きな懸念事項です3。細菌における新しい耐性形質と多剤耐性の台頭は、ARの開発とその普及につながる要因のより良い理解の必要性を緊急に浮き彫りにしています。プラスミドなどの移動性遺伝要素に複数のAR遺伝子(ARG)を運ぶことが多い複数の抗生物質耐性菌は、これらの耐性遺伝子を潜在的なヒト病原体を含む非耐性微生物に移す可能性があるため、最後の手段の抗生物質でさえ治療できないスーパーバグの出現につながります4。これらの複数の抗生物質耐性菌は、水生態系に存在する場合、魚、カニ、軟体動物などの汚染された水ベースの食品を消費することにより、人間の腸に直接侵入する可能性があります。以前の研究では、天然に存在する水系におけるAR細菌の拡散は、飲料水を含む他の水供給にも到達する可能性があり、したがって、人間の食物連鎖に入る可能性があることが示されています5,6,7。
本研究の目的は、培養ベースと非培養ベースの組み合わせを使用した包括的なプロトコルを提供することです(全メタゲノム分析)技術 完全な情報を取得する インドのムンバイの水域に存在する細菌の多様性とさまざまなARGの総プール。従来、培養ベースの技術は、水域における細菌の多様性を研究するために使用されてきた。培養可能な微生物は、どのニッチでも微生物叢全体のごく一部しか構成していないため、細菌の多様性の全体的な状態と、あらゆるサンプルに蔓延しているさまざまな耐性形質をよりよく理解するには、さまざまな培養ベースおよび培養に依存しない技術を並行して使用する必要があります。そのような堅牢で信頼性の高い培養に依存しない技術の1つは、全メタゲノムDNA分析です。このハイスループットメソッドは、細菌の多様性やさまざまなARGの機能アノテーションに関するさまざまな研究で成功裏に利用されています8,9。この手法は、メタゲノム(サンプル中の総遺伝物質)をさまざまな分析の出発材料として使用するため、培養に依存しません。本研究のプロトコルは、全メタゲノムDNA分析に使用して、水サンプル中の細菌全体の多様性とさまざまなARG(レジストーム)に関する情報を取得できます。

<table><tbody><tr><td>100 bp DNAラダー</td><td>Himedia</td><td>MBT049-50LN</td><td>アンプリコンのサイズ推定用</td></tr><tr><td>2x PCR Taq mastermix</td><td>HiMedia</td><td>MBT061-50R</td><td>PCR反応混合物を作るため</td></tr><tr><td>37 >Cインキュベータ</td><td>ーGS-192、ガヤトリサイエンティフィック</td><td>NA</td><td>細菌のインキュベーション用</td></tr><tr><td>6x ゲルローディングバッファー</td><td>HiMedia</td><td>ML015-1ML</td><td>DNAサンプルの重量を量り、電気泳動の進行を追跡するのに役立つローディングおよびトラッキング色素</td></tr><tr><td>アガロース粉末</td><td>Himedia</td><td>MB229-50G</td><td>アガロースゲル電気泳動(AGE)中のアンプリコンの分解用</td></tr> <tr><td>アンピシリン抗生物質ディスク</td><td>HiMedia</td><td>SD002</td><td>AST</td></tr><tr><td>オートクレーブ</td>エク<td>イトロン</td><td>NA</td><td>を行うため 培地、ガラス板、試験管などの滅菌に必要</td></tr><tr><td>バイオアナライザー2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>NA</td><td>増幅ライブラリの品質と量を確認するため</td></tr><tr><td>バイセーフティ B2キャビネット</td><td>インセット</td><td>インセット BSCクラスIIタイプB2</td><td>細菌培養、ASTなどの微生物学的作業に使用します。</td></tr><tr><td>セフォタキシム抗生物質ディスク</td><td>HiMedia</td><td>SD295E-5VL</td><td>AST実施用</td></tr><tr><td>セフォタキシム抗菌剤粉末</td><td>HiMedia</td><td>TC352-5G</td><td>抗生物質耐性菌の単離に必要な抗生物質原液の調製用</td></tr><tr><td>セフトリアキソン 抗生物質ディスク</td><td>HiMedia</td><td>SD065</td><td>AST</td></tr><tr><td>実施用 遠心分離機 Minispin Minispin</td><td>Eppendorf</td><td>Minispin Plus-5453</td><td>粗DNAの準備ができて残骸を餌にするのに使用</td></tr><tr><td>クロラムフェニコールの抗生物質ディスク</td><td>HiMedia</td><td>SD006-5x50DS</td><td>AST</td></tr><tr><td>を行うため シプロフロキサシンの抗生物質ディスク</td><td>HiMedia</td><td>SD060-5x50DS</td><td>AST</td></tr><tr><td>を行うため シプロフロキサシンの抗生物質の粉末</td><td>HiMedia</td><td>TC447-5G</td><td>薬剤耐性の分離の間に必要な抗生物質のストック溶液の調製のためバクテリア</td></tr><tr><td>比色計</td><td>Quest</td><td>NA</td><td>培養懸濁液のODチェック用</td></tr><tr><td>包括的抗生物質耐性データベース(CARD)データベース</td><td></td><td></td><td>ARGの機能アノテーション; https://card.mcmaster.ca/</td></tr> <tr><td>冷却シェーカーインキュベーター</td><td>BTL41 Allied Scientific</td><td>NA</td><td>バクテリア培養用培地プレートのインキュベーション用</td></tr><tr><td>ディープフリーザー (-40°C;C)&nbsp;</td><td>ハイアール</td><td>DW40L、ハイアールバイオメディカル</td><td>グリセロールストックの保管用</td></tr><tr><td>DNAライブラリ調製キット</td><td>NEB Illumina NA用ウルトラDNAライブラリ調製キット</td><td></td><td>ペアエンドシーケンシングライブラリ調製</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>HiMedia</td><td>GRM1195-100G</td><td>アガロースゲル電気泳動(AGE)用ゲルランニングバッファーの調製用</td></tr> <tr><td>電気泳動装置</td><td>TechResource</td><td>15 cmゲルキャスティングトレイ</td><td>アガロースゲルを作るため&nbsp;電気泳動の実施&nbsp;</td></tr><tr><td>電気泳動 電極付きパワーパック</td><td>Genei</td><td>NA</td><td>AGEの実行用&nbsp;</td></tr><tr><td>エリスロマイシン抗生物質ディスク</td><td>HiMedia</td><td>SD222-5VL</td><td>ASTを行うため</td></tr><tr><td>エリスロマイシン抗生物質粉末</td><td>HiMedia</td><td>CMS528-1G</td><td>抗生物質耐性菌の単離に必要な抗生物質原液の調製用</td></tr><tr><td>エリスロマイシン抗生物質粉末</td><td>HiMedia</td><td>TC024-5G</td><td>抗生物質耐性菌の単離に必要な抗生物質原液の調製用バクテリア</td></tr><tr><td>大腸菌ATCC 25922&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>HiMedia</td><td>0335X-1</td><td>ASTエ</td></tr><tr><td>チジウムブロマイド</td><td>HiMedia</td><td>MB071-1G</td><td>電気泳動後のDNAのインターカレート剤と</td></tr>可視化を行う際のコントロールとして使用 Gel Documentation System <tr><td>Fluorometer</td><td>Qubit 2.0</td><td>NA</td><td>抽出されたメタゲノムDNAの濃度測定用</td></tr><tr><td>Gel Documentation System</td><td>BioRad</td><td></td><td>電気泳動後のPCRアンプリコンの視覚化に使用</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン抗生物質ディスク</td><td>HiMedia</td><td>SD170-5x50DS</td><td>AST実行用</td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>HiMedia</td><td>AS119-500ML</td><td>アガロースゲル電気泳動用ゲルランニングバッファーの調製用 (AGE)</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>HiMedia</td><td>GRM1027-500ML</td><td>グリセロールストックを作るため</td></tr><tr><td>イミペネム抗生物質ディスク</td><td>HiMedia</td><td>SD073</td><td>AST実施用</td></tr><tr><td>Kaiju Database</td><td>NA</td><td>NA</td><td>リードの分類学的分類用 https://kaiju.binf.ku.dk/</td></tr> <tr><td>カナマイシン 抗生物質ディスク</td><td>HiMedia</td><td>SD017-5x50DS</td><td>AST実施用</td></tr><tr><td>カナマイシン 抗生物質粉末</td><td>HiMedia</td><td>MB105-5G</td><td>抗生物質耐性菌の単離に必要な抗生物質原液の調製用</td></tr><tr><td>レボフロキサシン抗生物質ディスク</td><td>HiMedia</td><td>SD216-5VL</td><td>ASTを実行するため</td></tr><tr><td>ルリア・ベルタニブロス</td><td>Himedia</td><td>M1245-500G</td><td>培養物の濃縮のために</td></tr><tr><td>マクファーランド規格</td><td>Himedia</td><td>R092-1No</td><td>培養懸濁液の密度を比較するため</td></tr><tr><td>分子生物学水</td><td>HiMedia</td><td>TCL018-500ML</td><td>PCR反応混合物</td></tr><tr><td>を作るためミューラー・ヒントン・アガー(MHA)&nbsp;</td><td>HiMedia</td><td>M173-500G</td><td>抗生物質感受性試験(AST)の実施用</td></tr><tr><td>ネオマイシン抗生物質ディスク</td><td>HiMedia</td><td>SD731-5x50DS</td><td>AST</td></tr><tr><td>PCRグラジエントの実施用 サーマルサイクラー</td><td>エッペンドルフ</td><td>マスターサイクラー ネクサスグラジエント 230V/50-60 Hz&nbsp;</td><td>16S rRNA領域およびさまざまな抗生物質耐性遺伝子の増幅のためのPCRの実施に使用されます</td></tr><tr><td>入門書&nbsp;</td><td>Xcelris</td><td>NA</td><td>PCR増幅用&nbsp;</td></tr><tr><td>R2A 寒天、改変</td><td>HiMedia</td><td>M1743</td><td>全細菌および抗生物質耐性(AR)細菌負荷の分離のための培地プレートの調製</td></tr><tr><td>用 足場生成</td><td>CLC Genomics Workbench 6.0</td><td>NA</td><td>足場の生成用</td></tr><tr><td>シーケンサー</td><td>Illumina プラットフォーム (2 x 150 bp 化学)</td> <td>NA</td><td>増幅ライブラリのシーケンシング</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム&nbsp;</td><td>HiMedia</td><td>TC046-500G</td><td>水サンプルを段階希釈するための0.85%生理食塩水の調製用</td></tr><tr><td>土壌DNA分離キット</td><td>Xcelgen</td><td>NA</td><td>ろ過された水サンプルから全メタゲノムDNAを抽出するため&nbsp;</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213</td><td>HiMedia</td><td>0365P</td><td>ASTタ</td></tr><tr><td>クソノミクス分類</td>を行う際のコントロールとして使用されます <td>Kaiju ioinformaticsツール</td><td>NA</td><td>門から属レベルまでの異なる分類群へのリードの分類用&nbsp;</td></tr><tr><td>包括的抗生物質耐性データベース(CARD)</td><td>NA</td><td></td><td>ARGの機能アノテーション用</td></tr><tr><td>チゲサイクリン抗生物質ディスク</td><td>HiMedia</td><td>SD278</td><td>AST</td></tr><tr><td>トリメトプリム抗生物質ディスク</td><td>HiMedia</td><td>SD039-5x50DS</td><td>AST</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>HiMedia</td><td>TC072-500G</td><td>アガロースゲル用ゲルランニングバッファーの調製用電気泳動(AGE)</td></tr><tr><td>バンコマイシン系抗生物質粉末</td><td>HiMedia</td><td>CMS217</td><td>抗生物質耐性菌の単離に必要な抗生物質原液の調製用</td></tr><tr><td>計量天秤</td><td>メトラー・トレド</td><td>ME204 メトラー・トレド</td><td>媒体粉末、試薬粉末などの計量に使用。</td></tr><tr><td>NA - 該当</td><td></td><td></td><td></td>なし</tr></tbody></table>

水系抗生物質耐性菌の単離・同定と抗生物質耐性遺伝子の分子特性評価

Isolation and Identification of Waterborne Antibiotic-Resistant Bacteria and Molecular Characterization of their Antibiotic Resistance Genes

淡水域に関連する微生物叢を介した抗生物質耐性(AR)の発生と拡散は、世界的な健康上の大きな懸念事項です。本研究では、淡水サンプルを収集し、従来の培養ベースの技術とハイスループット培養に依存しないメタゲノムアプローチの両方を使用して、細菌の多様性とAR遺伝子(ARG)全体に関して分析しました。この論文は、淡水サンプルから総および抗生物質耐性の培養可能な細菌を列挙し、培養可能な分離株の表現型および遺伝子型耐性を決定するための体系的なプロトコルを提示します。さらに、淡水サンプルから抽出された全メタゲノムDNAの全メタゲノム解析を使用して、非培養細菌を含む全体的な細菌の多様性を特定し、水域内のさまざまなARG(レジストーム)の総プールを同定したことを報告します。これらの詳細なプロトコルに従って、9.6 × 10 5-1.2 × 109 CFU / mLの範囲で高い抗生物質耐性菌負荷が観察されました。ほとんどの分離株は、セフォタキシム、アンピシリン、レボフロキサシン、クロラムフェニコール、セフトリアキソン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、トリメトプリム、シプロフロキサシンなどの複数の試験済み抗生物質に耐性があり、複数の抗生物質耐性(MAR)指数は≥0.2であり、分離株の耐性が高いことを示しています。16S rRNAシーケンシングにより、肺炎桿菌などの潜在的なヒト病原体、およびコマモナス属、ミクロコッカス属、アルスロバクター属、アエロモナス属などの日和見細菌が特定されました。 分離株の分子特性評価は、blaTEM、blaCTX-M(β-ラクタム)、aadA、aac(6')-Ib(アミノグリコシド)、およびdfr1(トリメトプリム)などのさまざまなARGの存在を示し、これもメタゲノムDNA分析全体で確認されました。抗生物質排出ポンプをコードする他のARGの高い有病率-mtrA、macB、mdtA、acrD、β-ラクタマーゼ-SMB-1、VIM-20、ccrA、ampC、blaZ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子catB10、およびリファンピシン耐性遺伝子rphB-もメタゲノムDNAで検出されました。この研究で議論されたプロトコルの助けを借りて、多様なAR表現型および遺伝子型形質を有する水系MAR細菌の存在を確認しました。したがって、全メタゲノムDNA分析は、水域の全体的なAR状態を決定するための従来の培養ベースの技術を補完する技術として使用できます。

総細菌量と抗生物質耐性(AR)細菌数 総細菌負荷の列挙は、水サンプルの10−4〜10−6倍希釈をR2A寒天培地上に広げることによって行った。AR細菌数の列挙のために、抗生物質を含む培地プレート上に10−3〜10−6倍希釈を広げました(図3)。総菌数とAR菌数をCFU/mLとして計算し、すべてのめっき実験を重複して実施した。上記のプロトコルに従って、本研究では、総細菌数が3.0 ×10 9 CFU / mLであることが示されました。AR細菌負荷は、9.6 × 10 5-1.2 ×10 9 CFU / mLの範囲で高いことがわかりました(表6)。
16S rRNA遺伝子シーケンシングによる培養可能細菌の同定 各単離物からの粗DNAを鋳型として使用し、16S rRN...

ここでは、水からの抗生物質耐性菌の分離と同定、およびそれらの抗生物質耐性遺伝子(ARG)の分子特性評価のための詳細なプロトコルを紹介します。培養ベースおよび非培養ベース(メタゲノム解析)技術の使用は、インドのムンバイからの淡水に存在する細菌の多様性全体とさまざまなARGの総プールに関する完全な情報を提供します。

The development and spread of antibiotic resistance (AR) through microbiota associated with freshwater bodies is a major global health concern. In the ...

私たちの方法は、水サンプル中の抗生物質耐性菌の全体的な負荷など、重要な質問に答えます。これらの細菌の正体は何ですか、そしてそれらが運んでいる抗生物質耐性形質と遺伝子の異なるタイプは何ですか?私たちのプロトコルの利点は、水サンプル中の全細菌のかなりの割合を占めるラボで増殖できない細菌でも検出できることです。したがって、理論的には、細菌またはその耐性形質は除外されません。培養ベースと培養に依存しない技術の両方を含むこの組み合わせ技術は、下水、製薬または病院の排水、臨床および非臨床環境などから得られたあらゆるサンプルに対して複製およびカスタマイズできます。デビカとともに、実験手順を実演するのは、私の研究室の上級研究員であるハルシャリ・シンデとマイトリ・ミシュラです。まず、水サンプルを滅菌モスリン布でろ過して無菌的に処理し、粒子状物質を除去します。次に、ろ過水サンプルを順次希釈して、さらに分析します。総細菌負荷量を決定するには、ろ過水サンプルの適切な希釈液100マイクロリットルを固化したR2A寒天プレートと複製物に置き、均等に広げます。すべてのサンプルスプレッドプレートを摂氏35〜37度で48時間インキュベートします。インキュベーション期間の後、コロニーを数え、ミリリットルあたりのコロニー形成単位で総細菌負荷を表します。抗生物質耐性菌数を決定するには、摂氏約40度で修飾された20ミリリットルの滅菌溶融R2A寒天を含むチューブに抗生物質を別々に追加します。渦巻いて均一に混合し、寒天が固まる前に滅菌ペトリプレートに注ぎます。品質管理と抗生物質の有効性を確認するために、R2A寒天修飾プレートを含むそれぞれの抗生物質に100マイクロリットルの細菌懸濁液を広げます。プレートを摂氏35〜37度で48時間インキュベートし、細菌数を決定します。PCR用の単離株からDNAテンプレートを調製するには、滅菌爪楊枝を使用して、ペトリプレート上で増殖する単離物の単離された純粋なコロニーを1つ採取します。細菌コロニーをマイクロ遠心チューブ内の滅菌二重蒸留水100マイクロリットルに懸濁し、沸騰水浴または乾浴中で摂氏100度で10分間煮沸する。懸濁液を10, 000 gで2分間遠心分離して破片をペレット化し、上清を新鮮な滅菌マイクロ遠心チューブに移して粗DNAテンプレートとして使用します。PCRにより16S rRNA遺伝子のV3領域を増幅するために、PCRチューブ中で40マイクロリットルの反応混合物を調製する。チューブをサーマルブロックに入れ、PCRサーマルサイクラーで適切なプログラムを実行します。PCRアンプリコンを分離および視覚化するには、10マイクロリットルの増幅PCR産物を2マイクロリットルの6xゲルローディングバッファーに混合し、この混合物を1.5%アガロースゲルのウェルにロードし、100塩基対DNAラダーを使用してアンプリコンのサイズを推定します。追跡色素がゲルの3/4になるまで、TAEタンクバッファー内のゲルを80〜100ボルトで電気泳動します。次に、UVトランスイルミネーターの下でアンプリコンバンドを視覚化します。接種材料を調製するには、抗生物質を含まない2ミリリットルのLuria-Bertani(LB)ブロスに滅菌ループを使用して、単一の単離された精製抗生物質耐性コロニーを無菌的に接種し、摂氏37度、80 rpmで一晩インキュベートします。翌日、100〜150マイクロリットルの一晩培養物を2ミリリットルの新鮮な非選択的LBブロスに加え、600ナノメートルでの光学密度が0.4〜0.5に達するまで2〜4時間インキュベートします。滅菌0.85%生理食塩水を使用して新たに成長した培養懸濁液を希釈し、穏やかに混合して細胞を均等に分散させ、0.5マクファーランド標準に相当する培養密度に到達します。希釈から15分以内に、滅菌綿棒を接種材料に浸し、プレートの過剰接種を避けるために余分な懸濁液を取り除きます。次に、準備したミューラーヒントン寒天プレートに、上から始めて端から端まで行ったり来たりして、培養物を均等に広げます。次に、プレートを60度回転させ、拭き取りを再開します。抗生物質ディスクを配置するには、火炎滅菌された鉗子を使用し、抗生物質ディスクを接種した寒天プレートに無菌的に移します。ディスクを軽く押して、寒天との完全なレベルの接触を確保します。阻害ゾーンが重ならないように、使用する抗生物質とプレートサイズを考慮して、適切な数の抗生物質ディスクを寒天プレートに配置します。抗生物質ディスク塗布から15分以内に、プレートを反転させ、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、阻害ゾーンの直径をミリメートル単位で測定し、EUCASTによって与えられたブレークポイント値に従って解釈します。水サンプル中の総細菌負荷は3.0 x 10〜9番目のCFU / mLであり、抗生物質耐性細菌負荷は高いことがわかりました。配列決定された抗生物質耐性培養分離株は、腸内細菌科に属し、ほとんどが大腸菌と肺炎桿菌でした。さらに、まれな日和見細菌も同定された。ディスク拡散法による抗生物質感受性試験では、8つの分離株で約0.2の複数の抗生物質耐性指数が示され、高い耐性が示されました。しかし、コマモナスとアルスロバクター種は、テストされた抗生物質のいずれに対しても耐性を示さなかった。培養可能な分離株は、ベータラクタム、トリメトプリム、およびアミノグリコシドに対する因子をコードする抗生物質耐性遺伝子の存在を明らかにしました。全細菌多様性のメタゲノムDNA分析により、50門が同定され、アルファプロテオバクテリア、ベータプロテオバクテリア、ガンマプロテオバクテリアのクラスからなるプロテオバクテリアが最も支配的な門である高い細菌多様性を示しました。注文レベルでは、バークホルデリアレスが最も一般的であり、ベータプロテオバクテリアクラスに属していました。一般的なレベルでは、シュードモナス、アシネトバクター、ペドバクター、プロステコバクター、リムノハビタン、フラボバクテリウム、およびコマモナスが豊富な細菌の一部でした。メタゲノムDNA分析はまた、より多くの抗生物質耐性遺伝子を明らかにしました。この方法では、エラーがあると総CFUと抗生物質耐性細菌負荷の誤った解釈につながる可能性があるため、段階希釈ステップが重要です。また、阻害ゾーンの直径を注意深く測定して、分離株が耐性か感度かを正しく解釈する必要があります。これらのプロトコルを使用して、水サンプルに加えて、環境、食品、臨床などの他のサンプルを研究することができます。さらに、細菌以外にも、あらゆる生態系の他の微生物集団も同様のアプローチを使用して研究することができます。

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環境

細菌性病原体診断のための簡単​​な一日のワークフロースキームの設計は、血流感染症の迅速な認識を可能にします。...

血液培養から細菌性病原体の検出および抗菌剤耐性テストのための一日のワークフロースキーム

出典: Ghadigaonkar、D.およびRath、A.水系抗生物質耐性菌の単離と同定、およびそれらの抗生物質耐性遺伝子の分子特性評価。 J. Vis. 経験。...

分子分析のための水サンプルからの抗生物質耐性菌の単離

溶菌ファージバイオセンサーと抗体ビーズメチシリン耐性（MRSA）と敏感ブドウ球菌の細菌を区別することができます。ファージを水晶振動子マイクロバランスセンサーの表面上にラングミュア·ブロジェット法で固定し、広範囲のブドウ球菌プローブとして働いていた。抗体ビーズはMRSAを認識しています。...

抗生物質耐性ブドウ球菌の細菌の検出のためのバイオセンサー

このプロトコルは、食品中のクラス1インテグロンとそれらに関連する遺伝子カセットの検出を説明しています。...

クラス1インテグロンおよび遺伝子カセットのための食品のスクリーニング

抗生物質の脱複製に対する同種抗生物質耐性エシェリヒア大腸菌のライブラリーを利用するプラットフォームについて述べる。細菌または真菌によって産生される抗生物質の同一性は、それぞれの耐性遺伝子を発現する大腸菌の増殖によって推定することができる。このプラットホームは経済的に有効で、時間効率が良い。...

抗生物質耐性プラットフォームを用いた抗生物質脱複製

蛍光タグ付き抗生物質は抗菌性の複数の側面を研究するために使用することができる強力なツールです。この記事では、蛍光タグ付き抗生物質の調製と細菌における抗生物質耐性を研究するアプリケーションについて説明します。プローブは、分光光度測定、フローサイトメトリー、顕微鏡法によって細菌耐性(例えば、流出)のメカニズムを研究するために使用することができる。...

蛍光系抗生物質プローブを用いた細菌耐性の可視化

原子間力顕微鏡-赤外線分光法(AFM-IR)は、細菌研究のための強力なプラットフォームを提供し、ナノスケールの分解能を達成することを可能にします。いずれも、細胞内変化(例えば、細胞分裂時)のマッピング、ならびに化学組成の比較研究(例えば、薬剤耐性から生じる)のマッピングは、細菌中の単一細胞レベルで行うことができる。...

単一細菌化学を探るツールとして赤外線分光法と組み合わせた原子間力顕微鏡

水生生物の生息地から炭化水素分解細菌を分離、増殖、および特性評価するプロセスを紹介します。このプロトコルは、細菌の分離、16S...

水生生物生息地からの炭化水素代謝特性を有する細菌種の単離・増殖・同定

ここでは、低分子量の細胞外DNAの割合を高めることにより、環境中の抗菌薬耐性(AMR)を評価する簡単な手法を紹介します。20%-30%のPEGと1.2 M...

抗菌薬耐性の包括的評価のための廃水からの低分子量DNAの抽出の強化 

野生動物は、一般的にさまざまな蠕虫に寄生されます。蠕虫には、主に "回虫" (線虫)、"トゲトゲミズ" (Acanthocephalans)、"吸虫" (吸虫)、"条虫" (条虫) の 4 種類があります。ここでは、脊椎動物から蠕虫を採取する方法と、蠕虫の保存方法と分類学的識別方法について説明します。...

野生生物からの蠕虫の収集と同定

学ぶ、水環境から抗生物質耐性菌を単離・同定し、耐性遺伝子を分子レベルで特性評価する手法。培養依存法とメタゲノム解析を組み合わせ、培養困難な細菌も含めた総合的な細菌叢と耐性遺伝子の解析が可能です。

水系抗生物質耐性菌の単離・同定と抗生物質耐性遺伝子の分子特性評価

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