Name: 骨類似体の生成のための細胞内懸濁液中のセラミック全方向性バイオプリンティング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 学ぶセラミック全方向性バイオプリンティングによる骨類似体の作製法。ゲルチン微粒子支持体内でカルシウムリン酸塩インクと生細胞を用い、複雑な骨構造を形成し、骨組織工学と再生医療への応用可能性を示す。

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著者らは、国立保健医療研究評議会(助成金番号GNT1111694およびGNT1141602)およびオーストラリア研究評議会(助成金番号FT180100417、FL150100060、およびCE14100036)に感謝したいと思います。著者らは、ニューサウスウェールズ大学の生物医学画像施設に感謝したいと思います。図は Biorender.com、Adobe Photoshop、Adobe Illustratorで作成され、有料サブスクリプションでエクスポートされています。

1. 骨墨加工
<ol><li>リン酸α-三カルシウムの合成<ol><li>リン酸水素カルシウム(CaHPO4)と炭酸カルシウム(CaCO3)粉末を3:2のCa:Pモル比で計量します。スパチュラを使用して、2つの粉末を完全に均質化します。</li>
		<li>リン酸水素カルシウム-炭酸カルシウム粉末混合物をジルコニアるつぼに、75%以下になるように加えます。 注意: 汚染を避けるために、新しいるつぼまたは以前に同じ材料を作るために使用したるつぼを使用してください。きれいにするには、100%エタノールですすぎ、完全に乾くまでヒュームフードで風乾してから、粉末を加えます。</li>
		<li>るつぼを炉に移します。5°C/分の速度で1,400°Cまで加熱し、3時間保持します。</li>
		<li>るつぼを炉から取り出して反応を急冷し、耐火物ブロックの上に置いておきます。取り扱う前に完全に冷ましてください。 注意: 適切な長さのるつぼトングを使用し、適切な熱保護を確保してください。</li>
		<li>乳鉢と乳棒を使用して、得られた顆粒の最大サイズが200μmになるようにα-TCPケーキを破って粉砕します。 注意: 正しい粒子サイズを確保するために、標準のステンレス鋼ふるいを使用してください。</li>
		<li>さらに遊星ミルを用いて顆粒を2段階で粉砕する。まず、3 mmのイットリア安定化ジルコニアボールを8:1のボール:粉末の重量比で添加し、次に100%エタノールを3:1のエタノール:粉末の重量比で添加します。蓋を固定し、180rpmで2時間粉砕します。</li>
		<li>懸濁液を収集し、洗浄に100%エタノールを使用してボールを分離します。</li>
		<li>懸濁液を120°Cのオーブンで24時間乾燥させる。</li>
		<li>乾燥粉末を、1 mmのジルコニアボールと100%エタノールを第1段階と同じ重量比でミリングジャーに加えます。2rpmで180時間粉砕し、分離して乾燥させます。 注 : 合成手順全体を 図 1A に示します。</li>
	</ol></li>
	<li>ボーンインクの配合<ol><li>骨インクを作るには、スパチュラで継続的に攪拌しながら、630μLのグリセロールと130μLのポリソルベート80を含むボールミルジャーに2gのα-TCP粉末を加えます。</li>
		<li>リン酸アンモニウム二塩基性((NH4)2HPO4、APD)100 mgを加え、攪拌して混ぜ合わせます。 注意: スパチュラに液相が過剰に残っていると、インク成分の比率が不均衡になり、したがって、硬化の動力学が発生します。</li>
		<li>25 mmのジルコニアボールを追加し、蓋を固定し、遊星ミル内に180 rpmで60分間置き、途中で一時停止してヘラでジャーの側面をこすり落とします。</li>
		<li>スパチュラを使用して、インクを1 mLシリンジに入れます。湿気との接触を避けるために適切に包んでください。すぐに使用しない場合は、-20°Cで保管してください。</li>
	</ol></li>
	<li>骨インクの微細構造特性評価<ol><li>骨インクを脱イオン水で印刷し、5分間設定します。</li>
		<li>サンプルを100%エタノールで3回洗浄し、完全に乾燥させます。</li>
		<li>金の薄層(厚さ15 nm)でコーティングします。</li>
		<li>加速電圧5kVで電界放出型走査電子顕微鏡を用いて顕微鏡写真を撮影する。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 印刷用ミクロゲル懸濁液の作製
<ol><li>ゲルマの合成 注:この手順は、10gと20gのゼラチンからなるバッチサイズでテストされています。この方法では、10 gを使用したバッチの測定の詳細を示します。<ol><li>ゼラチン10 gを計量し、90 mLのPBSを含む円錐フラスコに加えることにより、ゼラチンタイプA(ブタ、ブルーム強度300)の1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の10%w / w溶液を作ります。ゼラチンが完全に溶解するまで攪拌しながら50°Cに加熱する。</li>
		<li>5.796mLのメタクリル酸無水物を加える。円錐フラスコにゴム製のキャップを置き、暗所で50°Cで90分間攪拌を続けます。 注意: メタクリル酸無水物は、吸入または飲み込むと有毒であり、皮膚や目の刺激性です。.ヒュームフード内でのみ取り扱い、適切なPPEを使用してください。</li>
		<li>円錐フラスコの内容物をPBSで2倍に希釈して反応を消光します。</li>
		<li>50 mLチューブにデカントし、室温で3,000 × g で3分間遠心分離し、未反応のメタクリル酸無水物を除去します。</li>
		<li>14 kDaカットオフセルロース透析チューブ内の上清をイオン交換水に対して、穏やかに攪拌しながら40°Cで5日間透析します。脱イオン水を毎日交換してください。</li>
		<li>50 mLチューブにデカントし、キャップを固定し、冷蔵庫に12時間入れて、保管の準備をします。冷蔵庫で最大7日間保管してください。</li>
		<li>液体窒素を使用して凍結し、直ちに-54°Cおよび0.4mbarで5日間凍結乾燥します。 注意: 凍結するときは、チューブに含まれる液体が40mL以下であることを確認してください。凍結したら、ゴムバンドで固定された繊細なタスクワイプなどのガス交換が可能なカバーにキャップを交換します。</li>
		<li>得られた泡を、ミクロゲル懸濁液合成に必要になるまで-20°Cの冷凍庫に保管します。</li>
	</ol></li>
	<li>ゲルマミクロゲルの合成 注:ミクロゲルは、油中水型エマルジョン法13 を用いて合成される(図2)。この方法は、1〜10mLのGelMA溶液容量についてテストされています。同じプロトコルを使用して、スタンドアロンのボーンプリントを印刷するために使用されるゼラチンミクロゲルを合成できます。<ol><li>凍結乾燥されたGelMAを秤量し、PBSを含むチューブに加え、完全に水和するまで50°Cの水浴中で加熱することにより、PBS中の10%w/wGelMA溶液を作ります。</li>
		<li>ビーカーにGelMA溶液1 mLあたり37 mLのオイルを加え、65%以下になるようにします。</li>
		<li>大きなビーカーの中に油を含むビーカーを入れて、磁気攪拌しながらホットプレートにダブルビーカーシステムをセットアップします。 注意: 2つのビーカーのサイズは、壁の間のスペースに氷を簡単に落とすことができるようなサイズにする必要があります。セットアップを 図 2 に示します。</li>
		<li>攪拌しながら40°Cに加熱する。 注意: 渦が乱流ではなく、ビーカー内のオイルの高さの約1/3の深さであることを確認してください。</li>
		<li>GelMA溶液をシリンジに入れ、0.45 μmのフィルターを通して攪拌油に滴下します。エマルジョンを10分間平衡化させます。</li>
		<li>エマルジョンの温度を15°Cに下げて、2つのビーカーの間のスペースに砕いた氷を加えて球体を熱的に安定させます。</li>
		<li>アセトンに対して1:11のGelMA溶液の体積比で紡糸エマルジョンにアセトンを加える。 注意: エマルジョンを破壊しないように、漏斗を通してアセトンをそっと加えます。60分間攪拌します。</li>
		<li>ビーカーの内容物を50 mLチューブにデカントし、ビーカーの壁をアセトンで洗ってください。脱水したミクロゲルが底に落ち着くまで20分間放置します。</li>
		<li>上清を捨て、アセトンで少なくとも2回洗浄する。 注:上清は透明でなければなりません。</li>
		<li>1つのチューブに統合し、アセトンを補充し、10秒間超音波処理します。アセトンで2回洗浄します。</li>
		<li>印刷が必要になるまで室温でアセトンで保管してください。</li>
	</ol></li>
	<li>印刷用のGelMAミクロゲル懸濁液の準備<ol><li>凍結乾燥GelMAをチューブに計量し、DMEMを添加し、完全に水和するまで50°Cの水浴中で加熱することにより、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中のGelMAの1%w/w溶液を調製します。</li>
		<li>脱水ミクロゲルからアセトンを蒸発させ、得られた粉末をチューブに秤量する。アセトンを加えて無菌環境に移します。</li>
		<li>ミクロゲル懸濁液を形成するには、アセトンを蒸発させ、DMEM、DMEM中の1%w/wのGelMA溶液、および2.5%w/wのフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム(LAP)開始剤溶液を加えて、30%の最終充填率を達成します。室温で少なくとも12時間完全に水和させます。.冷蔵庫で最大7日間保管してください。使用前に室温まで上げてください。 注:これらの試薬の体積はミクロゲルの乾燥重量に基づいており、 表1の式を使用して計算できます。</li>
	</ol></li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>方程式</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>x =乾燥ミクロゲルの重量(mg)</td>
		</tr><tr><td>DMEM中の1%w/wゲルMAの体積、(μL)</td>
			<td>a = 21.93x</td>
		</tr><tr><td>DMEMの体積、b(μL)</td>
			<td>b = 8.773x</td>
		</tr><tr><td>2.5% w/w LAP溶液の体積, c (μL)</td>
			<td>c = 0.6267x</td>
		</tr><tr><td>生成したミクロゲル懸濁液の総量(μL)</td>
			<td>a + b + c</td>
		</tr></tbody></table>表1:GelMAミクロゲル懸濁液を水和させるのに必要な試薬の量を計算するための式。 略語:GelMA =ゼラチンメタクリレート;LAP = フェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63943/63943fig02.jpg"> 図2:ミクロゲル合成に用いる油エマルジョン法の概略図。ダブルビーカーのセットアップは、冷却を可能にするためにより大きなビーカーの内側に配置された攪拌(矢印で示されている)エマルジョンを含むビーカーを示しています。略称:GelMA=ゼラチンメタクリレート <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63943/63943fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
3.骨インクを細胞懸濁液に印刷する
注:ゼラチンベースのミクロゲルは、多くの異なる細胞タイプの接着をサポートしているため、このアプローチはミクロゲルマトリックス内の単一および複数の細胞に適しています。このプロトコルでは、筋骨格組織工学に一般的で堅牢な細胞タイプであるため、脂肪由来間葉系幹細胞(ADSC)を使用する手順について説明します。
<ol><li>10%ウシ胎児血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した低グルコースDMEM中でADSCを37°Cおよび5%CO2 でコンフルエントになるまで培養する。</li>
	<li>培地を除去し、滅菌PBSで洗浄し、37°Cおよび5%CO2 で0.25%トリプシンで3分間インキュベートすることにより、組織培養フラスコからADSCを剥離します。</li>
	<li>室温で5分間150 × g で遠心分離することにより、細胞をペレット化します。</li>
	<li>細胞を数え、GelMAミクロゲル1mLごとに5×105 細胞を計算します。必要量の細胞懸濁液を上記のように別のチューブとペレットに割り当てます。</li>
	<li>ピペットを使用してできるだけ多くの上清を慎重に取り除き、細胞ペレットのみを残します。必要量のミクロゲル懸濁液をペレットに加え、穏やかに吸引して細胞分布を均一にします。 注意: 懸濁液に過剰な気泡がある場合は、ゆっくりと遠心分離して除去し、上下にピペットでセルを再分配します。</li>
	<li>細胞を含んだミクロゲル懸濁液をピペットを使用して反応器にロードします。 注:本研究では、容量100μLの10mm x 10mm x 3mmの反応器を3Dプリントしました。</li>
	<li>23 Gの針を取り付けた1 mLシリンジを使用して骨インクを堆積させます。 メモ: これは、3Dプリンタで、1 mLシリンジから直接印刷できる押出システムを後付けするか、ボーンインクをプリンタの押出カートリッジに直接ロードすることによって実行できます(図3)。</li>
	<li>細胞および骨インクを含むGelMAミクロゲル構築物をUV架橋剤ランプ(405 nm)で90秒間架橋します。すぐに適切なサイズのウェルプレートに移し、完全なDMEMで覆います。 注:前述の3Dプリントされたリアクターは、24ウェル細胞培養プレート内に収まります。</li>
	<li>37°Cおよび5%CO2でインキュベートする。24時間後に培養液を交換した後、必要に応じて48〜72時間ごとに交換します。</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63943/63943fig03.jpg"> 図3:ミクロゲルの水和、細胞の取り込み、およびその後の細胞を含んだミクロゲル懸濁液へのボーンインクの印刷を示すCOBICS手順の概略図。略語:COBICS =細胞懸濁液中のセラミック全方向性バイオプリンティング;GelMA = ゼラチンメタクリレート。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63943/63943fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
4.細胞生存率と増殖評価
<ol><li>骨インクの細胞毒性を評価するには、細胞を含むCOBICSコンストラクトを完全な培地に保管してください。24時間、72時間、および120時間(または関連する時点)でLive Deadアッセイを実行します。</li>
	<li>各時点で、構築物をPBSで洗浄し、4 mMのカルセインと2 mMの臭化エチジウムを含むフェノールフリーDMEMの溶液を追加します。37°C、5%CO2で1時間インキュベートします。</li>
	<li>PBSで洗浄し、ガラス底皿に移し、共焦点顕微鏡で494/517 nmおよび528/617 nmのEx/Emスペクトルでイメージングします。</li>
</ol>

<ol><li>Bates, P., Ramachandran, M. Bone injury, healing and grafting. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBates%2C+P+%22Basic+Orthopaedic+Sciences.+The+Stanmore+Guide%22">Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide</a>. , CRC Press. Boca Raton, FL. 123-134 (2007).</li>
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</ol>

著者は、開示する利益相反がないことを宣言します。

3D印刷技術COBICSは、生細胞を含む架橋可能なミクロゲル懸濁液への押し出しによる石灰化骨様構造の製造を可能にするために開発されました。この技術は、分解性ミクロゲル懸濁液に適用されており、細胞は、系11内で良好な生存率、拡散性、および骨形成分化能を示す。この手法を使用して作成されたコンストラクトの成功の重要な決定要因は、α-TCPベースのボーンインクの適切な合成です。第一に、α-TCPの形成は、適切な温度制御に大きく依存しています。リン酸三カルシウムの正しい相を形成するためには、反応が相境界を越えてβ-TCP相場14に入る前に、1,400〜1,200°Cの範囲内で反応をクエンチすることが重要です。X線回折分析は、単相α-TCP組成を確認するために使用することができる。その後、すべてのボーンインク前駆体を正しい比率で混合することは、押出印刷、硬化時間、およびナノ微細構造形成に最適な流動特性を備えたボーンインクの形成に不可欠です。GelMAミクロゲル懸濁液は、光架橋を介して印刷された構造の「ロック」を可能にするため、前駆体材料の比率を調整して、...

骨は、内因性の治癒能力が損なわれる重大な欠陥サイズまで、正常な細胞組成、配向、および機械的強度を再現することによって治癒できる体内で数少ない構造の1つとして、顕著な再生能力を持っています1。骨は、軟骨や靭帯とともに、体の動きをサポートおよび促進すると同時に、ミネラルや脂肪を貯蔵し、血球を生成します。硬くて緻密な結合組織として、骨は主に無機相、水、およびコラーゲン線維を主成分とする有機材料で構成されています2。細胞は、コラーゲンI繊維とハイドロキシアパタイト(HA)結晶のこの高度にミネラル化されたマトリックス内に埋め込まれ、階層構造を形成します3。
この組織の複雑な構成は、不均一な骨のマイクロおよびナノ環境を再現するための合成代替物の製造を非常に困難にします3。この目的のために、バイオセラミックス、細胞を含んだヒドロゲル、合成材料など、さまざまな材料が骨マトリックスを作成するためのソリューションとして提案されています。足場製造技術の中で、3D印刷ベースの技術が最近登場し、患者固有の治療の大きな可能性を備えた高度に洗練された精密な構造の製造を可能にする優れた能力により、組織工学コミュニティから多くの注目を集めています4,5,6.ヒドロゲルは、細胞および生理活性分子と一緒に印刷して機能的構築物を生成することができるため、マトリックス模倣物およびバイオインクの最も一般的な選択肢である6。しかしながら、ヒドロゲルは、機械的強度および高度に石灰化された代謝活性細胞を含む無機相などの骨の機能的特性を欠いている。
3Dプリントされたセラミックスキャフォールドは通常、焼結、高温処理、またはin vitro または in vivo アプリケーションの前に徹底的に洗浄する必要がある過酷な化学物質の使用を含む後処理ステップを必要とします5。これらの制限に対処するために、Lodeら7 は最近、ハイドロキシアパタイトによって形成されたα-リン酸三カルシウムベースのペーストを開発し、生理学的条件下で印刷および設定することができます。ただし、この材料は、湿度の高い環境での後処理とそれに続く長期間の水溶液浸漬を必要とするため、生細胞と一緒に印刷することはできません。
あるいは、無機粒子が組み込まれた細胞を含んだヒドロゲルが、3D骨マトリックス8,9の代替物として提案されている。細胞の生存率をサポートする優れた能力にもかかわらず、高密度に石灰化した骨組織環境を再現することはできません。Thrivikarman et al.10は、ナノスケールのアパタイト堆積をよりよく模倣するために、過飽和カルシウムおよびリン酸媒体を非コラーゲン性タンパク質類似体と共に使用する生体模倣アプローチを採用した。しかし、それらの構造は、骨に似たミクロおよびマクロスケールのアーキテクチャを持つ剛性のある3D構造を生成することはできません。
本研究は、細胞と成長因子の両方を統合することができる無機相と有機相で骨模倣構造を製造するための印刷戦略の開発を通じて、これらの欠点に対処します11。COBICSは、ミクロゲルベースのバイオプリンティング技術を使用して、骨のミネラルおよび細胞構造を独自に再現します。本明細書のプロトコルは、セラミック骨インクおよびゼラチンベースのミクロゲルを合成し、次いでCOBICSを可能にする細胞を組み合わせるプロセスを記載する。このプロセスは、ボーンインクの主な前駆体材料の合成から始まります。次いで、架橋性ヒドロゲルを合成し、ミクロゲルに形成する。最後に、ボーンインクは、細胞を積んだミクロゲルの支持浴に全方向に堆積されます(図1)。
ボーンインクは、適切な降伏 - 応力特性、すなわち特定の剪断速度で流動化し、続いて堆積構造を支持する能力を有するミクロゲルの任意の懸濁液に印刷され得る。2つの柔軟なアプローチが実証されている:ゼラチンミクロゲルからなる懸濁液およびゼラチンメタクリレート(GelMA)ミクロゲルからなる懸濁液。前者の懸濁液は、温度が37°Cに上昇すると溶解し、懸濁ヒドロゲルの自由形状可逆包埋(FRESH)技術12であり、後者は印刷後に光架橋することができ、効果的に「ステッチ」して、印刷されたボーンインクを所定の位置にロックします。本研究では、複雑な骨模倣構造の in situ 印刷で細胞増殖をサポートできるという独自の利点を提供するため、GelMAをマトリックスとして使用することに焦点を当てています。最終的に、このアプローチにより、高レベルの生体模倣と疾患モデリング、創薬、再生工学に幅広い影響を与える複雑な組織モデルの生成が可能になります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63943/63943fig01.jpg"> 図1:ワークフローの概略図。 (A)骨インクは、α-リン酸三カルシウムの合成とそれに続くグリセロール、ポリソルベート80、リン酸二アンモニウムとの併用から開始して合成されます。(B)GelMAミクロゲルは、油中水型エマルジョン法により作製される。得られたミクロゲルは、次いで、(C)水和され、(D)細胞と結合される。次に、セル-ミクロゲル複合材料は、骨インクが堆積する粒状浴として使用されます。(E)次いで、構築物全体をUV架橋し、培養のためにインキュベーターに移す。略語:α-TCP =α-リン酸三カルシウム;GelMA=ゼラチンメタクリレート。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63943/63943fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>3Dプリンター押出機</td><td>Hyrel3D</td><td>EMO-25</td><td></td></tr><tr><td>50 mL遠心分離管</td><td>ファルコン</td><td>BDAA352070</td><td></td></tr><tr><td>無水エタノール 100%変性</td><td>化学供給</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>化学供給</td><td>154871</td><td></td></tr><tr><td>アルミナるつぼ</td><td>クアー</td><td></td><td></td></tr>ズ <tr><td>リン酸二塩基性アンモニウム (NaHPO4)</td><td>シグマ</td><td>A5764</td><td></td></tr><tr><td>Autodesk Fusion 360</td><td>オートデスク</td><td></td><td></td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット レベル 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>炭酸カルシウム</td> シ<td>グマ</td><td>239216</td><td></td></tr><tr><td>リン酸水素カルシウム (CaHPO4)</td><td>シグマ</td><td>C7263</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ</td><td>コーニング</td><td></td><td>さまざまな使用容量</td></tr><tr><td>セルロース透析チューブ、14 kDaカットオフ</td><td>シグマ</td><td>D9777遠心</td><td></td></tr><tr><td>分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離</td><td>機シグマ</td><td>3-16KL</td><td></td></tr><tr><td>分注チップ、23 G</td><td>ノードソン</td><td>7018302</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、低グルコース、ピルビン酸</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11885084</td><td></td></tr><tr><td>DPBS、カルシウム、マグネシウムサー</td><td>モフィッシャーなし</td><td></td><td></td>14190144</tr><tr><td>エレベーター炉</td><td>Labec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エンジン HR マルチヘッドプリンター</td><td>Hyrel3D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ボボゲン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゼラチンA型、豚皮から</td><td>シグマ</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>汎用ステンレス鋼 ヒント</td><td>ノードソンEF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマ</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>ヒト脂肪由来幹細胞</td><td>ATCC</td><td>PCS-500-011</td><td></td></tr><tr><td>LSM 800 共焦点顕微鏡</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>凍結乾燥機 (Alpha 1-4 LDplus)</td><td>Christ</td><td>101541</td><td></td></tr><tr><td>磁気ホットプレートと攪拌機</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>無水メタクリ</td><td></td>ル <td>Sigma 276685</td><td></td></tr><tr><td>Mini 2 デスクトップ 3D プリンター</td><td>LulzBot</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラフィルムシーリングフィルム</td>パラ<td>フィルム</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>遊星ボールミル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>遊星ボールミルジャー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートTween-80</td><td>シグマ</td><td>P6224</td><td></td></tr><tr><td>スキャン電子顕微鏡</td><td>FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>科学 Kimwipes デリケートなタスクワイパー</td><td>Kimtech</td><td>18813156</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼 標準試験ふるい</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ひまわり油</td><td>コミュニティ Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA 0.25% フェノールレッド</td><td>サーモフィッシャー</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>ZEN顕微鏡ソフトウェア</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>哺乳類細胞用生死生存率/細胞毒性キット </td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、低グルコース、フェノール不</td>使用 <td>Thermo Fisher</td><td>11054020</td><td></td></tr></tbody></table>

骨類似体の生成のための細胞内懸濁液中のセラミック全方向性バイオプリンティング

Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

構造的には、骨組織は、階層的で高度に石灰化されたマトリックス内に埋め込まれた代謝活性細胞を含む無機-有機複合体です。この組織は、骨の不均一な環境のために複製することは困難です。細胞懸濁液中のセラミック全方向性バイオプリンティング(COBICS)は、骨のミネラルおよび細胞構造を独自に複製するミクロゲルベースのバイオプリンティング技術である。COBICSは、骨模倣コンストラクトの積層造形における最大の課題の2つである犠牲サポート材料や過酷な後処理ステップ(放射線や高温焼結など)を必要とせずに、複雑で生物学的に関連するコンストラクトを印刷します。この技術は、ゼラチンベースのミクロゲル懸濁液内の新規リン酸カルシウムベースのインクの自由形状押出によって可能になります。懸濁液の降伏応力特性は、沈着を可能にし、印刷された骨構造を支持する。UV架橋とナノ沈殿は、それを所定の位置に「ロック」します。細胞を含んだ生体材料内にナノ構造の骨模倣セラミックを印刷する機能は、マクロおよびミクロアーキテクチャの時空間制御を提供し、臨床現場での複雑な骨構造のリアルタイム製造を容易にします。

COBICSは、骨模倣コンストラクトの積層造形における最大の課題の2つである犠牲サポート材料や過酷な後処理ステップ(放射線や高温焼結など)を必要とせずに、複雑で生物学的に関連するコンストラクトをプリントします。複雑な骨構造のCOBICS形成とミクロゲル懸濁液中の細胞のコプリンティングを実証するために、骨インクで作られた骨様複合材料の代表的な画像を撮影し、COBICにおけるADSC生存率を最大7日間半定量的に分析しました。 図4 は、非ニュートン流体として振る舞い、高せん断応力下で粘性流体のように流れ始める固体として応答するゼラチンミクロゲルからなる支持浴に骨インクを堆積させることによって、複雑な骨様構造を作製する能力を示しています。次いで、印刷された構築物を粘性浴から単離することができる(図4A、B)。
図4の骨模倣構造を実現するために使用されるプリンタは、カスタマイズさ...

このプロトコルは、ゼラチンベースの顆粒支持体にリン酸カルシウムインクを堆積させることによって骨様構造を作製する3D印刷技術を説明する。印刷された骨類似体は自由形態で寄託され、多相構築物用の生細胞マトリックス内で印刷物を直接採取したり架橋したりするための柔軟性を備えています。

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...

このプロトコルは、加熱または有毒化学物質を必要とせずに骨類似体の製造を可能にする。このようにして、患者自身の細胞を使用して臨床現場で骨欠損を修復する可能性のある骨構造が形成されます。この技術の主な利点は、骨インクを生細胞で印刷して、複雑な骨様構造を形成し、骨形成系統に分化させることができることです。さらに、薬物を骨インクに装填して、創傷治癒、骨再生を同時に増強し、癌などの病状を治療することができます。手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の候補者であるGagan Jalandhraと、この技術の開発を含むさまざまなプロジェクトで私とJalandhra博士と協力してきたSara Romanazzo博士です。リン酸水素カルシウムと炭酸カルシウム粉末の混合物をジルコニアるつぼに75%以下になるように添加することから始めます。るつぼを炉に移し、毎分5°Cの割合で1, 400°Cに加熱し、3時間保持します。るつぼを炉から取り出し、耐火物ブロックの上部に残して反応を急冷します。取り扱う前に完全に冷ましてください。乳鉢と乳棒を使用して、得られた顆粒の最大サイズが200マイクロメートルになるようにアルファリン酸三カルシウムケーキを破って粉砕します。粉砕混合物に3ミリメートルのイットリア安定化ジルコニアボールを加え、続いて100%エタノールを加えます。蓋をしっかり固定し、毎分180回転で2時間粉砕します。懸濁液を収集し、洗浄に100%エタノールを使用してボールを分離します。懸濁液を摂氏120度のオーブンで24時間乾燥させます。乾燥粉末を、1ミリメートルのジルコニアボールと100%エタノールを第1段階と同じ重量比で粉砕ジャーに加える。毎分180回転で2時間粉砕します。その後、分離してオーブンで乾かします。オーブンからサンプルを取り出します。骨インクを作るには、630マイクロリットルのグリセロールと130マイクロリットルのポリソルベート80をボールミルジャーに加えます。次に、100ミリグラムのリン酸二アンモニウムと2グラムのアルファ - リン酸三カルシウム粉末を溶液に加え、スパチュラで連続的に攪拌して混ぜ合わせます。25ミリメートルのジルコニアボールを追加し、蓋を固定し、毎分180回転で60分間遊星ミルの中に置き、ヘラを使用してヘラで瓶の側面をこすり落とすために途中で一時停止します。インクを1ミリリットルのシリンジに入れます。テキスト原稿に記載されているように、1X PBSでゼラチンタイプAの10%溶液を作ります。円錐形のフラスコをスターラーの上に置きます。次に、5.796ミリリットルの無水メタクリル酸塩を加え、摂氏50度の暗所で90分間攪拌を続けます。円錐フラスコ内容物をPBSで2倍に希釈して反応を消光する。50ミリリットルチューブにデカントし、室温で3分間、3000RCFで遠心分離することにより未反応のメタクリル酸無水物を除去し、上清を回収した。14キロダルトンカットオフセルロース透析チューブ内の上清を、穏やかに攪拌しながら、摂氏40度の脱イオン水に対して5日間透析します。脱イオン水を毎日交換してください。50ミリリットルのチューブにデカントし、キャップを固定して冷蔵庫に12時間入れて、保管の準備をします。次に、液体窒素を使用してサンプルを凍結し、すぐに摂氏マイナス54度、0.4ミリバールで5日間凍結乾燥します。得られた泡をマイナス20°Cの冷凍庫に保管します。GelMAミクロゲルを合成するには、凍結乾燥されたGelMAを秤量し、PBSを含むチューブに加え、完全に水和するまで摂氏50度の水浴中で加熱することにより、PBS中の10重量%のGelMA溶液を作ります。ビーカーにGelMA溶液1ミリリットルあたり37ミリリットルのオイルを加え、65%以下になるようにします。大きなビーカーの中に油を含むビーカーを入れて、磁気攪拌しながらホットプレートにダブルビーカーシステムをセットアップします。攪拌しながら摂氏40度に加熱する。GelMA溶液をシリンジに入れ、0.45マイクロメートルのフィルターを通して攪拌油に滴下します。エマルジョンを10分間平衡化させます。エマルジョンの温度を摂氏15度に下げて熱的にします。2つのビーカーの間のスペースに砕いた氷を追加して、球体を安定させます。紡糸GelMAエマルジョンにアセトンを加える。ビーカーの内容物を50ミリリットルのチューブにデカントし、ビーカーの壁をアセトンで洗ってください。脱水したマイクロゲルが底に沈殿するように20分間休ませます。上清を捨て、アセトンでミクロゲルを2回洗浄する。1本のチューブに統合し、アセトンを補充し、10秒間超音波処理します。繰り返しますが、アセトンで2回洗ってください。印刷が必要になるまで室温でアセトンで保管してください。印刷用のGelMAミクロゲル懸濁液を調製するために、テキスト原稿に記載されているようにDMEM中のGelMAの1重量%重量%溶液を処方する。脱水ミクロゲルからアセトンを蒸発させ、得られた粉末をチューブに秤量する。アセトンを加えて無菌環境に移します。ミクロゲル懸濁液を形成するには、バイオセーフティキャビネット内の粉末からアセトンを蒸発させます。蒸発後、DMEM、DMEM中の1%GelMA溶液、および2.5%LAP開始剤溶液を加えて、30%の最終充填率を達成し、室温で少なくとも12時間完全に水和させます。脂肪由来間葉系幹細胞を、10%FBSと1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した低グルコースDMEMで、摂氏37度と5%二酸化炭素でコンフルエントになるまで培養します。培地を除去し、滅菌PBSで洗浄することにより脂肪由来間葉系幹細胞を組織培養フラスコから取り出した。室温で150 RCFで5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。細胞を数え、GelMAミクロゲルのミリリットルごとに少なくとも5 x 10から5つの細胞を計算します。前に示したように、必要量の細胞懸濁液を別のチューブとペレットに割り当てます。ピペットを使用してできるだけ多くの上清を慎重に取り除き、細胞ペレットのみを残します。必要量のミクロゲル懸濁液をペレットに加え、ゆっくりと上下にピペットで動かして、均一な分布を確保します。細胞を含んだミクロゲル懸濁液をピペットを用いて反応器に装填する。23ゲージの針を取り付けた1ミリリットルのシリンジを使用して、骨インクを堆積させ、細胞を架橋し、骨インクを含むGelMAミクロゲル構築物をUV架橋剤ランプで405ナノメートルで90秒間架橋します。直ちにミクロゲル懸濁液を、完全なDMEMを含む適切なサイズのウェルプレートに移します。摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートします。24時間後に培養液を交換し、必要に応じて48〜72時間ごとに交換します。骨インクを走査型電子顕微鏡で分析して微細構造を決定し、インク硬化後にハイドロキシアパタイト結晶の形成を示し、特に乾燥状態で可視でした。この研究では、細胞をGelMAミクロゲルと混合し、マイクロゲル懸濁液のみまたはCOBICSシステムのいずれかで最大5日間培養しました。細胞は、1日目と5日目の両方で骨インクの存在下で良好な生存率を示し、インクの浸出生成物が細胞に有害ではないことを確認しました。微妙な変化がサイズの違いを引き起こす可能性があるため、ミクロゲルを合成しながら攪拌速度を制御することが重要です。ミクロゲル懸濁液内の細胞の均一な分布を確保することも重要です。同じプロトコルを使用して、犠牲支持体として機能し、独立した骨構築物を残すゼラチンミクロゲル懸濁液の内部に印刷することができます。しかし、GelMAを使用すると、骨軟骨や骨腱の界面などのワンポット多相構造への道が開かれます。

ceramic-omnidirectional-bioprinting-cell-laden-suspensions-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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学ぶセラミック全方向性バイオプリンティングによる骨類似体の作製法。ゲルチン微粒子支持体内でカルシウムリン酸塩インクと生細胞を用い、複雑な骨構造を形成し、骨組織工学と再生医療への応用可能性を示す。

骨類似体の生成のための細胞内懸濁液中のセラミック全方向性バイオプリンティング

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